DB36_T 410-2003 猪尿中克伦特罗检测方法－酶联免疫吸附测定法(江西省).pdf

备案号13616-2003DB36 江西省也ETJ 方标准DB36/T 410-2003 猪尿中克伦特罗检测方法-酶联免疫吸附测定法2003-05-19发布2003-05-19实施江西省质量技术监督局发布DB36/T 410-2003 目录目U言.l范围.1 2测定力法l 3制样.1 DB36/T 410-2003 目IJ1=1 克伦特罗为肾上腺素受体激动药，是一种用于人治疗哮喘、支气管痊孪的药物。研究发现在饲料巾添加克伦特罗可促进动物生长、提高瘦肉率，特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例，猪饲用后生长速度快、体型好、且瘦肉多、脂肪少，被当作瘦肉精而成为一些饲料生产企业和养猪户的秘密武器。但是克伦特罗进入猪体内后，主要分布在肝等内脏器官、在体内代谢的时间较长，容易造成药物在组织巾残留，给消费者带来危害:健康的人在食用一定量的残留有克伦特罗的猪肉或内脏后，可能出现肌肉震颤、心慌、战栗、恶心、代谢紊乱、呼吸急促、烦躁不安等症状。由于克伦特罗的性质稳定，能够在猪尿巾以原形排出。因此制订猪尿巾克伦特罗的检测方法，以监测瘦肉精的使用，显得非常重要。竞争酶标免疫法是非市有效的筛选方法，可定量测定尿、肌肉、肝脏及牛眼中的克伦特罗。此法快速简便、经济实用，较易掌握推广。本标准由江西省农业厅提山。本标准由江西省兽药饲料监察所负责起草。本标准起草人:刘安南、陈文云、万文根、徐国茂。DB36/T 410-2003 猪尿中克伦特罗检测方法-酶联免疫吸附测定法1 范围本标准规定了析尿中克伦特罗检验的制样和酌联免疫吸附测定力法。本标准适用于挤尿中克伦特罗的残留常规快边筛选及定量检测O2 测定方法2.1 原理与方法测定的基础是抗原抗体反应。由往联板包租!有克伦特罗特异性抗体的抗体，加入抗克伦特罗的特异性抗体，附者结合被固定。标样或试样中克伦特罗Lj酌(辣根过氧化物酌)标记抗原竞争抗克伦特罗的特异性抗体。通过洗涤以除去没有Lj抗克伦特罗的特异性抗体结合的酌标记抗鼠。加入酌王在质(过氧化尿素)和发色剂(四甲基联苯肢)结合到酌联板上的酌标记物将兀色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后便颜色由监色转变为黄色。在450nm处测定吸光度值。吸光度值Lj样品中的克伦特罗浓度成反比。2.2 试剂、用途及仪器、设备竞争酶标免疫1:t试剂盒可用于定量测定尿、肌肉、肝脏等巾的克伦特罗。试剂盒巾包括了所有检测用的试剂，在使用前，请详细阅读试剂盒说明书。定量分析须用微孔板酶标仪(450nm)进行测量。2.2.1 克伦特罗系列标准溶液(Ong/L,100ng/L,300ng/L,900ng/L,2700ng/L,8100ng/L)2.2.2 酶标板2.2.3 抗克伦特罗的特异性抗体2.2.4 酶标记抗国2.2.5 缓冲洛液2.2.6 酶基质/发色剂2.2.7 反应停止液(1mol/LH2S04)2.2.8 做手L板酶标仪(450nm)2.2.9 离心机2.2.10 微刑振荡器2.2.11 微量加样器(201，501，1001，2001，2501)3 制样3.1 样品的制备取适量新鲜或冷冻空白或供试尿液，如尿样浑浊，则必须2000g离心10mi口，取上请液留用。3.2 样品的保存-200C冰箱中贮存备用。3.3 测定测定之前将所有试剂回升至室温200C240C，取解冻后的供试样品，2000g离心10min，取上;青液，作为供试液。3.3.1 测定程序(室温200C240C条件下操作)(1)将是够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。DB36/T 410-2003(2)加入100l1稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部在室温孵育15mino(3)11J出孔中的液体，将微孔架倒置;在吸水纸上拍打(每行拍打3次)，以以保证完全除去孔中的液体，用250l蒸t田水充入孔中，再次但iJt卓微孔中液体，重复操作两遍以上。(4)精密|吸取20l1标准溶液及处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。(5)加入100l稀释的酶标记物到微孔底部，在微型震荡器上嗣匀，室温孵育30mi丑。(6)重复步骤(3)。(7)加入100l基质/发色剂到微孔中，在微量振荡器上充分泪匀(或小心地在平面上转动酶标板以充分E合)，并在室温暗处孵育15mi口。(8)加入100l1反应停止液到微孔巾，昆匀。在60min内450nm处以空气为空白测定吸光度值。3.3.2 结果判定和表述接下式计算百分眼光度值:百分吸光度值=B侣。X100%式中:B一为标准溶液或供试样品的平均吸光度恒:Bo 为苓标准的标准溶液平均吸光度值:以X轴为标准溶液中克伦特罗浓度(ng/U的白然对数，y轴为百分吸光度缸，在半对数坐标纸上绘制标准曲线罔。从标准曲线上杏出供试样品中克伦特罗的浓度(ng/L)。也可以用专业计算机软件求出供试样品中克伦特罗的浓度。检测结果小于1000吨/L时判为未检山，大于或等T1000ng/L时判为可疑，需要复检后再确定。复检后小于或等于1000吨/L为未检山，大于1000吨/L为阳性。尿液稀释系数为102