槲皮素金属配合物合成及清除自由基能力研究报告设计方案性实验报告.doc

槲皮素-金属配合物的合成及清除自由基能力的研究自由基是一类外层轨道含有未配对电子的原子团或特殊状态分子，其中与人体关系最为密切的是氧自由基，如超氧自由基(O-2)、羟基自由基(OH)、脂质过氧化自由基(ROO)等，其中以O2-形成最早，OH氧化性最强。通常自由基在机体内的生成和去除处于动态平衡状态，不会对机体造成严重损伤，但是当机体对自由基的清除能力减弱或自由基清除剂供给不足，以及摄入生成自由基的物质过多时，体内的自由基相对过剩，会攻击生物大分子如蛋白质、核酸、脂质等，使其交联或断裂，进而破坏细胞的结构和功能，导致机体病变、衰老和死亡。随着氧自由基和抗氧化理论研究工作的深入，特别是一些合成的抗氧化剂在使用中存在一些毒性时，天然抗氧化剂的研究越来越受到人们的重视。1、前言黄酮类化合物(Flavonoids)是目前倍受关注的天然活性产物之一。槲皮素又名栎精(quercetin)，是一种黄酮醇类天然化合物，来源于芦丁的酸性水解产物，化学命名为3,5,7,3,4-五羟基黄酮(Que)，广泛存在于大约68%的植物中。分子式：C15H10O7；分子量：302.23；结构如下：槲皮素广泛分布于蔬菜、水果、干果、饮料及中草药之中，槲皮素药理作用广泛,具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗氧自由基和抗心率失常等多种生物活性及药理作用。但由于槲皮素在水中溶解度低,极大地影响了槲皮素在生物体内的利用度。根据中药配位化学原理,中药有机成分与微量元素结合后往往会提高其生物活性或产生新的生物活性。作为金属螯合剂，黄酮类化合物在金属的生物可利用性方面起着重要的作用。将黄酮类化合物与人体必需金属元素形成配合物,并发挥其抗活性氧自由基的协同增效作用是较为全新的研究领域,为槲皮素的开发利用开辟了新的途径。本实验将合成的三种配合物槲皮素铜() 、槲皮素铁()、槲皮素锌()与配 43体，在Fenton反应机制产生羟自由基和光照核黄素产生过氧自由基的体系中进行了响应行为的比较和探讨。为槲皮素类新型药物的寻找和开发提供了实验基础。2、材料与方法试剂：槲皮素（上海化学试剂二厂，生化试剂）；邻苯三酚；维生素C，食品级；Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2）；醋酸锌等试剂，除标明外，其余试剂均为分析纯；全部实验用水为二次蒸馏水。仪器：磁力搅拌器、pHS-3C 数字酸度计、722型分光光度计3、实验方法3.1 配合物的合成3.1.1 槲皮素-铜、铁、锌配合物的合成按适宜的摩尔比(槲皮素与醋酸铜为2:1，槲皮素与醋酸锌、氯化铁均为1:1)，分别将金属盐溶液在搅拌下缓慢滴加到槲皮素溶液中。如：在不断搅拌下，按摩尔比为1:1将0.5mol/L的Zn(Ac)2乙醇溶液滴加到0.5mol/L的槲皮素乙醇溶液中，搅拌均匀。用5%NaOH乙醇溶液调节pH=9，水浴回流搅拌70min，产生沉淀物，静置冷却后过滤，3000r/min离心分离，沉淀用无水乙醇反复洗涤，以除去其中残留的柚皮苷和游离的金属离子，得到粗品。用丙酮与冰醋酸以1：1混合溶剂对粗品进行重结晶，析出浅黄色针状晶体，抽滤，45真空干燥。3.2 抗氧化活性测定3.2.1 槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定产生HO自由基的反应体系是Fenton反应：H2O2 + Fe2+ OH- + HO + Fe3+自由基一般存活时间比较短而且活性高，而水杨酸能有效捕捉HO自由基且产生有色产物。因此，若在该体系加入一定量的水杨酸，将发生如下反应：产生的有色物质在510nm处有强吸收。添加水杨酸后立即测定吸光度值(此值可作为A0)。若在水杨酸捕捉自由基的体系中添加黄酮类物质，由于黄酮类化合物具有清除HO自由基活性，从而降低甚至完全清除HO自由基，而使有色物质的浓度降低，在此条件下 44测定吸光度值，则可用来测定黄酮类化合物对HO自由基的清除效率。在25mL比色管中依次加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、1mmol/L H2O2溶液3mL，摇匀，再加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，加入蒸馏水补充至25mL，于37水浴加热15min后取出，测其吸光度A0。另取25mL比色管依次加入2mmol/L FeSO4溶液3mL、1mmol/L H2O2溶液3mL，摇匀，分别加入1.010-4mol/L待测液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，于37水浴加热15min后取出，然后加入6mmol/L水杨酸溶液3mL，继续水浴加热15min，取出用蒸馏水补充至25mL，摇匀，测其吸光度Ai 。按下式计算清除率P。用维生素C作对照实验。清除率P =(A0-Ai)/A0100%3.2.2 槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除实验采用邻苯三酚自氧化法测定橙皮苷锌配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除能力。取pH为8.2的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液4.5mL，置于25水浴中预热20min，分别加入1mL试样（1.010-4，2.010-4，3.010-4，4.010-4，5.010-4）和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25水浴中反应5min，加入8mol/L HCl 1mL终止反应，快速测定325nm处的吸光度值Ai，空白对照组A0以相同体积的蒸馏水代替样品，按下式计算清除率P。用维生素C作对照实验。清除率(%)=(A0-Ai)/A0100%4 数据记录与处理4.1 槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定1.0*10-4mol/L待测液0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Vc吸光度0.4850 0.0420 0.0360 0.0310 0.0290 0.0250 清除率0.0000 0.9134 0.9258 0.9361 0.9402 0.9485 表1槲皮素对羟自由基的清除作用测定 图1槲皮素对羟自由基的清除作用测定 45表2 槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定1.0*10-4mol/L待测液0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 Fe的吸光度0.4850 0.0240 0.0180 0.0150 0.0100 0.0040 清除率0.0000 0.9505 0.9629 0.9691 0.9794 0.9918 图2槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定 表3 槲皮素-铜配合物对羟自由基的清除作用测定 461.0*10-4mol/L待测液0.001.002.003.004.005.00Cu的吸光度0.48500.20100.18200.14000.09500.0620清除率0.00000.58560.62470.71130.80410.8722 图3 槲皮素-铁配合物对羟自由基的清除作用测定4.2 槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除实验 表1 槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定待测液浓度mol/L参比（水）1.0*10-42.0*10-43.0*10-44.0*10-45.0*10-4Vc的吸光度0.4970 0.0270 0.0210 0.0150 0.0040 0.0010 清除率0.0000 0.9457 0.9577 0.9698 0.9920 0.9980 图1 槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定 47 表2 槲皮素-铁配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定待测液浓度mol/L参比（水）1.0*10-42.0*10-43.0*10-44.0*10-45.0*10-4Fe的吸光度0.4970 0.4350 0.3210 0.2490 0.1810 0.1330 清除率0.0000 0.1247 0.3541 0.4990 0.6358 0.7324 图2 槲皮素-铁配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定表3 槲皮素-铜配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定 48待测液浓度mol/L参比（水）1.0*10-42.0*10-43.0*10-44.0*10-45.0*10-4Cu的吸光度0.4970 0.2030 0.1630 0.1290 0.1100 0.0750 清除率0.0000 0.5915 0.6720 0.7404 0.7787 0.8491 图3 槲皮素-铜配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除测定5 结果分析讨论5.1 槲皮素及槲皮素-金属配合物对羟自由基的清除作用测定槲皮素及其槲皮素一金属配合物的基本结构单元为黄酮醇，在骨架的3，5，7，3 ，4 位都有羟基和酚羟基，易被氧化，从而起到清除生物体内氧自由基的作用，从实验结果看出，槲皮素及其槲皮素一金属配合物与O2和 OH的反应活性表现不同，表明槲皮素及其槲皮素一金属配合物与0 和OH反应的活性部位和作用机制可能不相同1。张英等2对黄酮类化合物的研究证明，B环邻二酚羟基(3 ，4 邻二酚羟基)，是清除OH的关键功能团，在抗氧化剂的作用机制中，通过酚羟基与氧自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止链式反应是最主要的。而在清除01I过程中，黄酮环共轭体系对未配对电子的离域化可能在稳定黄酮自由基中间起主导作用。C一2，3位双键，4 一OH是清除0 的关键活性部位。3以上结论可能对槲皮素及其金属配合物也适用。当槲皮素按物质的量比为2：1接入铜、铁离子后，环上的3位羟基与4位羰基与铜、铁离子键合而改变了其抗氧化活性，槲皮素强大的共轭环使其作为酸配体与钼形成配合物后，整个配合物又作为更强的路易氏酸来接受O2的耵电子，有效的电子离域化的结果使槲皮素铜、铁配合物与0 反应的中间体可能更加稳定；另一方面，OH的活性主要表现在它的氧化性上，因此，3 ，4 邻二酚羟基和3-OH很敏感，从而表现出槲皮素一铜、铁配合物对OH的清除作用比槲皮素高。45.2 槲皮素及槲皮素-金属配合物对超氧阴离子自由基(O2-)的清除实验本研究结果显示，槲皮素一铜配合物对0 =有较强的清除能力，槲皮素一铁配合物 49稍微逊色点，在一定浓度范围内，与其浓度成正比，并且明显优于槲皮素；槲皮素和槲皮素一铜、铁配合物都具有较好的清除OH 的活性，在低浓度时，槲皮素一铜、铁配合物优于槲皮素，在高浓度时槲皮素比槲皮素一金属配合物的抑制率高，因此，控制一定槲皮素一金属配合物的浓度，使槲皮素一金属配合物发挥其较强的清除羟基自由基的作用，进一步对槲皮素一金属配合物的生物活性进行研究，为黄酮类药物的研究提供一种新的思路和途径5。6 参考文献1贾小燕 李文杰 柴保臣 朱明君 阎素清 槲皮素-钼配合物的抗氧化作用 郑州大学学报(医学版) 2008年5月 第 鲞箜 塑2张英，吴晓琴黄酮类化合物结构与清除活性氧自由基效能关系的研究Jj天然产物研究与开发，1998，10(4)：263 夏玉明 朴惠善 许妍姬 沈光海 郑云花 槲皮素过渡金属锌配合物的合成延边大学学报：自然科学版 1999-25-14 吴新建 ，林素英 ，李荣华 槲皮素与3d一过渡金属二价离子的配位反应研究 福建师范大学学报：自然科学版 2007-23-65谭君 一，王伯初 ，祝连彩 槲皮素金属配合物的药理作用研究进展 文章编号：10012494(2006)22168804 中国药学杂志 2006-41-227 评语评分