DB15_T 1767—2019 马、驴冷冻精液(内蒙古自治区).pdf

TCS 07.080 B 40 DB15 内古军协古自主J口区地方标准DB15/T 1767-2019 代替蒙DB476.1-88 马、驴冷冻精液Frozen stallion(donkey)semen 2019-12-05发布2020-01-05实施内蒙古自治区市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替蒙DB476.1-88 马、马户冷冻精液)0 本标准与蒙DB476.1-88相比主要变化如下:增加了规范性引用文件(见第2章);一一增加了检验规则(见第5章);增加了标志、标签和随行文件(见第6章);一一修改了规格与质量(1988年版的第2章:本版的第4章);修改了检查方法(1984年版的第3章:本版的附录A);一一修改了包装、运输和贮存0984年版的第4章:本版的第7章);增加了规范性附录马耳户冷冻精液质量检验方法(见附录A);一一增加了规范性附录种公马驴的品种代号(见附录BL本标准的附录A、附录B均为规范性附录。本标准由内蒙古自治区畜牧工作站提出。本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会CSAM/TC19)归口CDB15/T 1767-2019 本标准主要起草单位:内蒙古自治区畜牧工作站、鄂温克旗科兴马业发展有限公司。本标准主要起草人:阿娜尔、海龙、红海、苏雅、陈龙梅、自丹丹、高博、葛根、安乐、金伟、格力格桑。I DB15/T 1767-2019 马、驴冷冻精液1 范围本标准规定了马、马户冷冻精液的命名、技术要求、检验规则、标志、标签和随行文件、包装、运输和贮存C本标准适用于各品种马、驴冷冻精液产品。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不住日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.2 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、贮存和运输3 技术要求3.1 新鲜精j夜色泽乳白色或淡黄色。桔子活力(马二三60%、驴二三65%)，精子密度二三6000万个/mL.精于畸形率豆15%。3.2 细管冻精外观细管无裂痕，两端封口严密，标识清晰，信息齐全。3.3 剂型、剂量中型二三0.40mL 3.4 每剂量;东精解冻后指标3.4.1 精子活力马兰30%(即二三0.30)，马户主35%(即主0.35)。3.4.2 前进运动精子数中型二三3000万个。3.4.3 精子畸形率马王三25%,驴20%。3.4.4 菌落数:s;1000个。DB15/T 1767-2019 4 检验规则4.1夕|、观用目测法。4.2 剂量按第A.1章的方法。4.3 解冻后每剂量精液质量解冻方法及桔子活力、前进运动桔子数、椅子畸形率、菌落数的检验按照第A.2章第A.5章规定的方法。4.4 检验分类4.4.1 常规检验对马、驴冷冻精液的单项目检验，是型式检验的一部分，主要是在生产的冻精入库前和售出使用时的检验。4.4.2 型式检验对马、马户冷冻精液全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督抽样检验时选定项的检验。4.5检验项目4.5.1 常规检验本标准中3.2和3.4.1规定。4.5.2 型式检验本标准中3.23.4规定。4.6 判定4.6.1 常规检验样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。4.6.2 型式检验样品中任何一项目检验未达到本标准中要求的规定，则判定为不合格。4.6.3 岁Ij定依据其结果应分别符合本标准中3.23.4的规定。5 标志、标签和随行文件5.1 标志、标签2 DB15/T 1767-2019 5.1.1 细管标记细管冻精应在管壁上依次印刷以下内容，并且印制标识要清楚:生产主占名、公畜品种、生产日期;或批次、公畜号。5.1.2 内标签在贮精营、灭菌纱布袋上标注马、驴个体号、品种、细管数量。5.1.3 外标签具体可参照GB/T30396的规定执行。5.2 随行文件马、驴冷冻精液产品可提供的随行文件包括:系谱、检疫证明、冷冻精液检验合格证明、生产者的生产经营许可证等。6 包装、运输和贮存6.1 包装细管冷冻精液包装应在140C以下的环境中进行。将细管分类装入贮精管，包装后的细管冷冻精液其棉塞端应朝向贮精营的底部，不得倒置。再用灭菌纱布袋将装有冷冻精液的贮精管包装起来，一个灭菌纱布袋一个个体。6.2 运输细管冷冻精液运输过程中要有专人负责，贮存容器不得横倒及碰撞和强烈振动，保证冷冻精液始终浸在液氮中O6.3 贮存细管冷冻精液应浸没于液氮生物容器的液氮中。冷冻精液由一个液氮生物容器转移到另一液氮生物容器时，在液氮生物容器外停留时间不得超过3s。取存冷冻精液后要及时盖好液氮生物容器塞。具体可参照GB/T30396的规定执行。3 DB15/T 1767-2019 附录A(规范性附录)马、驴冷冻精液质量检验方法A.1 剂量检查A.1.1 主要器材小试管、剪刀、1.0 mL吸管、捡卵仪或洗耳球、细管专用推针。A.1.2 检查方法取两支细管冻精自然解冻后剪去封口端，用细管专用推针把精液推入一个小试管内，用1.0 mL吸管准确吸取精液，并检测其精液总量。A.1.3 计算两支冻精的剂量平均数为样品的剂量，按式(A.1)计算:Q二n/2.(A.1)式中:Q 剂量值，单位为毫升(mL);N一一两支样品，总剂量，单位为毫升(mL);A.2 精子活力检查A.2.1 主要器材相差显微镜或相差显微系统、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片(规格18mm X 18 mm)、显微镜保温箱或恒温装置、移液器。A.2.2 检查方法取二支细管冻精分别直接置于37oC水浴中解冻30s，取出细管用吸水纸擦干水珠，挤入5.0mL 试管内泪匀，用移液器取精液10L置于载玻片的一端，摇匀精液，取10止精液置于载玻片的另一端，盖上盖玻片后立即在(200400)倍相差显微镜下观察活力，也可通过相差显微系统在显示器上观察活力，此时载物台温度应保持3TCo每一样片观察盖玻片中央区域的活力，分别得出第一样片和第二样片活力nj和ll:2o4 DB15/T 1767-2019 A.2.3 计算二个视野活力评定价值的平均数按式CA.2)计算:式中:M一一活力;nl一一第一样片桔子活力;n2 第二样片精子活力。A.3 每剂量前进运动精子数检查A.3.1 主要器材M二(nl+n2)/2(A.2)血球计数板、血盖片、血色素管、移液器、1mL吸管、小试管、计数器、显微镜或显微系统、3.0%氧化铀溶液。A.3.2 检查方法细管精液用血色素管!lG移液器吸取10L解冻精液(也可使用第B.2章己检查后的样品)，注入盛有0.99mL的3.0%氧化铀溶液的试管内，混匀，使之成为100倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用移液器吸取10L稀释精液于血盖片边缘，吏稀释精液自行流入计数室，均匀充满，不允许有气泡，用同样方法为另一端计数室加样。静置5分钟后在显微镜下或显微系统显示器上观察计数上下两个计数室各5个中方格的精子数，取平均值。A.3.3 计算a)每剂量中精子数二5方恪中的精子数X5C p计数室25个方格的总精子数)X 10 C p 1 mm1内的精子数)X 1000 C即每mL精液的精子数)X 100(p稀释倍数)X剂量值上式简化为:每剂量中精子数二5个方格中的精子数X500万(细管)X剂量值b)每剂量中呈前进运动桔子数按式CA.3)计算:C=sXmCA.3)式中:C 每剂量中前进运动桔子数，单位为个:S一一每剂量中精于数，单位为个:m 活力，%;A.4 精子畸形率的检查A.4.1 主要器材显微镜、载玻片、血球分类计数器、移液检、蒸t自水、姬姆萨染料、磷酸二氢铀、磷酸氢二铀、甲自主、甲醇、甘泊、伊红苯肢黑染液等所用试剂为分析纯。5 DB15/T 1767-2019 A.4.2 试剂自己串IJA.4.2.1 磷酸盐缓冲液磷酸二氢铀(NaH2P04.2H20)磷酸氢二铀(NaHP04 12H20)双蒸馆水定容至100mL 0.55 g 2.25 g A.4.2.2 中性福尔马林固定液40%甲醒HCHO(使用前经碳酸使中和过滤)8.0 mL 磷酸二氢铀(NaH2POl.2H2 0)0.55 g 磷酸氢二号内(NaHP01.12H2 0)0.25 g 用O.89%氧化铀约50.0mL 溶解后加入8.0mL中和后的甲眶，再加0.89%氧化铀溶液定容至100.0 mL。A.4.2.3 姬姆萨原液姬姆萨染料10.0 g 66.0 mL 甘;由【CH5(CH).1 甲醇(CH30H)66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中保温继续溶解4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中代用，贮存时间越久染色效果越好。A.4.2.4 姬姆萨染液姬姆萨原液2.0 mL 磷酸盐缓冲液3.0 mL 蒸馆水5.0 mL 现配现用O也可购买商品化的姬姆萨染液，按产品说明使用。A.4.2.5 伊红苯服黑染液伊红y(颜色指数45380)染料苯肢黑染料拧棱酸f内3.3 g 20.0 g 1.5 g 蒸馆水300.0 mL 将苯肢黑染料加入蒸馆水中，边搅拌边加热，直至完全溶解，然后加入伊红染料，边搅拌边加热，溶解过程中要避免沸腾。调整pH值至6.87.0，染液保存数天后进行过滤，储存于暗色密封的玻璃瓶中持用，在E常温下，保存期6个月左右。也可购买商品化的伊红苯肢黑染液，按产品说明使用OA.4.3 制片、染色、镜检、计算精液解冻见A.2，允许同时使用桔子活力检查解冻的样品。6 DB15/T 1767-2019 A.4.3.1 抹片染色法抹片:取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片里35。夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干(约30min)，每样品制作两个抹片。染色:将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液i商于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h后用洁水缓缓冲去染液，晾干待检。镜检:将制备好的抹片在显微镜(400倍600倍)下观察，并用血球分离计数器技术，每个抹片观察200个以上的精子(分左右两个区)，取两片的平均值，两片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片O精子畸形率按式(A.4)计算:A=(Aj/S)X100 (A.4)式中:A 精子畸形率，如A1一一精子畸形数，单位为个;S 精子总数，单位为个。A.4.3.2 染色抹片法染色:用移液器取5L10J.lL伊红苯肢黑染液滴于载玻片的一端，另取等量的经固定后的样品滴于染液上，移i夜器吸放数次使样品与染液混匀成混合液。抹片:把凹玻片放置于泪合液前端，下压凹玻片使混合液均匀地分布于二玻片之间，调整凹玻片与磨砂载玻片间的角度，沿载玻片的表面拖拉混合液成涂片，晾干待检。镜检在1000倍油镜下观察，计算方法同A.4.3.10 A.5 菌落数的检查A.5.1 主要器材生化培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、90mm培养皿、水浴锅、隔菌塞、记号笔、放大镜、蒸馆水等。A.5.2 培养基的配制使用营养琼脂培养基，其质量应符合GB4789.20 A.5.3 检查方法灭菌平皿事先标号，细管冻精37oc水浴解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭菌平皿内，把己凉至50oc左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平皿内，每皿约15mL，并转动平皿使精液泪合均匀，同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置37oc恒温箱内培养48h取出，计数平皿内菌落数，取两支做两个平皿，取平均值。7 DB15/T 1767-2019 A.5.4 计算所检细管样品的菌落数按式CA.5)计算:B二Clll十ll2)/2 (A.5)式中:B一一菌落数，单位为个:III一一第一平皿菌落数，单位为个:ll2 第二平皿菌落数，单位为个。8 B.1 原则和方法附录B(规范性附录)马、驴品种代号DB15/T 1767-2019 以马、驴品种汉语名称第一和第二个字的汉语拼音的第一字母组合，字数较多的包含第二、第四个字母组合。驴品种最后加L。B.2 品种代号品种代号见表B.1o表B.1 种公畜品种代号公畜品丰1品丰1代号公畜品中l品丰i1号蒙古马MG 锡林郭勒马XLGL 阿巴嘎黑马ABG 科尔沁马KEQ 鄂伦春马ELC 纯血马CX f易尼;可马XNH!车伦驴KLL 二河马SH f5JiI驴DZL 9