DB36_T 885-2015 南方水稻黑条矮缩病毒RT-PCR检测技术规范(江西省).pdf

TCS 67.060 B22 DB36 江西省山巳ET且，万标准DB 36/T 885-2015 南方水稻黑条矮缩病毒RT-PCR检测技术规范Rule ofRT-PCR Detection on Southern Rice Black-streaked DwarfVirus 2015-12-21发布2016-03-15实施江西省质量技术监督局发布D836/T 885-2015 目次前言.11 I 范围.1 2 术语和定义.1 3 样品采集.1 4 样品处理.2 5 总RNA提取.2 6 RT-PCR.2 7 琼脂糖凝胶电泳.2 8 凝胶成像分析.2 附录A(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病病原.3 附录B(规范性附录)TRlzol 法提取总RNA技术流程.4 附录C(规范性附录)SRBSDV标准样品RT-PCR电泳图.5 DB36/T 885-2015 目IJ1=1 本标准按照四月1.1-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业厅提出井归口。本标准起草单位:江西省农业科学院植物保护研究所、江西农业大学农学院。本标准主要起草人:杨迎青、兰波、李湘民、崔汝强、孙晓棠、魏洪义、蒋军喜、陈洪凡、王广利、熊艳。II D836/T 885-2015 南方水稻黑条矮缩病毒RT-PCR检测技术规范1 范围本标准规定了南方水稻黑条矮缩病毒CSouthernrice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的样品采集、样品处理、总RNA提取、RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析。本标准适用于水稻草走似病株及白背飞虱样品对SRBSDV的RT-PCR检测O2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准O2.1 引物primer 指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核昔酸链进行延伸的出发点而起作用的多核昔酸链。2.2 2.3 2.4 退火温度anneal ing temperature 为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分于时的温度。反转录PCRreverse transcription PCR(RT-PCR)指一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增C琼脂糖;疑胶电j永agarose gel electrophoresis 指用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。3 样品采集3.1 水稻疑似病株样品采集田间将疑似病株连根拔起，用吸水纸包住根部，整株带回实验室，保存于40C冰箱、备用。3.2 灯下自背飞虱样品采集收集测报汀下的白背飞虱，保存于40C冰箱、备用。3.3 田间自背飞虱样品采集DB36/T 885-2015 在发病田块采用盘拍法采集白背飞虱样品，4C冰箱保存、备用。4 样品处理4.1 疑似病株样品处理取疑似病株叶片组织100吨，置于研钵中，加液氮研磨至粉末:犬。4.2 臼背飞虱样品处理取单头自背飞虱，置于2mL离心管中，用牙签捣碎成匀浆。5 总RNA提取用TRlzo1试剂或试剂盒提取疑似水稻病株及臼背飞虱样品的总RNA，TRlzo1法提取流程详见附录B，试剂盒提取方法按照相应说明书进行。6 RT-PCR 以实验室保存的标准SRBSDV总RNA为阳性对照，以健康水稻叶片总RNA为阴性对照，采用特异性号|物S10-oFC5-CGCGTCATCTCAAACTACAG-3)和S10-oR吁一TTTGTCAGCATCT AAAGCGC-3)对待测样品进行检测。反应在15L体系中进行，各组分如下2X 1 Step Buffer 5L、PrimeScript1 Step Enzyme Mix 0.4L、上下游s10-of/s10-oR各lL、TotalRNA模板l队，加RNaseFree ddH，O至15L扩增程序500C反应30min;94C预变性3mi曰94C变性30s,52C退火30s,72C延伸1mi口，30个循环72C延伸10min 7 琼脂糖J疑胶电泳取扩增样品5L，加入1L6倍上样缓冲液C6xloadi丑gbuffer)，混匀，点样子l.0%的琼脂糖i疑胶(含O.05L/ml EB或Go1dview)上样孔中，用O.5xTBE缓冲液在5V/cm8 V/cm电压条件下电泳30 mi 口。8，疑胶成像分析将琼脂糖凝胶从电泳槽中取出，置于凝胶成像系统下观察、拍照。并参照阳性对照条带大小，确定待测样品是否携带SRBSDVo2 D836/T 885-2015 附录A(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病病原南方水稻黑条矮缩病于2001年在我国广东省阳江市首次发现，其症状类似水稻黑条矮缩病，田间调查及室内传毒实验表明，自背飞虱(Sogatel1afurcifera)是该病毒的主要传毒介体。根据该病原病毒粒体形态、所致水稻细胞病理学特征、自然寄主范围、传毒昆虫种类及其传毒特性、病毒基因组特性及电泳图谱、病毒基因组S9及S10序列认为该病毒应为呼肠子瓜病毒科(Reoviridae)斐济病毒属CFijivirus)第2组的一个新种，并暂定名为南方水稻黑条矮缩病毒CSouthernrice b1ack-streaked dwarf virus,SRBSDV)。3 DB36/T 885-2015 附录B(规范性附录)TRlzol法提取总RNA技术流程B.1 取疑似病株组织100吨，置于研钵中，加液氮研磨至粉末状。或取单头自背飞虱，置于2mL 离心管中，用牙签捣碎成匀浆。B.2 处理后的样品置于2mL离心管中，加入1mL TRlzol充分匀浆，室温静置5mino B.3 如样品中含有较多杂质，20C-80C,12,000 r/m离心5min-10 min，用移液器吸取上清，转到一个新的2mL离心管中(可选步骤)B.4 加入0.2mL氯仿，剧烈振荡155-30 5，静置2min-3 min。B.5 40C,12,000 r/m离心15min。样品分为三层:底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRlzol试剂的60%。B.6 小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5mL EP营中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10mi n。B.7 40C,12,000 r/m离心10mi n。离心前看不出RNA沉淀，离心后在营侧和管底出现胶状沉淀。B.8 弃上清，于沉淀中加入75%乙醇(40C冰箱预冷)1 mL,40C,7,500 r/m离，心5min，小心吸取弃去上清。B.9 室温放置5min-10 min，充分干燥RNA沉淀。B.10 加入适量(50L-100L)DEPC(Rna5e Free)H20溶解RNA(65oc1J溶10min-15 min)。B.11 取2L进行电泳，其余-800C保存。4 2000 1000 750 500 250 100 附录G(规范性附录)SRBSDV标准样品RT-PCR电泳图注M:DL2000 DNA Mal、ker:1-2:SRBSDV标准样品3-4:健康稻株样品。DB36/T 885-2015 5