基于TMA_FMO3_TMAO通路探讨参竹心康方治疗慢性心力衰竭模型大鼠的作用机制.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：第七批全国老中医药专家学术经验传承项目（国中医药人教函 号）；湖南省科技厅科研计划项目（）；湖南省中医药研究院科研计划联合重点项目（）作者单位：湖南省中西医结合医院，湖南 长沙 ；湖南中医药大学，湖南 长沙 通信作者：赵启，：基于 通路探讨参竹心康方治疗慢性心力衰竭模型大鼠的作用机制赵启赵梦雪袁清照【摘要】目的探讨参竹心康方对慢性心力衰竭模型大鼠的治疗作用及机制。方法将 只 级雄性 大鼠按随机数字表法分为对照组，模型组，参竹心康方低、中、高剂量组，每组各 只。慢性心力衰竭大鼠模型的制备选择腹主动脉缩窄法，治疗组予参竹心康方灌胃，余下两组予生理盐水灌胃，此过程持续 周。末次给药后用小动物超声心动图检查大鼠心功能，检测肝脏黄素单氧化酶 （，）表达水平，法测定血浆 型脑钠肽（，）、氧化三甲胺（，）及粪便中三甲胺（，）的表达，采用 高通量测序法检测大鼠结肠内容物的菌群特征。结果与对照组比较，模型组 、指标水平明显升高，水平明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方低、中、高剂量组 、指标水平明显降低，水平明显升高，差异有统计学意义（）。与对照组比较，模型组中 的含量明显升高，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方低、中、高剂量组中 的含量明显降低差异有统计学意义（）。与对照组比较，模型组中 的表达量明显升高，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方低、中剂量组中 含量明显降低，差异有统计学意义（）。与对照组比较，模型组大鼠血浆 、含量均明显升高，差异有统计学意义（）；药物治疗之后，参竹心康方低、中、高剂量组 、含量较模型组均明显降低，差异有统计学意义（）。与对照组比较，模型组 、指数值升高，指数值下降，差异有统计学意义（）。参竹心康中剂量组 、指数值回调与模型组比较，差异有统计学意义（）。肠道菌群的 、多样性分析表明，与对照组比较，模型组大鼠菌群丰度及多样性呈下降趋势，而参竹心康方组大鼠肠菌的丰富度及多样性均明显增加。结论参竹心康方对慢性心力衰竭大鼠的保护作用可能与改善肠道菌群紊乱、调控 通路及其相关蛋白的表达相关。【关键词】参竹心康方；慢性心力衰竭；肠道菌群；通路【中图分类号】【文献标识码】，（，；，）【】，；（）；（），（）（）；世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），【】；心力衰竭是一种致命的并且治疗费用昂贵的疾病，随着人口老龄化，全球负担将急剧增加 。因此，防治心衰刻不容缓。目前西医治疗心衰主要以强心、利尿、扩血管及改善心室重构以及拮抗神经内分泌激活为主 ，主要针对心脏本身症状，不能解决心衰常见的伴发症状，而中医药可以通过多方面、多靶点的相互作用对慢性心力衰竭进行调控和改善。因此，借助中医手段，探究治疗心衰的新角度或许成为未来发展趋势所在。相关研究证实，肠道菌群参与了包括心血管疾病在内的多种疾病的发展，贯穿心血管疾病发展的始终 ，慢性心力衰竭发生后，毛细血管收缩，内脏灌注减少，胃肠道出现缺血，表现为肠道通透性增高，继而导致肠道细菌移位和肠源性内毒素血症。小肠是食物中胆碱转运吸收的场所，但若饮食中的胆碱超过了小肠中吸收上限，胆碱就会到达大肠，并被肠道菌种中的 酶代谢为 ；被吸收入血后，在肝脏 的氧化作用下转变为 。基于众多 研 究 提 出 了“心 衰 肠 道 假说”，认为疾病状态下，肠道内菌群的构成、功能、形态、代谢产物继而发生改变，肠道细菌易位、致病菌的增加和循环内毒素水平的上升会加速心力衰竭进程中的炎症及免疫反应，促进心肌细胞的凋亡，加重心力衰竭 ，。参竹心康方是湖南省名中医喻正科主任医师的临床经验方，既往多项研究均证实参竹心康方对慢性心力衰竭疗效显著 ，本课题组在前期预实验中已经初步证实参竹心康方的治疗效果与调节肠道菌群结构有关，但机制尚不明确。因此，本研究以肠道菌群代谢产物为切入点，明确参竹心康方对慢性心力衰竭大鼠肠道菌群及代谢产物的影响，探讨其对慢性心力衰竭大鼠疗效的作用机制。材料与方法 材料 动物 级雄性 大鼠 只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：（京），动物合格证号：（湘）。饲养条件：温度 ；湿度 。通风良好、环境安静，每日饲以颗粒全价饲料，饮清洁自来水。本研究经湖南省中西医结合医院伦理委员会审核批准（审批号：）。药物参竹心康方：党参 ，麦冬 ，炙黄芪 ，五味子，玉竹 ，丹参 ，田三七 ，黄精 ，葶苈子 ，姜黄 ，泽兰 。免煎颗粒剂，以上中药由湖南省中西医结合医院提供。主要试剂与设备大鼠三甲胺（）试剂盒、大鼠氧化三甲胺（）试剂盒（上海酶联，货号：）；大鼠脑钠素 脑钠尿肽（）试剂盒（江西宸曦，货号：）；细胞裂解液（北京普利莱，货号：），蛋白定量试世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，剂盒（）（，货号：），丙烯酰胺（）（，货号：），四甲基乙二胺（）（阿拉丁，货号：），缓冲液（）（，货号：），缓冲液（）（，货号：），过硫酸铵（）（天津致远），甘氨酸（）（，货号：），十二烷基硫酸钠（）（西陇科学，货号：），（，货号：），膜（，货号：），牛血清白蛋白（）（索莱宝，货号：），超敏发光液（赛默飞，货号：），封闭用脱脂奶粉（北京普利莱，货号：），内参一抗：（，），二抗：（）（，），目的一抗：（，）、（，）、（，），二抗：（）（，）。全自动酶标仪（北京六一，）；药品阴凉 冷藏柜（博津，）；电热恒温培养箱（上海一恒，）；小动物超声显影仪（加拿大 公司，型）；高速冷冻离心机（上海卢湘仪，）；蛋白垂直电泳仪（北京六一，）；小动物人工呼吸机（北瑞未来，）；心电图机（深圳市凯沃尔，）；超高灵敏度化学发光成像系统（上海伯乐生命医学，）；型高通量测序仪（美国 公司）。方法 分组及造模 只大鼠适应性饲养 周后，按随机数字表法分为对照组，模型组，参竹心康方低、中、高剂量组，每组各 只。采用腹主动脉缩窄法，制备模型。实验大鼠腹腔注射 戊巴比妥进行麻醉，打开腹腔，肾动脉分叉上方游离腹主动脉约 ，将腹主动脉平行放置 号钝针头，一同结扎后使肾脏出现缺血，抽出针头，使腹主动脉部分狭窄，检测狭窄处内径小于 。手术以后连续 均给予造模组大鼠腹腔注射 万 青霉素。周以后，左心室射血分数（，）则建模成功 。实验结束时，模型组死亡 只，中高剂量组各死亡 只，低剂量组死亡 只。给药方法大鼠给药剂量根据体表面积法进行折算 ，以成人剂量的大鼠等效剂量为参竹心康方中剂量组，成人临床推荐用量为 ，大鼠等效量按成人的 倍计算，（），参竹心康方低、高剂量组所用药分别为中剂量组药物浓度的 倍及 倍，即 （）、（）。造模 周后第 天开始对低、中、高剂量组动物进行治疗，余下两组以生理盐水灌胃，次 ，灌胃量均为 （），整个过程持续周。观察指标 心脏彩超测定药物干预结束后，完善心脏超声检查。予 戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，剂量选择：。麻醉起效后，对手术台上仰卧位固定大鼠行气管插管术，正压人工通气（频率：次 ，潮气量：）。将连接 生理记录仪的 导管插入大鼠右侧颈总动脉，选用 软件（公司），获取左心室射血分数（，），左室舒张期内径（，）、收缩期内径（，）四项指标信息。检测 表达水平在大鼠肝脏组织中加入 裂解液充分研磨，以离心半径 ，转速 离心 ，将缓冲溶液放入上清液中，煮沸 ，保存。用 蛋质定量试剂盒检测细胞上清中蛋白质浓度。制胶、蛋白加样（孔），分离蛋白；转膜，约 ；室温下振荡封闭 ；加入 （）一抗，过夜；清洗后加入二抗，摇床孵育 ；清洗后 显影，拍照后计算浓度。测定实验结束予 戊巴比妥钠（）对大鼠进行腹腔注射麻醉，于大鼠腹主动脉处采血，将留取的血样标本进行离心，以离心半径 ，转速 离心 ，取出血清于冰箱中保存（），按照试剂盒说明书测定血浆 和 含量，取大鼠新鲜粪便按照试剂盒说明书用于 检测。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，统计学方法采用 统计学软件和 统计学软件分析数据。以均数 标准差（）表示。两组之间定量数值比较采用独立样本 检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，以 为差异有统计学意义。结果 各组大鼠心功能比较实验结束时，模型组死亡 只，中高剂量组各死亡 只，低剂量组死亡 只。与对照组比较，模型组 、指标水平明显升高，水平明显降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方中、高剂量组 、指标水平明显降低，参竹心康方低、中、高剂量组 水平明显升高，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 各组大鼠心功能比较（）组别 （）（）（）对照组 模型组 参竹心康低剂量组 参竹心康中剂量组 参竹心康高剂量组 注：与对照组比较，；与模型组比较，各组大鼠 表达水平比较与对照组比较，模型组中 的含量明显升高，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方低、中、高剂量组中 的含量明显降低差异有统计学意义（）。结果见表 。表 各组大鼠 表达水平比较（）组别 （）对照组 模型组 参竹心康低剂量组 参竹心康中剂量组 参竹心康高剂量组 注：与对照组比较，；与模型组比较，各组大鼠 比较与对照组比较，模型组中 的表达量明显升高，差异有统计学意义（）；与模型组比较，参竹心康方低、中剂量组中 含量明显降低，差异有统计学意义（）。结果见表 。各组大鼠 、含量比较与对照组比较，模型组大鼠血浆 、含量均明显升高，差异有统计学意义（）；药物表 各组大鼠 比较（）组别 （）对照组 模型组 参竹心康低剂量组 参竹心康中剂量组 参竹心康高剂量组 注：与对照组比较，；与模型组比较，治疗之后，参竹心康方低、中、高剂量组 、含量较模型组均明显降低，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 各组大鼠 、含量比较（）组别 （）（）对照组 模型组 参竹心康低剂量组 参竹心康中剂量组 参竹心康高剂量组 注：与对照组比较，；与模型组比较，各组大鼠肠道菌群分布比较 各组大鼠 多样性分析与对照组比较，模型组 、指数值升高，指数值下降，差异有统计学意义（）。给 药 后，参 竹 心 康 各 剂 量 组 、指数值回调，其中中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（）。结果见表 。表 各组大鼠 多样性分析组别 对照组 模型组 参竹心康低剂量组 参竹心康中剂量组 参竹心康高剂量组 注：与对照组比较，；与模型组比较，多样性非加权 结果基于 距离、距离和 距离的主坐标分析（，），考察大鼠肠道菌群 多样性的差异。本研究中，对照组与模型组菌群有组间差异，参竹心康低剂量、中剂量、高剂量组与模型组菌群存在较大差异，与对照组的差异较小，差异有统计学意义（）。结果见图 。讨论肠道菌群作为与人体相互依存且数量庞大的细菌群，与宿主相互影响，是一个复杂的生态系统。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 多样性非加权 结果正常情况下，肠道菌群发挥着增强机体免疫、抗菌等作用，当各种原因导致肠道屏障功能受损时，细菌数量和比例的变化或空间位移会导致细菌易位，由肠道菌群和内毒素易位引起的内源性感染和内毒素血症是炎症反应的起源 。越来越多证据表明，肠道菌群及其代谢产物（如短链脂肪酸、脂多糖、胆汁酸和 ）通过激活多种信号通路来影响宿主生理过程，在介导和调节心力衰竭发生发展以及转归方面具有重要意义 。途径与心力衰竭预后不良之间存在明显的联系 ，。肠道微生物群可以将多种膳食营养素转化为 ，进入循环系统后被含 氧化为 ，是参与将 转化为 的高效转化酶 。参与了包括诱导炎症反应，激活血小板聚集等多种生物过程，与多种疾病的发生发展密不可分 。研究表明，通过调节 信号通路促进了心肌肥大和纤维化 ；通过直接激活 信号传导，上调下游的主动脉内皮细胞黏附蛋白等途径，导致血管平滑肌细胞的炎症 ；炎症因子 的分泌水平与 血浆水平升高呈正相关，水平的升高会强化其对中性粒细胞的趋化作用，加重对心肌细胞的损害 。心衰为病，病位涉及五脏，以心气亏虚为本，后天脾土功能失调所生的“痰”“饮”“瘀”等病理产物为关键 ，脾土得健，脏腑气血阴阳调和，正气乃充，这与现代医学研究中肠道菌群对机体免疫能力的调节作用有异曲同工之妙。参竹心康方针对慢性心力衰竭常见之气阴两虚，瘀血内阻的病机组方，以党参、麦冬为君，相辅相成，益气养阴。黄芪、五味子补益心肺，配伍党参助心肺鼓动血脉；玉竹与麦冬合用，更滋心阴，丹参、三七活血化瘀，黄精补气养阴，以上六味同为臣药。红花、泽兰佐助臣药丹参、三七活血通脉，葶苈子泻肺平喘利水，以上三味共为佐药。诸药合用则中气鼓舞，心肺气血充沛，气行则瘀血化，全方共奏气血同治、补泻兼施之功 。结合 及超声心动图结果，进一步证实了参竹心康方对慢性心力衰竭大鼠的保护作用。结合 多样性分析结果，与对照组比较，心衰大鼠肠道细菌的丰度和多样性增加。本课题组前期研究不同分组中大鼠肠道菌群组成存在差异，模型组特有的 数最多，为 个，对照组 为 个，低剂量组 为 个，中剂量组 为 个，高剂量组 为 个，所以较高的细菌丰度和多样性并不代表心衰大鼠具备了健康的菌群结构，由此推测其肠道菌群丰度和多样性的增加可能是由于各种有害细菌的过度繁殖所致。给予参竹心康方后，多样性分析指数回调，中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（）。结合 多样性非加权 结果，说明心衰大鼠的肠道内菌群发生了紊乱，而参竹心康方有助于恢复心力衰竭大鼠肠道细菌的结构。在对肠道菌群代谢产物的分析中可以得出，模型组大鼠肠道菌群发生紊乱的同时，其代谢产物 、及肝脏 水平均明显升高，经治疗后上述代谢产物水平明显下降。促进心肌肥大和纤维化的过程与对 信号通路的调节密切相关，通过增加 的表达，促进 的磷酸化起到诱导心肌凋亡的作用，结合既往实验研究 ，参竹心康方能够显著抑制慢性心力衰竭大鼠心肌 蛋白的表达，由此推测，参竹心康方可能是通过调整大鼠肠道菌群结构，改善 通路及相关蛋白的表达实现对慢性心力衰竭大鼠的保护作用。综上，参竹心康方能够显著改善慢性心力衰竭 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，大鼠的心功能，其机制可能与纠正肠道菌群紊乱结构并调控 通路及其相关蛋白的表达密切相关，但其具体机制有待进一步深入研究。参考文献 顾东风，黄广勇，何江，等 中国心力衰竭流行病学调查及其患病率 中华心血管病杂志，（）：董肖，凌洁，刘斌，等 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