生物催化技术知识点总结.doc

第一章 绪论生物技术、生物催化和酶的定义生物技术是应用自然科学及工程学原理，依靠生物作用剂（biological agent）的作用将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术”。这里所谓的生物作用剂（biological agent）是指酶、整体细胞或生物体，一般也称生物催化剂。 医药生物技术: 1982年重组人胰岛素上市 农业生物技术: 1996年转基因大豆、玉米、油菜相继上市 工业生物技术: 生物钢、聚乳酸相继上市1、工业生物技术定义：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务。工业生物技术是生物技术的重要组成。核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化。发展空间： 提升传统产业 生物能源 环境生物技术 生物材料2、生物催化（Biocatalysis)定义：利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。生物催化是工业生物技术的核心技术德国德固赛、德国BASF、荷兰DSM、瑞士罗氏Roche、丹麦诺维信生物催化发展的主要推动力 新产品需求 (社会压力)-健康：医药、检测-日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料 环境 (法律法规压力)绿色化学、能源、温室效应 新发现或基础研究 (技术压力）基因工程 /定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学 得益/成本降低 (商业压力)-生物分离生物催化工程的目标 开发新生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低 改善性能: 稳定性, 活性，溶剂兼容性 开发分子模型: 新酶的快速重新设计3、当前生物催化的研究热点 新酶或已有酶的新功能的开发 根据已有底物开发新的酶反应 利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能 利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂 利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系 体内或体外合成的多酶体系 克服底物和产物抑制 精细化工品或医药合成技术的放大 辅因子再生 生物催化剂的修饰 生物催化剂的固定化4、酶工程就是将酶或者微生物，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。世界三大酶制剂公司 诺维信（Novo）（丹麦） 杰能科（Genencor International）(美国） DSM(荷兰）5、 酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。6、 酶的特征 只能进行热力学上允许进行的反应 可以缩短化学反应到达平衡的时间而，不改变反应的平衡点 通过降低活化能加快化学反应速度7、酶的分类命名 氧化还原酶 Oxidoreductase 转移酶 Transferase 水解酶 hydrolase 裂合酶 Lyase 异构酶 Isomerase 合成酶 Ligase or Synthetase8、国际命名法：乳酸脱氢酶 EC 1.1.1. 27（第一大类，第一亚类，第一亚亚类，亚亚类流水编号）酶的发现及研究历史J.B.Sumner从刀豆制备出脲酶结晶1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶）9、 酶的组成 单纯酶 结合酶=酶蛋白+辅因子（辅基、辅酶、金属激活剂）核酸类酶（R酶）的分类 剪切酶，剪接酶和多功能酶10、必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。11、酶的专一性 立体异构专一性 相对专一性（基团/族）+绝对专一性（特底） 结构专一性12、 影响酶催化因素：温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂（氯淀）13、 竞争性抑制：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。机制：竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。例如，丙二酸是琥珀酸的结构类似物。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。非竞争性抑制（nonpetitive inhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。机制：由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。反竞争性抑制(unpetitive inhibition)：在底物与酶分子结合生成中间复合物后， 抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。机制：反竞争性抑制剂不能与未结合底物的酶分子结合，只有当底物与酶分子结合以后由于底物的结合引起酶分子结构的某些变化，使抑制剂的结合部位展现出来，抑制剂才能结合并产生抑制作用。所以亦不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。14、 酶活力：在特定条件下（温度可采用25或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1 min 催化1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位15、 酶与底物结合模型：锁钥学说、诱导契合学说第二章 微生物发酵产酶16、酶生物合成过程 提取分离 生物合成：酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程. 化学合成17、优良的产酶微生物具备的条件：（1）酶的产量高；（2）产酶稳定性好；（3）容易培养和管理；（4）利于酶的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。18、酶的发酵方式 固体培养发酵 液体深层发酵 固定化微生物细胞发酵 固定化微生物原生质体发酵19、 常见产酶微生物细菌：肽聚糖、二分裂，原核；球、杆、螺旋；G+:磷壁酸、L-赖氨酸、紫G-：脂多糖、二氨基庚二酸、红放线菌：原核；菌丝状生长，孢子繁殖；G+酵母菌：甘露聚糖、葡聚糖；出芽繁殖；糖酸；真核霉菌：基本单位是菌丝；真核；孢子繁殖酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme 中心法则 RNA的生物合成 蛋白质的生物合成 酶生物合成的调节雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出的操纵子学说（Operon theory）来阐明的。常见产酶微生物基本要求 不是致病菌 发酵周期短,产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全! 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。酶的发酵工艺条件及控制20、 培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。21、 常见碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物氮源：蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、铵盐、硝酸盐无机盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质 生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类。功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应22、培养基的设计原则1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较23、实验室的常用培养基：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌： 查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；发酵条件及控制 pH值的调节控制 温度的调节控制 溶解氧的调节控制调节 通气量调节氧的分压 改变培养液的性质 调节气液接触时间 调节气液接触面积 24、提高酶产量的措施 添加诱导物。酶的作用底物：乳糖诱导大肠杆菌-半乳糖苷酶。L-苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等。酶的催化反应产物：半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。作用底物的类似物：异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍 控制阻遏物的浓度。 产物阻遏和分解代谢物阻遏 添加表面活性剂。 将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、曲通(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。 添加产酶促进剂。添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高120倍,添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。25、细胞生长的四个时期：调整期、生长期、平衡期、衰退期。通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型（米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20），延续合成型（在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。 ），中期合成型（枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。）和滞后合成型（受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。）。最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。26、monod方程：在培养过程中， 细胞生长速率与细胞浓度成正比27、 细胞破碎（胞内酶）1）机械破碎2）物理破碎4）酶解破碎28、层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。层析方法 分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离（解吸、吸附、再解吸、再吸附）分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的。在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离；当溶液pH值小于酶的等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子交换剂进行分离。（装柱、上柱、洗脱和收集、再生）凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同 而达到物质分离（装柱、上柱、洗脱等过程 ）亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 29、萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体（supercritical fluid, SF）是一种物质状态，当物质在超过临界温度及临界压力以上，气体与液体的性质会趋近于类似，最后会达成一个均匀相流体现象。 超临界流体类似气体具有可压缩性，而且又兼具有类似液体的流动性，密度一般都介于0.1到1.0g/ml之间。30、根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离可以分为3大类。(1)加压膜分离:以薄膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技术。在静压差的作用下，小于孔径的物质颗粒穿过膜孔，而大于孔径的颗粒被截留。根据所截留的物质颗粒的大小不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗透等3 种。(2)电场膜分离电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。电渗析和离子交换膜电渗析即属于此类。(3)扩散膜分离扩散膜分离是利用小分子物质的扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外。而大分子被截留，从而达到分离效果。常见的透析就是属于扩散膜分离。透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。透析主要用于酶等生物大分子的分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。31、洗脱剂的选择要注意下列各点：洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响。32、固定化酶的定义：通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。固定化酶的优点（1）易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。(2) 可以在较长时间内反复使用，有利工艺的连续化、管道化。(3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4) 在绝大多数情况下提高酶的稳定性。(5) 较能适应于多酶反应。(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。固定化酶的缺点(1) 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本。(2) 比较适应水溶性底物和小分子底物。(3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应33、固定化酶的制备方法：吸附法（pH，离子强度，蛋白质浓度，温度，吸附速度，载体）、包埋法（对底物和产物是大分子的酶并不适合）、共价结合法（偶联）交联法固定化方法与载体的选择1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价34、无载体固定化酶新技术优点：在载体固定化酶中，由于聚合物载体的存在而大大降低了酶与大分子底物的结合容量和反应能力，而无载体固定化酶具有较高的催化剂比表面；较高的酶催化活性，成本低；受底物扩散限制的影响较小；可提高了酶在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中的操作稳定性等优点。35、固定化细胞将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。(固定化活细胞或固定化增殖细胞) 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。 固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：无须进行酶的分离纯化保持酶的原始状态，酶回收率高比固定化酶稳定性高细胞内酶附助因子可再生抗污染能力强36、细胞本身通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。含多酶体系37、 酶分子修饰的原理1、 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。从而增强酶天然构象的稳定性与耐热性。2、 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。从而保护酶活性部位并起到低抗抑制剂和抗蛋白水解酶的作用。3、酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。4、酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除，“遮盖”了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合。消除酶的抗原性，使酶稳定。5、大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。修饰剂的选择原则1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）。2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）。3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件（要求有完善的方法）酶分子修饰的基本要求和条件：对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。38、大分子修饰（大分子结合修饰）：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。非共价修饰+共价修饰小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团修饰+特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰39、酶的定向进化：人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化=随机突变+选择40、酶的非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。非水相酶催化的特性（1）增加非极性基质的溶解度；（2）使某些原本在水相不能进行的反应顺利进行，如肽的合成、酯的合成等；（3）可减少在水相容易发生的副反应，如酸酐的水解、卤化物的水解等；（4）容易分离回收；（5）无微生物污染41、有机介质中的酶催化特点：1）适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。2）酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能42、气相介质中的酶催化定义：气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。特点：1）适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。2）由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。 43、超临界流体介质中的酶催化定义：超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。条件要求：1）用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良影响；2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；5）超临界流体要容易获得，价格要便宜等44、有机介质反应体系微水介质（microaqueous media）体系、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系、（正）胶束体系、反胶束体系45、 机介质酶催化反应的优点 因而使通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性成为可能。 由于引起酶变性的许多因素都与水的存在有关, 因此在有机介质中酶的稳定性得到显著提高 由于有机溶剂的存在, 水量减少，大大降低了许多需要水参与的副反应 在有机介质中进行的酶促反应，可以省略产物的萃取分离过程, 提高收率46、 水对有机介质中酶的影响 水对有机介质中酶的影响 水对酶催化反应速度的影响 水活度47、水活度（water activity, Aw）是指体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。即：Aw = P/P0式中，P为在一定条件下体系中水的蒸汽压，Po为在相同条件下纯水的蒸汽压。研究表明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。一个优良的培养装置应具有： 严密的结构 良好的液体混合性能 高的传质和传热速率 灵敏的检测和控制仪表48、酶反应器:用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。提供合适的场所和最佳的反应条件49、结构分类：搅拌式、鼓泡式、填充床、流化床、膜反应器50、操作方式：分批、连续、分批流加51、酶反应器的选择根据酶的应用形式选择反应器 游离酶催化反应最常用的反应器是拌罐式反应器。 对于有气体参与的酶催化反应，通常采用鼓泡式反应器。 对于某些价格较高的酶，由于游离酶与反应产物混在一起，为了使酶能够回收，可以采用游离酶膜反应器。 对于某些耐高温的酶，如高温淀粉酶等，可以采用喷射式反应器，进行连续式的高温短时反应。根据酶反应动力学性质选择反应器 必须保证酶分子与底物分子能够有效碰撞，为此，必须使酶与底物在反应系统中混合均匀 底物浓度的高低对酶反应速度有显著影响 有些酶催化反应，其反应产物对酶有反馈抑制作用 某些酶可以耐受100以上的高温，最好选用喷射式反应器根据底物或产物的理化性质选择反应器 反应底物或产物的分子质量较大时，由于底物或产物难于透过超滤膜的膜孔，所以一般不采用膜反应器 反应底物或者产物的溶解度较低、粘度较高时，应当选择搅拌罐式反应器或者流化床式反应器，而不采用填充床式反应器和膜反应器，以免造成阻塞现象 反应底物为气体时，通常选择鼓泡式反应器。 有些需要小分子物质作为辅酶（辅酶可以看作是一种底物）的酶催化反应，通常不采用膜反应器，以免辅酶的流失而影响催化反应的进行