SC∕T 7016.14-2019 鱼类细胞系 第14部分：锦鲤吻端细胞系（KS）.pdf

ICS 65.150 B 50:才:中华人民共和国水产行业标准SC/T 7016.14-2019 鱼类细胞系第14部分:锦鲤吻端细胞系(KS)Fish celllines-Part 14:Koi snout cellline(KS)2019-08-01发布2019-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7016.14-2019 前本部分为反:/T7016的第14部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意文本的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业农村部渔业渔政管理局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本部分起草单位z中国水产科学研究院珠江水产研究所。本部分主要起草人t玉庆、T英英、曹伟伟、李莹莹、尹纪元、刘春、任燕、常藕琴、石存斌。I SC/T 7016.14-2019 鱼类细胞系第14部分:锦鲤吻端细胞系(KS)范围本部分规定了锦鲤吻端细胞系的术语和定义、缩略语、试剂和耗材、器材和设备、细胞形态与特性、细胞培养条件、细胞传代和保存、质量检查。本部分适用于锦鲤吻端细胞系的2 规范性引用文件下列文件对于本文件凡是不注日期的引用GB/T 6682 3 术语和定义4 5 5.1水应符合GB/T5.2 细胞培养渡配制方法参见附录5.3 细胞消化班配制方法参见附录A.2。5.4 PBS摄冲液配制方法参见附录A.3.5.5 细胞冻存擅配制方法参见附录A.4。5.6 血清胎牛血清CFetalBovine Serum,FBS).5.7 试荆耗材细胞培养瓶、移液器、移液管以及冻存管等培养细胞所用的起材。6 器材和设备6.1 培养箱(可恒温2rC)。1 SC/T 7016.14-2019 6.2 超净工作台。6.3 生物安全柜。6.4 倒置显微镜。6.5 细胞计数仪。6.6 液氮冻存罐。7 细胞形态与特性7.1 形态为上皮细胞，细胞呈椭圆形参见附录B中图B.l)。7.2 大小经细胞实时分析系统测定细胞悬浮后的平均直径约13.5m(参见附录C)。7.3 特性7.3.1 生长特性贴壁生长，传代后10h内细胞贴壁，24h后能基本长满单层细胞。7.3.2 对部分水生动物病原的敏感性KS对KHV、GCRV等病毒敏感，KS接种KHV后，置于22.C培养，3d-4 d，细胞出现空泡状CPE，5 d-7 d，细胞单层呈网状;接种GCRV后，置于27.C培养，4d-5 d，细胞出现融合性病变，随培养时间的延长，细胞逐渐脱落，接种后的CPE形态参见图B.2和B.3.8 细胞培养条件8.1 培养温度细胞置于生化培养箱内，在15.C-32.C下培养，最适生长温度为27.C。9 细胞传代和保存9.1 传代9.1.1 吸弃挑选长满单层KS细胞的培养瓶，置超净工作台内，吸出旧培养液。9.1.2 消化和分散用细胞消化液消化分散细胞。沿细胞培养瓶一侧加人细胞消化液，一般在25cm2细胞培养瓶中加人2mL左右或按细胞培养瓶培养面每平方厘米加人O.05 mL-O.1 mL，加入量必须完全浸没细胞层。贴壁长满的KS肖化时间一般为2min-3 min，细胞开始变圆便吸弃细胞消化液，轻轻拍打培养瓶以分散细胞。9.1.3 分瓶拍打分散细胞后，在25cm2细胞培养瓶中加入10mL-15 mL细胞培养液(参见附录A.1)，按每瓶5mL分成2瓶-3瓶，使细胞终浓度达到1X105个/mL-2X105个/mL.在27C培养，10h内细胞贴壁并生长;24h后能基本长满单层细胞。9.1.4 传代周期细胞长满单层2d-3 d后可再次传代。9.2保存9.2.1 低温保存传代后的KS经27.C下24h的培养后，移人培养箱15.C或20.C保藏。在150C下可保存60d,20C 下可保存30d。9.2.2 冻存在液氮中冻存，将一瓶25cm2的长满单层的KS细胞按9.1.2进行消化和分散。加人5mL细胞培2 e SC/T 7016.14-2019 养液重悬细胞，将重悬后细胞离心，吸弃细胞培养准。加入1.5 mL细胞冻存液参见A.4)重悬细胞(细胞终浓度1X107个/mL2X107个/mL)，置于1.8mL冻存管中，保种细胞应经逐步降温后放人液氮中。10 质量检查传代细胞的质量检查包括:的一年内至少要进行一次病毒敏感谱的检测;b)在移人生化培养箱的第2d用倒置显徽镜观察细胞形态、生长情况，连续观察7d-10 d;c)可根据培养液中酣红的颜色判定培养液的pH是否保持在7.2-7.6，若pH不合适，可采取换攘的方法;d)细胞培养液浑油或出现丝状物时，视为细菌或真菌、污染，将细胞高温高压灭菌后丢弃ze)1年至少要进行1次支原体检测。3 SC/T 7016.14-2019 附录A(资料性附景)试荆配制F A.1 细胞培葬班Naz HP04 KHzP04 NaCl KCl EDTA 膜酶水在lL-20C保存。A.3 p皿力血磁牛到胎放的器%容四叫叫川在水-hc吨脚却;需人占HH中A.2 细胞消化班除菌并分装，A.4 细胞在存灌Leibovitz气L-15培养基(含例配制而戚。4 附景B资料性附录)KS及其接种病毒产生的CPE形态圄B.1 正常KS细胞见图B.1Q B.2 KS在接种KHV后出现的CPE见图B.2o圄B.1 正常KS细胞圄B.2KS在接种阻IV后出现的CPESC/T 7016.14-2019 5 SC/T 7016.14-2019 B.3困在接种Gv后出现的CPE见图B.30 圄B.3KS在接种GCRV后出现的CPE6 附录C(资料性附录)细胞实时分析系统测定KS悬浮特性细胞实时分析系统测定KS悬浮特性见图C.L计数等叫E MI s 等 o SC/T 7016.14-2019 6 12 18 24 30 36直径，m注:细胞汁数为12215个;平均体积为1.28pL:平均直径为13.5ffi.圄C.l细胞实时分析系统测定KS悬浮特性7