DB37∕T 3128.2—2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第2部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术(山东省).pdf

TCS 65.020.30 B41 DB37 山东省山巳ET且，万标准DB37/T 3128.2一-2020|群禽腺病毒感染诊断技术第2部分:血清4型|群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术Diagnostic techniques for fowl adenovirus group 1 Part 2:Detection method on fowl adenovirus group 1 serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR 2020-06-08发布2020-07一08实施山东省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准白山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准白山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东农业大学。DB37/T 3128.2-2020 本标准主要起草人:刁有祥、唐熠、杨晶、王j鸣志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。I DB37/T 3128.2-2020|群禽腺病毒感染诊断技术第2部分:血清4型|群禽腺病毒感染PCR和荧光定量PCR诊断技术1 范围本标准规定了血清4型I群禽腺病毒聚合酶链式反应(PCR)与实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法的范围、规范性寻|用文件、术语和定义、实验室要求、样品、结果判定等。本标准所规定的血清4型I群禽腺病毒PCR与实时荧光定量PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清4型I群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊液血清4型I群禽腺病毒核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 血清4型l群禽腺病毒Fowl adenovirus group 1 Serotype 4 是号|起禽心包积水肝炎综合征的病原，主要造成3周龄5周龄家禽突然死亡，并伴随有Jl;包积水平日肝炎。3.2 实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR(qPCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算持测样品模板的初始浓度。4 实验室要求4.1 环境4.1.1 实验室符合GB19489和GB!T27401要求，实验室必须为生物安全II级CBSL-2级)及以上实验室。DB37/T 3128.2-2020 4.1.2 从事PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4.1.3 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃坡处理公司做处理。4.2 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训1。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉PCR与qPCR检测结果的判断方法。4.3 仪器设备4.3.1 生物安全柜。4.3.2 PCR仪(温度差小于0.3OC)。4.3.3 台式低温高速离心机(最大转速为15000rpm)。4.3.4 电泳仪。4.3.5 电泳槽。4.3.6 紫外凝胶成像仪。4.3.7 冰箱2oC8 oC。4.3.8 冰柜-20oC 0 4.3.9 微量移液器(最大量程分别为10L、20L、100L、1000L)，带滤芯的枪头。4.3.10 电子天平:精度为O.001 g。4.3.11 电磁炉或微波炉。4.3.12 荧光定量PCR仪。4.4 试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T6682规定的一级水。4.4.1 DNA提取试剂盒。4.4.2 rTaq DNA聚合酶5U/L。4.4.3 10XPCR缓冲液。4.4.4 clNTPs:2.5 mmol/L,10 mmol/L 4.4.5 荧光定量PCR试剂盒。4.4.6 1.5%琼脂糖凝胶，见附录A.1o4.4.7 1 XTAE缓冲液，见附录A.2o4.4.8 澳化乙皖(10g/L)，见附录A.304.4.9 核酸电流加样缓冲液，见附录A.40 4.4.10 DNA分子量标准，要求在100bp2000 bp之间，有5条以上的指示条带。4.4.11 阳性对照标准品，己知的血清4型I群禽腺病毒SPF鸡胚尿囊液。4.4.12 阴性对照标准品，经高压灭菌的超纯水。2 DB37/T 3128.2-2020 4.4.13 PCR检测所需引物:一一上游引物F:5-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3 一一下游引物R:5-TTTACACGGCGTTGCCTGT-3，扩增片段长度为568bp，引物浓度为100mol/L。4.4.14 荧光定量PCR检测所需引物:一一上游引物1983F:5-CGTCAACTTCAAGTACTC-3 一一一下游引物2068R:5-AGAGGATGCTCATGTTAC-3 一一探针P:5 FAM-CCTACTCAGATGGAGGCTTCTACC-TAMRA3，扩增片段长度为86bp，引物浓度为100mol/L。5 样品5.1 样品采集与运输采集疑似血清4型I群禽腺病毒感染死亡家禽的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理;活禽采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4oc，时间不超过24ho 5.2 样晶保存5.2.1 样品应放在含有抗生素的pH值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液伸出，附录A.5)内。5.2.2 抗生素的选择应视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青毒素(2000IU/mU、链霉素(2mg/mU、庆大霉素(50g/mU和制霉菌素0000IU/mU，加入抗生素后pH值应调至7.O 7.4。5.2.3 在室温放置1h2 h内样品应尽快处理，不能处理的可在4oc存放，不超过24h。5.2.4 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于20oc低温条件下保存，不超过2wk;-70 oc贮存不超过30d。5.3 样品处理5.3.1 在生物安全柜中进行样品处理，取10g20 g样品放入灭菌的研钵中磨碎。5.3.2 咽喉或泄殖腔拭子，置于200L含有青霉素(2000IU/mU、链霉素(2mg/mU、庆大霉素(50 g/mU和制毒菌素(1000IU/mU的pH值7.07.4等渗磷酸盐缓冲液中。5.3.3 研磨充分的组织用含青霉素(2000IU/mU，链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50阳/mU和制霉菌素0000IU/mUpH值7.07.4的等渗PBS溶液配制成10%20%(g/mU的悬液。样品经8000r/min 离心10mi口，取上洁液作为材料，进行后续试验。5.4 对照设置每次检测，用相应的阳性对照标准品或阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。5.5 DNA 提取按照DNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照组的DNA。提取的DNA应立即检测，否则应置于70oc 冻存。5.6 PCR反应5.6.1 PCR的反应体系3 DB37/T 3128.2-2020 lOXPCR Buffer 2.5L，dNTPs(2.5 mmol/L)2L，引斗匆F(100mo1/U和R(100mo1/U 各o.5队，模板DNA3队，rTaq DNA聚合酶o.25 L，加超纯水至25L 5.6.2 PCR反应条件94 oc预变性5min;94 oC 30 s,53 oC 30 s,72 oC 30 s,30个循环72oC延伸10mino 5.6.3 琼脂糖;疑胶电泳PCR反应结束后，取9L样品与1L核酸电泳加样缓冲液泪匀后，与1.0%琼脂糖凝胶中电泳，在位于i疑胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5V/cm电压，电泳30mino电泳后，置于凝胶成像仪观察，根据分子量标准判断PCR扩增产物大小。5.7 实时荧光定量PCR反应5.7.1 实时荧光定量PCR反应体系Premix Ex Taq(Probe qPCR)10L，Rox Reference Dye II O.2L，引物1983F(100川lO1/U和引物2068R(100mo1/U 各O.4 L，探针P(100mo1/U O.4 L，模板DNA2L，加ddH0至20L。反应液混匀后置于ABI7500型荧光定量PCR仪进行扩增。5.7.2 实时荧光定量PCR反应条件95 oC预变性30s;95 oC变性5s,62 oC退火32s(收集信号)，进行40个循环。6 结果判定6.1 阳性对照出现相应大小的扩增条带或扩增曲线，且阴性对照无扩增条带豆豆扩增曲线时，判定检测结果有效。6.2 血清4型I群禽腺病毒PCR产物大小为568bp。阳性对照出现568bp扩增条带，阴性对照无条带出现(号|物二聚体除外)时试验成立。被检样品出现568bp条带为血洁4型I群禽腺病毒阳性，否则为阴性(附录B.1)。6.3 血清4型I群禽腺病毒荧光定量PCR阳性对照出现S型扩增曲线，且Ct值小于35，阴性对照无S型扩增曲线，且Ct直大于35时试验成立。被检样品出现S型扩增由线，且Ct值小于35为血清4型I群禽腺病毒阳性，否则为阴性(附录B.2)。4 DB37/T 3128.2-2020 A.1 1.5%晴、脂糖;疑胶的配制附录A(规范性附录)相关试剂的配制琼月旨糖1.5 g 0.5 XTAE电泳缓冲液加至100 mL 微波炉中完全融化，持冷至500C600C时加入澳化乙链CEB)溶液5J.lL.摇匀。倒入板上凝固后，取下梳子，备用。A.2 1xTAE电泳缓冲液的配制A.2.1 自己市IJO.5mo I/L乙二肢四乙酸制(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)乙二肢四乙酸铀CEDTA-Na2 2H0)灭菌双茶水氢氧化铀调pH至水力日至用于配制A.2.2中的50 xTAE电泳缓冲液A.2.2 自己市IJ50 xTAE电泳缓冲液在基甲基氨基甲炕CTris)冰醋酸0.5mol/L乙二版四乙酸铀CEDTA-Na2)溶液CpH8.0)水力日至用于配制A.2.3中的1xTAE电泳缓冲液A.2.3 自己市IJ1xTAE电泳缓冲;在50XTAE电泳缓冲液水力日至A.3 漠化乙链的配制误化乙链水加至A.4 核酸电泳加样缓冲液(10 x)聚黑糖灭菌双亲水18.61 g 80.0 mL 8.。100 mL 242 g 57.1 mL 100 mL 1000 mL 20 mL 1000 mL 20 mg 20 mL 25 g 100 mL 5 DB37/T 3128.2-2020 I臭酌蓝o.19 二甲苯青O.1 g A.5 磷酸盐缓冲液(p邸，0.01mol/L pH 7.4)NaC1 8.0 g KC1 0.2 g KH2P04 0.2 g Na2HP04.12H20 0.2 g 水力日至1000 mL 6 B.1 PCR产物大小对照B.2 荧光定量PCR扩增由线制F11101 咀ooJtll.101 Raaw 国!01.s(M)t 101 E回FF司O刷rs 1 篇阳恼叫am附录B(规范性附录)试验结果图示M 1 N lOObp M为分子量标准1为阳性对照，N为阴性对照图B.1 PCR产物大小对照图匾皿且皿.Itr、.,.DB37/T 3128.2-2020 a i 10刊12忡饵t5帽t1由咽21I21:n:!ol7722i且o3 12咽.，l6 4 17 Ja四.j;)1为阳性对照，2为阴性对照图B.2 荧光定量PCR扩增曲线7