基于代谢组学技术分析枸杞愈伤组织抗氧化活性成分差异.pdf

天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1495-1504基于代谢组学技术分析枸杞愈伤组织抗氧化活性成分差异曾晓倩,周笑如,刘春环,刘江南大学化学与材料工程学院合成与生物胶体教育部重点实验室，无锡2 1412 2摘要：采用非靶向代谢组学技术,探究不同植物生长调节剂组合对枸杞愈伤组织抗氧化活性成分富集的影响。以枸杞无菌苗茎段为外植体，分别以0.2 5mg/L1-萘乙酸+0.12 5mg/L6-苄氨基嘌呤（NB）和0.2 5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸+0.12 5mg/L激动素（DK)为植物生长调节剂进行愈伤组织培养,以DPPH自由基清除法检测不同愈伤组织的抗氧化活性,在相同浓度下NB抗氧化活性是DK的1.9倍。基于UHPLC-Q-TOF-MS的代谢组学技术对两组样品进行代谢物分析,共鉴定出7 52 种代谢物,其中55种的相对含量存在显著差异,主要为氨基酸类和糖类;KEGG分析发现差异代谢通路主要为ABC转运蛋白通路。ABC转运蛋白的功能差异可能是导致枸杞愈伤组织抗氧化活性差异显著的主要原因。关键词：枸杞；愈伤组织；抗氧化；代谢组学；差异代谢物中图分类号:R282.6;R914.4D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.9.004Metabolomics-based analysis on the differences in antioxidantcomponents from callus of Lycium barbarum L.ZENG Xiao-qian,ZHOU Xiao-ru,LIU Chun-huan,LIU Xue ,YANG ChengKey Laboratory of Synthetic and Biological Colloids,Ministry of Education,School ofChemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,ChinaAbstract:The effects of different plant growth regulator combinations on the enrichment of antioxidant components in Lyciumbarbarum L.callus were investigated by non-targeted metabolomics technique.The sterile stem segments of L.barbarum wasused as explant,and 0.25 mg/L naphthylacetic acid+0.125 mg/L 6-benzylaminopurine(NB)or 0.25 mg/L 2,4-dichloro-phenoxyacetic acid+0.125 mg/L kinetin(DK)were used as plant growth regulators for callus culture.The antioxidant ac-tivity of different callus was detected by DPPH free radical scavenging method.The antioxidant activity of NB was 1.9 timesthat of DK at the same concentration.Based on the metabolomics technology of UHPLC-Q-TOF-MS,a total of 752 metaboliteswere identified in two groups of samples,of which 55 had significant differences in relative content,mainly amino acids andcarbohydrates;KEGG analysis revealed that the differential metabolic pathway was mainly the ABC transporter pathway.Thefunctional difference of ABC transporters may be the main reason for the significant difference in antioxidant activity of L.bar-barum callus.Key words:Lycium barbarum L.;callus;antioxidant;metabolomics;differential metabolites宁夏枸杞（Lycium barbarumL.），茄科枸杞属植物，是被载人2 0 2 0 年版中华人民共和国药典（后文简称中国药典）的中国传统药用植物 ，因其富含多酚、生物碱等活性物质，抑菌抗炎等效果良好2 ,食用与药用价值高，被我国食药监局列入首批药食同源目录，在国内外保健品商品市场中备受收稿日期：2 0 2 3-0 2-17接受日期：2 0 2 3-0 5-2 9基金项目：江苏省自然科学基金青年项目（BK20221069）*通信作者 Tel:[phone];E-mail:xueliu 学*,杨成文献标识码：A文章编号：10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)9-1495-10青。由于温度、湿度等气象因子对枸杞品质的影响3,宁夏、青海等省一直是枸杞主产区，但传统农业生产生长周期长、人工调控难等问题仍突出,植物组织培养技术为这一难题提供了解决方案。植物组织培养是一种在无菌及人工控制的条件下,使离体的植物器官、细胞等在适宜的培养基上再生细胞或成为完整植物的技术4，愈伤组织就是离体的植物器官较易诱导出的一种呈无定形状态的薄壁细胞。而根据植物细胞的全能性,枸杞愈伤组织1496与天然枸杞植株具有相同的遗传信息，其化学成分与生物活性也将具有高度相似性。且与传统农业种植相比,通过植物组织培养技术诱导枸杞愈伤组织的条件更可控,愈伤组织生长周期较人工种植的枸杞也更短,因此通过植物组织培养诱导枸杞愈伤组织拓宽了枸杞资源的获取途径，利于满足枸杞市场与日增长的需求。代谢组学是研究生命体中分子质量在150 0 Da以内的代谢物种类、数量及其变化规律的科学,在黄芪、人参等5 药食两用的天然植物的成分分析中应用广泛,但目前对枸杞的成分分析仍局限于自然条件下生长的枸杞果实、花、叶等6 。本研究从枸杞种子出发建立了稳定的枸杞愈伤组织培养体系，比较不同植物生长调节剂组合诱导出的愈伤组织抗氧化活性并对其进行代谢组学检测，分析愈伤组织物质组成与代谢途径，探究枸杞愈伤组织抗氧化活性代谢物来源，为枸杞资源深人开发与多元化应用提供参考。1材料与方法1.1i试剂与仪器宁夏枸杞干燥果实,产自宁夏银川,购于百瑞源枸杞股份有限公司。Murashige and Skoog培养基（MS）（青岛海博生物技术有限公司，批号：2 0 2 2 0 30 7,纯度：BR）；2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）（批号：B2222178,纯度：97%）、1-萘乙酸（NAA）（批号：12 0 0 8 0 6 8，纯度：96%）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（批号：1192 4138，纯度：98%）、6-苄氨基嘌岭（6-BA）（批号：I2104107，纯度：99%）、激动素（KT）（批号：I2023136，纯度：99%）（均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。OSE-Y50组织研磨器（北京天根生化科技有限公司）；TripleTOF6600质谱仪（美国爱博才思公司）;12 90 InfinityLC超高压液相色谱仪（美国安捷伦公司）;ACQUITY UPLC BEHCis色谱柱(1.7 m,2.1 mm100 mm,美国沃特世公司）。1.2实验方法1.2.1枸杞无菌苗培育将大小均一的枸杞果实在水中浸泡12 h后去除果肉，清洗种子3次后再浸泡12 h,2%NaC10溶液浸泡30 min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干水分，接种于无菌MS固体培养基上培育无菌苗，温度2 51,湿度50%,光照16 h,黑暗8 h,培养45d。1.2.2愈伤组织培养体系建立以枸杞无菌苗茎段为外植体，接种于添加了不天然产物研究与开发同植物生长调节剂的MS培养基上，其中以0.2 5mg/LNAA+0.125mg/L6-BA为植物生长调节剂组合诱导出的枸杞愈伤组织记为NB,以0.2 5mg/L2,4-D+0.125mg/LKT为植物生长调节剂组合诱导出的枸杞愈伤组织记为DK。每皿4节茎段,每段0.51c m,每一培养条件设5个平行。温度2 51,湿度50%，黑暗培养,45d后记录出愈率、愈伤组织生长量与生长形态。取1g枸杞愈伤组织，接种于继代培养基上，每7 d称重并绘制愈伤组织生长曲线，确定继代周期。出愈率=透导出食伤组织的外植体数，接种的外植体数1.2.3愈伤组织与枸杞种子、果实、根皮提取取冷冻干燥后的愈伤组织、枸杞种子、果实、根皮各2 mg于研磨器中,7 0%乙醇1mL,10000r/min提取1min,40超声提取30 min,8000r/min离心15 min,取上清液待测。1.2.4抗氧化活性检测将40 L愈伤组织上清液与16 0 L0.1mmol/LDPPH溶液加人96 孔板中,振板1 min,避光反应30min后，于517 nm测吸光度（A）。对照组为提取溶剂+DPPH溶液,空白组为愈伤组织上清液+Tris-HCl缓冲液DPPH 清除率=(1-1.2.5代谢组学检测通过UHPLC-Q-TOF-MS对NB、D K 愈伤组织提取物上清液检测，分析其代谢物变化,每组6 个重复。其中 NB 记为 NB-1、NB-2、NB-3、NB-4、NB-5、NB-6,DK 为 DK-1、D K-2、D K-3、D K-3、D K-4、D K-5、DK-6。色谱条件：12 90 InfinityLC超高效液相色谱系统;ACQUITY UPLC BEH Cis色谱柱(1.7 m,2.1mm100mm);柱温40;流速0.4mL/min;进样量2 L;流动相为2 5mmol/L乙酸铵水溶液（含0.5%甲酸）（A）、甲醇(B）。流动相洗脱程序为0 0.5 min,5%B;0.5 10 min,5%100%B;10 12min,100%B;12 12.1 min,100%5%B;12.1 16 min,5%B。质谱条件：电喷雾离子化（ESI）源条件为离子源温度6 0 0,雾化气辅助加热气6 0 psi,辅助加热气6 0 psi,气帘气30 psi，喷雾电压550 0 V（正负两种模式；一级质荷比检测范围为6 0 10 0 0 Da，一级质谱扫描累积时间0.2 0 s，二级子离子质荷比Vol.35100%A样品组A空白组)10 0%HA对照组Vol.35检测范围为2 510 0 0 Da,二级质谱在峰强度值筛选模式采用数据依赖型采集模式IDA获得，去簇电压为6 0 V（正、负两种模式），碰撞能量为3515eV。1.2.6代谢组学数据处理与分析方法原始数据经ProteoWizard软件由Wiff格式转换为mzXML格式,用MSDAIL软件进行峰对齐、保留时间校正与提取峰面积操作。将MSDAIL提取得到的数据与中科新生命植物代谢组数据库中代谢物的分子质量（误差 10 ppm）、保留时间、二级碎裂谱图等信息进行匹配，鉴定代谢物结构。利用主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析进行多元统计分析获取差异代谢物并进行生物信息学分析。2结果与分析2.1愈伤组织培养体系建立NB生长量与出愈率均高于DK且两者的生长表1枸杞愈伤组织生长量、出愈率及生长形态(s,n=5)Table 1 Growth amount,induction rate and morphology of L.barbarum callus(x s,n=5)组别GroupNBDK曾晓倩等：基于代谢组学技术分析枸杞愈伤组织抗氧化活性成分差异组织的最佳继代周期。生长量出愈率Growth amount(g)Induction rate(%)4.1 2.595.0 11.23.5 2.165.0 41.81497形态存在一定差异（见表1）,这是由于培养基中添加的植物生长调节剂不同。作为启动愈伤组织诱导的关键条件,植物细胞内细胞分裂素含量较生长素高时形成新芽,生长素含量较细胞分裂素含量高时促进生根4,当生长素与细胞分裂素比例不当时会抑制愈伤组织生长甚至无法诱导出愈伤组织，只有生长素与细胞分裂素处于一定水平时有利于愈伤组织生长、分化并影响其次生代谢物质如黄酮类物质花青素7 或咖啡酸、绿原酸等酚类物质8 的生成。枸杞愈伤组织继代培养情况如图1所示,NB与 DK继代生长曲线呈“S”型,在继代后的7 d内愈伤组织生长最慢,在7 2 1d内进入指数生长期,愈伤组织生长量增速最快,培养基养分被大量消耗,加速愈伤组织中代谢物的合成,2 1 2 8 d,培养基趋于耗尽，愈伤组织质量增长减缓,因此以2 8 d作为枸杞愈伤生长形态Morphology疏松，深黄色或白色紧密，淡黄或白色自由基清除率最高达7 4.8%，DK在相同质量浓度41320生长天数Growthday（d a y）图1NB与DK枸杞愈伤组织继代生长曲线Fig.1SSubculture growth curve of L.barbarumcallus of NB and DK2.2枸杞愈伤组织抗氧化活性检测时的DPPH自由基清除率仅为38.6%，NB的DPPH自由基清除率是DK的1.9倍,说明NB更易积累抗-NB氧化活性物质。在质量浓度2 mg/mL时,NB的DP-DKPH自由基清除率较自然条件生长的枸杞种子、果实、根皮更高,可见枸杞愈伤组织抗氧化性能良好。1001612182430806040200根皮抗氧化活性是枸杞具有的众多生物活性之一，图2 枸杞愈伤组织与植株不同部位提取物DPPH自由基清除法是一种常用的检测天然产物抗DPPH自由基清除率氧化活性的方法,DPPH 自由基清除率高低能在一Fig.2DPPH radical scavenging rate of L.barbarum定程度反映物质的抗氧化能力强弱。NB、D K 以及枸杞植株不同部位提取物DPPH自由基清除率结果如图2 所示,NB在质量浓度为2 mg/mL时 DPPHcallus and different part of L.barbarum extract注:与 DK相比,*P0.05;*P0.01;*P0.001。No t e:Compared with DK,*P 0.05;*P 0.01;*P1和P1,P=0.087），而咖啡酸乙酯抗氧化能力强14,且具有高于原儿茶醛的淀粉酶抑制活性,可减缓碳水化合物分解成单糖15,降糖活性良好,是一种潜在的植物源活性物。KEGG分析结果如图7 所示,NB中显著性差异代谢物蔗糖、D-氨基葡萄糖、谷氨酰胺、亮氨酸、环磷酸腺苷、胆碱等主要富集在氨基酸的生物合成、ABC转运蛋白、甘油磷脂代谢、氨酰-tRNA生物合成等2 0条通路。气泡大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小，气泡越大代表影响因子越大，气泡颜色反映富集分析的P值大小，颜色越深,P值越小，富集程度越显著。由此可见,ABC转运蛋白、氨酰-tRNA0.20.40.60.81.01500编号No.123456789101112131415161718192021(2-羟基-3-十八烷-6,9,12-三烯酰氧基丙基)2-(三甲基铵)乙基磷酸酯22(2-Hydroxy-3-octadeca-6,9,12-trienoyloxypropyl)2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺231-Hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱241-Stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(6aR,9R,9aR)-9-乙酰基-3-（1E,3E,5S)-3,5-二甲基庚-1,3-二烯基-6 a-甲基-9,9a-二氢呋喃2,3-h异色烯-6,8-二酮25(6aR,9R,9aR)-9-Acetyl-3-(1E,3E,5S)-3,5-dimethylhepta-1,3-dienyl-6a-methyl-9,9a-dihydrofuro 2,3-h J isochromene-6,8-dione262728天然产物研究与开发表3正、负离子模式下NB与DK差异代谢物统计结果Table 3Statistical results of differential metabolites between NB and DK in positive and negative ion modes8-羟基松脂醇4-葡萄糖苷8-Hydroxypinoresinol4-glucoside吡咯烷-1-翁-2-羧酸酯Pyrrolidin-1-ium-2-carboxylate丙基2-O-D-吡喃木糖基-D-吡喃葡萄糖苷Propyl 2-O-D-xylopyranosyl-D-glucopyranoside异麦芽酮糖 Palatinose-麦芽糖-Maltose环磷腺苷CyclicAMPD-氨基葡萄糖 D-Glucosamine燕糖 Sucrose表小檗碱Epiberberine3-3-羟基-2-(2 S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-羟甲基氧杂环-2-基氧苯基 丙酸3-3-Hydroxy-2-(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl J oxyphenyl propanoic acid岩藻甾醇Fucosterol谷氨酰胺类似物Glutamine analogue顺式-咖啡酸cis-Caffeic acid12,19,20-三羟基-14-亚甲基香叶基内醇12,19,20-Trihydroxy-14-methylenegeranylnerol甜菜碱Betaine(6,22E)-6-羟基豆凿4,2 2-二烯-3-酮(6,22E)-6-Hydroxystigmasta-4,22-dien-3-one沙耶恩苷Sayaendoside8-3-氧代-2-（E)-戊-2-烯基环戊烯基-1-基 辛酸8-3-Oxo-2-(E)-pent-2-enyl cyclopenten-1-yl J octanoic acid1-十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱1-Heptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine阿魏酰O-甲基多巴胺Feruloyl O-methyldopamine24-亚甲基胆固醇-8-烯-3-醇2 4-Methylene-cholest-8-en-3beta-ol3-（2,5-辛二烯基）氧辛酸3-(2,5-Octadienyl)-oxiraneoctanoic acidVol.35代谢物化学式MetaboliteFormulaC26 H32 012C,H,NO2Ci4 H26 0 10C i2 H2 O C i2 H2 O C1oH/2 N,O,PC,Hi3 NOsCi2 H2 OC2o HisNO4Cis H2o O9亮氨酸LeucineC,Hi;NO2C28 H46 0C,Hio N,O3C,H.04C2;H38:04C,H.,NO2C2g H46 02Cig H28 O 1oCis H28 03C2s Hs2 NO,PCgH2;NOsC26H4s NO,PC2;H44 NO,PC26H54 NO,PC23 H26 0s豆笛醇StigmasterolC2gH4:0C2gH46 0CigH3o O3离子模式VIPlon mode+1.67+1.62+2.73+5.89+2.74+2.77+2.29+2.49+1.25+1.67+1.23+2.56+1.54+1.33+1.3+1.19+1.06+1.97+1.49+1.07+1.3+1.67+1+2.3+1.07+11.2+4.02+1.15FC1.972.31 10-36.786.88 1042.514.2210-38.766.61 10 48.365.36 10 41.722.83 10 410.42.33 10-56.227.05 10-51.841.48 10 46.378.05 1034.51.35 10-30.122.75 10-47.081.17 10-31.422.72 10-31.991.24 10-22.363.16 1020.614.18 10-20.255.56 10-30.215.84 10-30.333.86 10-34.422.04 10-20.311.11 10-20.391.16 10-20.286.77 10-30.091.21 10-40.531.39 10-20.441.71 1020.331.20 10-3P值Vol.35续表 3(Continued Tab.3)编号No.29303132333435363738393-2-氨基乙氧基（羟基)磷酰基 氧基-2-羟丙基十八烷-9,12-二烯酸酯403-2-Aminoethoxy(hydroxy)phosphoryl oxy-2-hydroxypropyl octadeca-9,12-dienoate7,8-二羟基十八烷-9,12,15-三烯酸417,8-Dihydroxyoctadeca-9,12,15-trienoic acid(10E,12Z,15Z)-9-羟基十八烷-10,12,15-三烯酸42(10E,12Z,15Z)-9-Hydroxyoctadeca-10,12,15-trienoic acid2-3,4-二羟基4-羟甲基氧杂环已烷-2-基 氧基甲基-6-苯基甲氧烷-3,4,5-三醇432-3,4-Dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl oxymethyl-6-phenylmethoxyoxane-3,4,5-triol444546474849505152曾晓倩等：基于代谢组学技术分析枸杞愈伤组织抗氧化活性成分差异代谢物Metabolite6-9a,11a-二甲基-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,8H,9H,9aH,9bH,10H,11H,11aH-环戊a菲-1-基-3-乙基-2-甲基庚烷6-9a,11a-Dimethyl-1H,2H,3H,3aH,3bH,4H,8H,9H,9bH,10H,11H-cyclopenta a phenanthren-1-yl-3-ethyl-2-methylheptane4-乙酰基-2-羟基苯基2-0-D-呋喃果糖基-D-吡喃木糖苷4-Acetyl-2-hydroxyphenyl 2-O-D-fructofuranosyl-D-xylopyranoside6-3-(3,4-二甲氧基苯基)甲基 4-甲氧基-2-甲氧基甲基丁基4-甲氧基-1,3-苯并二氧杂环戊烯6-3-(3,4-Dimethoxyphenyl)methyl-4-methoxy-2-(methoxymethyl)butyl J-4-methoxy-1,3-benzodioxole托芬笛醇A2Topsentisterol A2胆碱 Choline姜辣素 GingerolN-乙酰基-L-苯丙氨酸N-Acetyl-L-phenylalanine9-氢过氧基-(Z,Z,Z)-10,12,15-十八碳三烯酸9-Hydroperoxy-(Z,Z,Z)-10,12,15-octadecatrienoic acid2-氮杂环乙基(3-十六烷酰氧基-2-羟丙基)磷酸酯2-Azaniumylethyl(3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl)phosphate1-棕榈酰磷脂酰胆碱1-Palmitoylphosphatidylcholine泛酸钙 Calcium pantothenate十七烷酸Heptadecanoic acid补骨脂乙素 Isobavachalcone富马酸Fumaric acid反式-11-十八烯酸trans-11-Octadecenoic acid乳果糖Lactulose乳糖 Lactose2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸2-Hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid1501化学式离子模式VIPFormulaIon modeC29H48+C1,H26 2+菜油甾醇 CampesterolC28 H4g 0C24 H32 07C29 H48:03C,Hi4 NOCi7 H26 04Ci,Hi3 NO3CisH3o 04C2;H44 NO,PC24 Hso NO,PC2,H4 NO,PCigH30 04Cig H3o O;Ci:H26 O 10o色氨酸TryptophanC,H/2 N2 02C,Hi,NOs:1/2 CaCi7 H34 02C20 H2o 04C4H404Cig H34 O2C i2 H2 O C 12 H2 O C.H:07FC4.490.321.570.16+1.82+1.96+1.01+3.11一2.44一1.681.04一1.451.41一1.271.5一7.96一1.49一1.4一1.06一1.37一1一1.08一2.06一8.65一8.31.53一P值1.79 10 48.09 10 40.261.01 10-30.564.93 10-20.572.87 10-20.512.08 1020.888.47 10-30.249.81 1040.433.88 10-30.41.15 10-20.328.74 10-30.448.19 10 30.379.66 10-30.281.68 10-30.261.93 10-40.183.17 10-40.282.59 10-50.662.04 1020.786.41 10 40.784.24 10-20.873.76 10-311.64.77 10-7121.54 10 2.999.75 10 4535455谷氨酰胺GlutamineD-葡萄糖 D-Glucose（+/-)-格罗沙酰胺（+/-)-GrossamideC,HioN,O;C,Hi2 0C36H36N2 O:一一一1.481.631.329.347.252.771.86 10 41.29 10-31.85 104生物合成、氨基酸的生物合成通路富集程度最为显著,对愈伤组织物质合成影响最大。其中，ABC转运蛋白是植物中最大的转运蛋白家族之一，位于植物液泡、线粒体和叶绿体膜上，由ATP直接供能16 ,参与调节植物体内生长、发育以及对营养物质的摄取、对生物和非生物胁迫的耐受性、植物激1502天然产物研究与开发Vol.35A123456789101112131415161718192021222324252627282930313233345423-1-0.500.5图6正（A）、负(B)离子模式下显著性差异代谢物层次聚类热图Fig.6 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in positive(A)and negative(B)ion modeB1353637383940414243444546474849505152535455-NS-N-0.500.5Circadian rhythmmTOR signaling pathwayGrowthhormonesynthesis,secretionandactionMAPK signaling pathwaycGMP-PKG signaling pathwayCalcium signaling pathwayArginine biosynthesisD-Glutamine and D-glutamatemetabolismAlanine,aspartate andglutamatemetabolismOxidative phosphorylationGlycerophospholipidmetabolismAminoacyl-tRNAbiosynthesisGlycine,serineand threoninemetabolismPhenylalanine metabolismABC transportersGlucosinolate biosynthesisBiosynthesis of amino acidsPurine metabolismCarbonmetabolism2-OxocarboxylicacidmetabolismNumber1234-log,(Pvalue)3.02.52.00.00.1图7KEGG富集通路图Fig.7KEGG enrichment pathway diagram0.2Richfactor0.30.40.5Vol.35素、初生与次生代谢物质的运输等多种生物学过程17 。显著性差异代谢物谷氨酰胺、亮氨酸、蔗糖、谷氨酰胺、胆碱富集于ABC转运蛋白通路上，谷氨酰胺、亮氨酸、色氨酸富集于氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成通路上。谷氨酰胺作为无机氮源氮同化的主要产物，也是植物氮代谢的核心代谢产物18 ,由葡萄糖经多个初生代谢途径合成,是生物体内含量丰富的氨基酸，NB高蔗糖水平或是导致其谷氨酰胺的水平较DK更高的原因。谷氨酰胺与植物体内的氮调节密切相关,不同形态的氮促进药用植物不同种类代谢物的生物合成,但具体作用机制仍有待研究。由于调节氮代谢可减少碳水化合物的消耗,对植物生长与代谢物合成积累具有协同作用13,枸杞愈伤组织中的谷氨酰胺可能对地骨皮乙素这一重要含氮代谢物的生物合成具有重要调控作用。Sun等19 发现亮氨酸可以通过改善氧化损伤从而增强抗氧化活性。此外,色氨酸在高等植物中广泛存在,作为前体物质可合成内源生长素吲哚乙酸来间接调控代谢物合成，Kahveci等2 0 发现外源色氨酸促进酚类物质的合成。上述三条代谢通路中富集的代谢物多为初生代谢物,初生代谢物在 ABC 转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成以及氨基酸的生物合成代谢通路上的显著富集反映出NB活跃的初生代谢物物质合成、运输水平,它们可以直接参与植物生命活动过程,为其提供能量,也可进一步生成次生代谢物所需的原料与前体,间接调控具有良好生物活性的酚类、生物碱等代谢物的生成,从而对愈伤组织的抗氧化活性产生影响。虽然植物细胞内物质转运是一个动态且复杂过程,其具体的作用机制仍未明确，但已有研究表明，ABC转运蛋白不仅在植物营养和生殖发育中发挥作用，还可以参与调控次生代谢物花青素的积累2 1,因为ABC 转运蛋白介导的细胞内转运是花青素积累的重要限速步骤,转运蛋白的向内和向外交替的构象结构被认为可以调节底物结合或释放2 2 。因此,初步推断ABC转运蛋白功能差异可能是导致不同植物生长调节剂组合诱导出的枸杞愈伤组织抗氧化活性差异显著的主要原因。3讨论与结论从枸杞种子培育无菌苗获取茎段作为诱导愈伤组织的外植体，建立了稳定的枸杞愈伤组织培养体系,并得到高抗氧化活性枸杞愈伤组织 NB。通过非曾晓倩等：基于代谢组学技术分析枸杞愈伤组织抗氧化活性成分差异Ecol,2020,88:103985.4Phillips GC,Garda M.Plant tissue culture media and prac-tices:an overview J.In Vitro Cell Dev Biol-Plant,2019,55:242-257.5 Guo Q,Niu WL,Li XJ,et al.Study on hypoglycemic effect ofthe drug pair of Astragalus Radix and Dioscoreae Rhizoma inT2DM Rats by network pharmacology and metabonomics1503靶向代谢组学分析了枸杞愈伤组织的物质成分及其代谢通路差异，发现枸杞愈伤组织共有7 52 种化合物,与天然植株在活性成分上也具有相似性且抗氧化活性较天然植株更佳。与DK相比,NB中55种代谢物存在显著差异,其中2 2 种代谢物含量上调，包括抗氧化活性良好的甜菜碱2 3 等次生代谢物。此外,NB的乳糖、乳果糖较DK高11倍,这些糖类作为初生代谢物,可以利用糖苷酶水解作用转化为单糖,通过糖异生途径生成重要抗氧化剂谷胱甘肽的前体物质谷氨酰胺等2 4,间接地促进枸杞愈伤组织次生代谢产物的生成及抗氧化能力的增强。KEGG结果表明,显著差异代谢物富集于2 0 条代谢通路中,主要通过ABC转运蛋白、甘油磷脂代谢、氨酰-tRNA生物合成、氨基酸的生物合成通路直接或间接调控枸杞愈伤组织生长及代谢物合成。在已检测出的55种差异代谢物中,甜菜碱与有机酸研究广泛,而表小檗碱等次生代谢物鲜见研究，且表小檗碱具有良好的减少脂质积累2 5 的作用,对人体健康极具益处。目前，通过控制外源条件对愈伤组织代谢物进行定向诱导，可以富集特定代谢物并利用分离纯化手段获取安全可靠的植物源天然活性物。Khanam等2 6 通过添加化学结构不同的植物生长调节剂提高了薄荷油的产量，可见植物次生代谢产物调控具有可行性,植物组织培养有望成为枸杞资源的重要获取途径，为枸杞资源的开发尤其是次生代谢产物的工业化生产提供借鉴。参考文献1Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoe-ia:VolI（中华人民共和国药典：第一部）M.Beijing：China Medical Science and Technology Press,2020:260.2Lan T,Huang YP,Liang QP,et al.Study on chemical constit-uents from root and stem of Lycium barbarum L.J.NatProdDev（天然产物研究与开发）,2 0 19,31:1491-1497.3Li YP,Zeng SH,Li F,et al.Variation of kukoamine A(KuA)and B(KuB)contents and related meteorological factors forCortex Lyci Radicis of different areas J.Biochem Syst1504J.Molecules,2019,24:4050.6Qian D,Zhao YX,Yang G,et al.Systematic review of chemi-cal constituents in the genus Lycium(Solanaceae)J.Mole-cules,2017,22:911.7Ji XH,Wang YT,Zhang R,et al.Effect of auxin,cytokininand nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures ofred-fleshed apple(Malus sieversi f.niedzwetzkyana)J.Plant Cell Tiss Org,2015,120:325-337.8Karakas FP.Efficient plant regeneration and callus inductionfrom nodal and hypocotyl explants of Goji berry(L