基于TMT蛋白组学探讨消肿止痛合剂治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制.pdf

Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化多组学技术研究基于TMT蛋白组学探讨消肿止痛合剂治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制马岁录1，何志军2，刘涛2，李岩2，何元旭1，何波1（1.甘肃中医药大学中医临床学院 兰州 730030；2.甘肃省中医院 兰州 730050）摘要：目的应用Tandem Mass Tag（TMT）体外定量蛋白组学技术研究消肿止痛合剂治疗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤（Flap Ischemia-reperfusion Injury，FIRI）的作用机制。方法30只SD大鼠随机分为正常组、模型组、消肿止痛合剂组（消肿组），每组10只；正常组腹腔麻醉后切开背部约5 cm*6 cm皮肤及其皮下筋膜，未游离皮瓣，模型组与消肿组腹腔麻醉后完全游离背部大小约5 cm6 cm带蒂皮瓣，模拟FIRI；消肿组给予消肿止痛合剂灌胃（1.8 mLkg-1），每天1次，正常组和模型组给予生理盐水灌胃（1.8 mLkg-1），每天1次，3组大鼠连续灌胃7天；7天后取大鼠背部皮瓣组织进行TMT蛋白组学分析，筛选出差异蛋白，对其进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析、通路富集（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析、共同差异蛋白分析，并建立差异蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络分析。结果本次实验通过蛋白质定量共筛选出5005个蛋白质，其中鉴别到4996个蛋白质，筛选出消肿组/模型组之间141个上调和132个下调的差异表达蛋白。GO富集分析发现差异表达蛋白主要参与有机体细胞代谢、细胞组分的发生与结合、分解代谢、细胞器形成、线粒体形成、细胞内物质催化、分子结合、水解酶活化、核苷酸调节等分子机制。KEGG通路分析发现差异表达蛋白主要涉及有机体细胞代谢、核糖体转录翻译、蛋白酶体系统、细胞周期等信号通路。PPI分析发现共同表达差异蛋白Mrpl32、Psma2、Mrpl34、Psma4、Psmb1、Srp9位于相互作用网络的关键节点。结论消肿止痛合剂治疗大鼠FIRI可能与线粒体核糖体相关信号通路、20S蛋白酶体系统信号通路等有关，其中差异蛋白Mrpl32、Psma2、Mrpl34、Psma4、Psmb1可能是药物发挥作用的关键靶点。关键词：消肿止痛合剂 TMT蛋白组学 皮瓣缺血再灌注 生物信息学分析doi:10.11842/wst.20220617001 中图分类号:R285.5 文献标识码:A皮瓣缺血再灌注损伤（FIRI）是指缺血缺氧的皮瓣组织在血运重建过程中由于有害物质的释放而引起皮瓣组织再次损伤的病理过程。皮瓣移植技术作为整形外科与修复重建外科在临床上治疗烧伤、肿瘤、骨感染等疾病的重要手术方式，临床应用广泛，但术后出现的皮瓣坏死不仅困扰着临床医生，同时也加重了患者的负担1。有研究表明，皮瓣移植过程中出现的FIRI是导致皮瓣坏死的主要原因1。现代研究发现FIRI是由炎症反应、氧化应激反应、血管内皮细胞坏死、局部微循环障碍等多种因素共同作用的结果2。FIRI属于中医学中“瘀血证”的范畴，临床上使用具有“祛瘀生新、活血止痛”功效的中医药治疗FIRI的效果显著3。在中医整体观念与辨证论治思想的指导下，以“活血化瘀、消肿止痛”为主体的中医药在治疗FIRI中具有良好的效果，不仅可以显著提高移植皮瓣的存活率，还可以降低西药治疗过程中出现的不良反 收稿日期：2022-06-17 修回日期：2022-08-29 甘肃省中医药管理局项目重点课题（GZKZ-2020-2）：基于多组学及网络药理学研究消肿止痛合剂治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制，负责人：何志军；国家自然科学基金委员会面上项目（81660802）：消肿止痛合剂对皮瓣修复后血管再生及其信号通路VEGF-Dll4/Notch的机制研究，负责人：何志军；兰州市人才创新创业专项（2019-RC-63）：消肿止痛合剂工艺质量提升及药效学研究，负责人：何志军。通讯作者：何志军，教授，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：中医药防治骨与软组织疾病、皮瓣移植等方面研究。1987 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 应4。中医药作为我国的瑰宝，中药以及中药制剂内的有效成分较为复杂，并且在疾病治疗过程中的作用机制尚未完全清楚，但随着蛋白组学（Proteomics）技术的出现与不断发展，通过使用蛋白组学技术研究药物在治疗疾病过程中的关键靶点，可以为中药、中药制剂的研发，以及探究中医药治疗疾病的作用机制提供了重要途径5。消肿止痛合剂属于甘肃省中医院院内制剂，由甘肃省中医院科研制剂中心生产，用于治疗骨折、骨折术后、软组织损伤等多种骨伤科疾病多年，临床疗效显著6。课题组前期相关临床和实验研究证实，消肿止痛合剂可以通过减少炎症因子的释放、中性粒细胞的聚集以及细胞凋亡，从而达到保护缺血缺氧皮瓣的目的7。同时，近期课题研究发现，消肿止痛合剂可以通过减少FIRI大鼠血管内皮细胞的凋亡，促进皮瓣新生血管的生成，从而极大程度的提高了移植皮瓣的成活率8。既往研究已经证实消肿止痛合剂可以改善FIRI大鼠皮瓣的成活率。但消肿止痛合剂治疗FIRI的机制研究尚不够深入，仍需继续深入研究。本次研究通过利用TMT体外标记定量蛋白组学技术，筛选消肿止痛合剂在FIRI中起药理作用的关键靶点与通路，从蛋白表达调控角度阐述消肿止痛合剂治疗FIRI的作用机制，并为课题组的相关研究提供新的思路与方向。1 材料与方法 1.1动物、试剂与仪器采用2月龄SPF级SD大鼠30只（由甘肃中医药大学动物实验中心提供并饲养，温度 22，相对湿度55%，自由摄食饮水），雌雄各半，体质量在200-220 g，实验动物生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2020-0009，动物合格证编号：NO.62001000000533，本实验经甘肃中医药大学伦理委员会批准（批号：2021-024）。消肿止痛合剂，由甘肃省中医院制剂室按制备工艺制成，注册文号：甘卫普制准字（1997）-202-04，批号：20051122，规格：250 mL/瓶；UA 缓冲液（Sigma 公司，8M Urea，150 mmolL-1 Tris-HCl pH=8.0）、NH4HCO3（Sigma公司，批号：A6141）、乙腈（Merck公司，批号：1499230-935）、甲酸（Fluka 公司，批号：20190111723）、TMT 10plex kit（Thermo Fisher公司，批号：90066）、High-pH反相肽分离试剂盒（Thermo Fisher 公司，批号：84868）、质谱仪（Thermo Scientific 公司，Q-exacitve HF-X）、色谱系统（Thermo Scientific公司，Easy-nLC1200）、色谱柱（Trap column（Reverse-phase），100 m20 mm(5 m，C18)）。1.2实验方法1.2.1实验分组与给药采用SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体质量200-220 g（由甘肃中医药大学动物实验中心提供）。将30只大鼠按体质量编号后，使用随机数字表法将大鼠随机分为3组，正常组（假手术组）、模型组、消肿止痛合剂组（消肿组），各组10只。消肿组给予消肿止痛合剂灌胃，给药量按70 kg 成人体表面积折算成等效剂量，按1.8 mLkg-1灌胃，1 mL/100 g(每毫升含生药 0.09 g)，1次/天，连续7天；正常组、模型组给予同体积生理盐水灌胃，1次/天，连续7天。1.2.2实验动物造模皮瓣造模方法参考Schmauss等9所述文献进行造模：以1%的戊巴比妥（0.5 mL/100g）腹腔麻醉3组SD大鼠，俯卧位固定于大鼠解剖，正常组切取背部约5 cm6 cm皮肤及其皮下筋膜，未游离皮瓣。模型组与消肿组完全游离背部大小约5 cm6 cm带蒂皮瓣，并使用微血管夹夹闭双侧胸背浅动脉2 h，2 h后去除血管夹在显微镜下观察血运恢复情况，模拟FIRI。用6-0医用聚酰胺缝合线间断原位缝合皮瓣（皮瓣组织包括皮肤及皮下筋膜层）。各组大鼠切口周围聚维碘酮消毒后涂抹红霉素软膏，术后前3天使用头孢噻肟钠预防感染（sig:0.2 g，i.m,qd)。1.2.3标本采集、病理组织学观察与蛋白样品制备术后7天将大鼠麻醉，观察各组皮瓣组织坏死程度后，切取皮瓣组织，部分放入10%中性多聚甲醛固定，乙醇、二甲苯处理后石蜡包埋并切片处理，TUNEL染色后在光学显微镜下行观察。部分放入事先预备好的液氮罐中，12 h后取出置于-80冰箱中保存待用。取样品液氮研磨，每样称取约100 mg，分别加入600 L SDT裂解液，冰浴超声2 min，4，16 000 g离心20 min，取上清液，使用BCA法进行蛋白定量。1.2.4指标检测（1）SDS-PAGE凝胶电泳每组样品各取 15 g 蛋白质样品 5 1（V/V）加入5上样缓冲液，沸水浴 5 min，进行 8%-16%SDS-PAGE电泳。电泳使用考马斯亮蓝染色（Bradford法）。1988 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化多组学技术研究（2）蛋白质酶解及肽段脱盐每组样品各取300 g蛋白质样品进行蛋白质酶解，酶解方法参考 Winiewski 等10使用的 FASP 酶解法。酶解后的肽段使用C18 Cartridge脱盐，真空冻干。肽段干燥后用 0.1%TFA 复溶，使用 Thermo desalting spin column脱盐处理，进行肽段定量。（3）TMT肽段标记与肽段分级每例样品分别取100 g肽段，按照Thermo Fisher公司TMT标记试剂盒说明书进行标记（正常组：ZC-1、ZC-2、ZC-3；模型组：MX-1、MX-2、MX-3；消肿组：XZ-1、XZ-2、XZ-3）。各组标记后的肽段等量混合、干燥，使用High-pH反相色谱柱将干燥后的肽段进行分级。最终将上述方法收集到的样品合并为10个组分。每个组分的肽段干燥后用0.1%FA复溶冻干样品，以备LC-MS分析。（4）LC-MS/MS分析及蛋白质鉴定参考 van den Broek 等11论述的方法对样品进行LC-MS/MS分析及蛋白质鉴定。使用纳升流速高效液相色谱系统（Easy nLC 1200）进行色谱分离。缓冲液A：0.1%甲酸水溶液；缓冲液B：0.1%甲酸、80%乙腈和水混合溶液。肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪进行DDA二级质谱分析。1.3数据处理及分析数据处理使用 Proteome Discoverer 软件（搜索引擎 Sequest HT）对LC-MS/MS原始RAW文件进行数据库 检 索（蛋 白 数 据 库：uniprot-Rattus norvegicus-10116-36181-20210608.fasta，来源网址：https:/www.uniprot.org，蛋白数目：36181；下载日期：2021-06-8）。将筛选出的差异蛋白进行GO富集分析，KEGG通路富集分析，共同差异蛋白分析以及差异蛋白相互作用PPI网络分析。2 结果 2.1消肿止痛合剂对FIRI模型大鼠的影响术后7天观察大鼠皮瓣组织坏死程度发现（图1），空白组大鼠皮瓣组织生长良好、色泽红润、弹性好；模型组大鼠皮瓣组织瘀血形成、色泽发黑，皮肤肿胀，弹性差；消肿止痛合剂治疗后，大鼠皮瓣组织瘀血明显减轻，肿胀基本消退，弹性好转。TUNEL染色发现（图1），空白组大鼠皮瓣组织结构正常，核染色清晰、完整，未见明显凋亡细胞；模型组大鼠皮瓣组织结构紊乱，核膜破裂，染色质浓缩，可见大量凋亡细胞；消肿止痛合剂治疗后，大鼠皮瓣组织结构相对完整，略有水肿，核染色较清晰，可见少量凋亡细胞。实验结果提示FIRI可加重皮瓣坏死，而消肿止痛合剂可减轻FIRI造成的皮瓣坏死。2.2皮瓣组织蛋白质浓度测定及SDS-PAGE凝胶电泳通过SDS-PAGE凝胶电泳，验证制备的各组皮瓣组织总蛋白样品，未见明显蛋白质降解，电泳平行性好，蛋白条带清晰（图2）。蛋白浓度测定结果为：正常组（9.49 gL-1）、模型组（11.56 gL-1）、消肿组（7.43 gL-1），满足后续研究TMT-蛋白定量检测及其生物信息分析等实验的要求。2.3蛋白质鉴定、定量分析、聚类分析及差异表达蛋白质筛选蛋白质定量分析共鉴定到28012个唯一性肽段、5005个蛋白质，其中定量到4996个蛋白质。以上述实验方法（fold change 1.2且P 0.05）两两比较组间的显著性差异蛋白质结果。与正常组比较，模型组显著差异蛋白表达数共有85个，其中表达上调的蛋白有22个，表达下调的蛋白有63个。与模型组比较，消肿组显著差异蛋白表达数共有273个，其中表达上调的蛋白有141个，表达下调的蛋白有132个。在数据分析中，采用 Fold change和 P-value两个因素共同绘制火空白组模型组消肿组图1各组大鼠术后7天皮瓣形态及皮瓣组织TUNEL染色注：蓝色表示存活细胞核；绿色表示凋亡细胞核1989 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 山图，用于表现两组样本数据的蛋白质定量信息以及显著性差异（图 3，图 4）。并且对目标蛋白进行蛋白质聚类分析，以显示所筛选的目标蛋白质的合理性（图5，图6）。2.4生物信息学分析2.4.1差异蛋白GO富集分析FIRI造模后差异表达蛋白质GO功能富集分析，与正常组比较，通过分析模型组中差异表达蛋白GO功能注释及富集，发现其主要涉及细胞及细胞器定位建立、分子转运、单个有机体细胞定位、细胞器定位、免疫反应分子介质产生、免疫球蛋白产生、水解酶活性负调控等生物过程（Biological process，BP）；包括线粒体、线粒体膜部分、细胞质、胞外区域等细胞组分（Cellular compoent，CC）；参与酶活性抑制、肽酶调节、内切酶抑制、多巴胺受体结合等分子功能（Molecular function，MF）（图7）。消肿止痛合剂治疗后差异蛋白质GO功能富集分析，与模型组比较，通过分析消肿组中差异表达蛋白GO功能注释及富集，发现其主要涉及单有机体代谢、细胞组分的发生与结合、分解代谢、酸性物质代谢等生物过程；包括细胞器、细胞器膜部分、细胞质部分、囊泡、线粒体等细胞组分；参与催化、小分子结合、水解酶活化、同种蛋白结合、核苷酸调节等分子功能（图8）。2.4.2差异蛋白KEGG通路富集分析FIRI造模后差异表达蛋白质KEGG富集分析，与正常组对比，通过分析模型组的差异表达蛋白，富集到KEGG通路共8条（图9）。其中富集程度最高的为心肌收缩信号通路、其次为心肌收缩的肾上腺素能信号通路、细胞周期信号通路、氧化磷酸化信号通路、磷脂酶D信号通路等。这些信号通路涉及到生物体代谢、信号传导及细胞转化等过程。消肿止痛合剂治疗后差异表达蛋白质KEGG富集分析，与模型组对比，通过分析消肿组的差异表达蛋图4消肿组VS模型组蛋白质定量火山图图3模型组VS正常组蛋白质定量火山图图2SDS-PAGE凝胶电泳图谱1990 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化多组学技术研究MX-2MX-1MX-3ZC-1ZC-2ZC-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-1.5-1-0.500.511.5图5模型组VS正常组蛋白质聚类分析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roupGroupMXXZ-1.5-1-0.500.511.5图6消肿组VS模型组蛋白质聚类分析Number of genes01020304050Percent of genes0%20%40%60%immunoglobulin productionsalivary gland cavitationtube lumen cavitationproduction of molecular mediator of immune responseestablishment of localizationorganelle localizationtransportsingle-organism cellular localizationnegative regulation of calcium-mediated signalingnegative regulation of hydrolase activitymitochondrial membrane partintegral component of mitochondrial outer membranecytoplasmintrinsic component of mitochondrial outer membranecytoplasmic partextracellular spacecornified envelopeextracellular region partmitochondrial membraneA bandD2 dopamine receptor bindingenzyme inhibitor activitypeptidase inhibitor activityplatelet-derived growth factor receptor bindingpeptidase regulator activitycysteine-type endopeptidase inhibitor activityprocollagen galactosyltransferase activity dopamine receptor bindingendopeptidase inhibitor activitychloride-transporting ATP ase activityBiological ProcessCell ComponentMolecular Function图7模型组VS正常组GO功能富集分析1991 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 白，富集到KEGG通路共12条（图10）。其中富集程度最高的为代谢信号通路、其次为核糖体转录翻译等信号通路、蛋白酶体信号通路、细胞周期信号通路等。这些信号通路主要涉及到生物体代谢、遗传信息的加工处理及细胞转化过程。2.4.3共同差异蛋白分析将模型组VS正常组、消肿组VS模型组中相关差异蛋白数据进行分析，得出共同差异蛋白统计结果。在模型组中表达上调，但在消肿组中有表达下调的蛋白有3个；在模型组中表达下调，但在消肿组中表达上调的蛋白有13个；即模型组共有16个表达异常的蛋白在消肿止痛合剂干预后得到纠正（表1）。2.4.4差异蛋白相互作用分析在生物体中，各种蛋白质发挥其功能必须依赖于Number of genes050100150200Percent of genes0%20%40%60%80%organic substance catabolic processcatabolic processcellular component assemblysingle-organism catabolic processsingle-organism metabolic processcarboxylic acid metabolic processcellular component biogenesisoxoacid metabolic processmonocarboxylic acid metabolic processorganic acid metabolic processmembrane-bounded organellecytoplasmic partorganellecytoplasmintracellular membrane-bounded organellemitochondrionintracellular organellevesicleextracellular organelleextracellular exosomeGTPase activityGDP bindingsmall molecule bindingGTP bindingguanyl ribonucleotide bindingguanyl nucleotide bindinghydrolase activityidentical protein bindingcatalytic activitythiosulfate sulfurtransferase activityBiological ProcessCell ComponentMolecular Function图8消肿组VS模型组的GO功能富集分析0%1%2%3%4%5%Percent of genesACDEABAIAJCBDBECOxidative phosphorylation2(3.64e-02)Terpenoid backbone biosynthesis1(4.75e-02)Caffeine metabolism1(1.26e-02)Phospholipase D signaling pathway2(4.02e-02)Oocyte meiosis2(2.56e-02)Cell cycle2(2.89e-02)Cardiac muscle contraction3(8.10e-04)Adrenergic signaling in cardiomyocytes2(3.88e-02)A:MetabolismC:Environmental Information ProcessingD:Cellular ProcessesE:Organismal SystemsAB:Energy metabolismAI:Metabolism of terpenoids and polyketidesAJ:Biosynthesis of other secondary metabolitesCB:Signal transductionDB:Cell growth and deathEC:Circulatory system图9模型组VS正常组KEGG通路富集分析1992 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化多组学技术研究多种蛋白质的介导与调节，为了更加清晰的阐述不同蛋白之间的相互作用，借助STRING蛋白相互作用网络分析工具分析，得出PPI图（图11），发现在线粒体核糖核蛋白体（Ribosome）相关信号通路主要涉及到的差异蛋白或基因共有8个，分别为Rpl32、Rps11、Rpl35a、Mrpl4、Mrpl2、Mrpl32、Mrpl34、Mrpl28；在 蛋 白 酶 体（Proteasome）信号通路主要涉及到的差异蛋白或基因共有6个，分别为Psmb6、Psma4、Psmb1、Psma2、Psma6、Psmd8；在蛋白传出（Protein export）相关信号通路主要涉及到差异蛋白或基因 3 个，分别为 Srp19、Srp9、Spcs3。在蛋白酶体与线粒体核糖体相互作用中，Mrpl32与 Psma2之间存在相互作用，Mrpl34与 Psma40%2%4%6%8%10%Percent of genesABDA0AAABAEAGBABBBCDBMetabolic pathways24(3.48e-02)Butanoate metabolism2(3.43e-02)Starch and sucrose metabolism2(4.38e-02)Sulfur metabolism2(6.67e-03)Cysteine and methionine metabolism3(1.60e-02)Other glycan degradation2(1.65e-02)Spliceosome6(3.39e-03)Ribosome7(2.63e-03)Proteasome4(1.66e-03)Sulfur relay system2(3.71e-03)Protein processing in endoplasmic reticulum5(2.91e-02)Cell cycle4(4.38e-02)A:MetabolismB:Genetic Information ProcessingD:Cellular ProcessesA0:Global and overview mapsAA:Carbohydrate metabolismAB:Energy metabolismAE:Amino acid metabolismAG:Glycan biosynthesis and metabolismBA :TranscriptionBB :TranslationBC:Folding,sorting and degradationDB:Cell growth and death图10消肿组VS模型组KEGG通路富集分析表1模型组与消肿组的共同差异表达蛋白统计序号12345678910111213141516蛋白鉴定ID*F1LY19*B1WBY1*Q5XFV6P61983Q75Q41P97544M0RAB8F1LPB5A0A0G2K904P04631A0A0G2JTN8E9PSL1Q5HZE3D4AEG6P17220P21670蛋白名称RCG38820Cul1 protein39S ribosomal protein L3414-3-3 protein gammaMitochondrial import receptor subunit TOM22 homologPhospholipid phosphatase 3Ig-like domain-containing proteinKDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)endoplasmic reticulum protein retention receptor 3(Predicted)RCG56631,isoform CRA_dProtein S100-BATP synthase lipid-binding proteinSperm-associated antigen 5Thyroid hormone responsiveMitochondrial ribosomal protein L32Proteasome subunit alpha type-2 OSProteasome subunit alpha type-4 OS蛋白中文名称-Cul1蛋白质39S核糖体蛋白L3414-3-3蛋白线粒体传入受体亚基TOM22同源物磷脂磷酸酶3Ig类似物结构域蛋白KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)内质网蛋白受体3同源物CRA_dS100-B蛋白ATP合成酶脂结合蛋白精子相关抗原5甲状腺激素反应线粒体核糖体蛋白L32蛋白酶体亚单位-2型蛋白酶体亚单位-4型基因名称Upf1Cul1Mrpl34YwhagTomm22Plpp3-Kdelr3-S100b-ThrspMrpl32Psma2Psma4模型组VS正常组差异倍数1.2701.2191.2240.7880.8110.1930.3800.8190.7620.6140.6310.6950.6610.7830.8190.043P值0.0470.0060.0230.0460.0360.0020.0040.0400.0110.0010.0360.0320.0240.0420.0290.042消肿组VS模型组差异倍数0.7250.8150.6741.2461.2122.1841.9581.6901.3261.6742.5381.5981.7231.4881.3121.2202P值0.0230.0130.0480.0280.0170.0490.0150.0030.0370.0000.0040.0350.0340.0270.0180.036注：*表示模型组表达上调，但消肿组表达下调。1993 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第六期 Vol.25 No.6 存在相互作用。在蛋白酶体与蛋白传出相互作用中，Psmb1与Srp9存在相互关系。3 讨论 FIRI是皮瓣移植术后出现皮瓣坏死的重要原因，其过程是多种致病因素共同作用的结果，属于中医“血瘀”范畴。中药或者中药制剂在治疗FIRI时具有多靶点、全方位的治疗效果。消肿止痛合剂是由当归、川芎、桃仁、红花、赤芍、木香、泽兰等药物构成的复方制剂，具有“活血化瘀、消肿止痛”的功效，对于皮瓣移植术后患者疗效显著，并且课题组在前期研究中发现，消肿止痛合剂可以促进FIRI模型大鼠皮瓣的存活率6-8。蛋白组学技术通过对完整的细胞、组织、体液等样品的全部蛋白质进行相应分析研究，可用于药物研发过程中不同的阶段，在现代药物研发过程中具有重要作