分子生物学.ppt

生物化学教研室生物化学教研室1.掌握掌握聚合酶链反应的原理及反应组分。聚合酶链反应的原理及反应组分。熟悉熟悉限制性核酸内切酶分析的原理及在多限制性核酸内切酶分析的原理及在多态性检测中的应用；核酸分离纯化的主要方法态性检测中的应用；核酸分离纯化的主要方法和步骤。和步骤。了解了解人类基因组计划和生物芯片技术。人类基因组计划和生物芯片技术。2.生生物物学学：研研究究生生命命现现象象、生生命命本本质质、生生命命活活动动及及其其规规律律的的学学科科。现现已已在在整整体体水水平平、细细胞胞水水平平和和分分子子水水平平三三个个层层次次上上研研究究生生命命活活动及其规律。动及其规律。分分子子生生物物学学：是是从从分分子子水水平平上上研研究究生生命命现现象象、生生命命的的本本质质、生生命命活活动动及及其其规规律律的的学科。学科。医医学学分分子子生生物物学学：是是从从分分子子水水平平上上研研究究人人体体和和疾疾病病相相关关生生物物在在正正常常和和疾疾病病状状况况下下生生命命活活动动及及其其规规律律、从从分分子子水水平平上上开开展展人人类类疾病的预防、诊断和治疗研究的学科。疾病的预防、诊断和治疗研究的学科。3.现代分子生物学现代分子生物学研究主要涉及三个领域研究主要涉及三个领域1.从从核核酸酸和和蛋蛋白白质质的的结结构构与与功功能能、基基因因组组的的结结构构与与功功能能到到基基因因的的复复制制、表表达达、调调控极其生物学效应；控极其生物学效应；2.从从生生物物大大分分子子间间的的相相互互作作用用到到这这些些相相互互作作用用构构成成的的细细胞胞间间通通讯讯和和细细胞胞内内信信号号转转导；导；3.从从基基因因的的结结构构、功功能能、表表达达调调控控的的分分析析到到基基因因的的制制备备、改改造造、调调控控、应应用用所所需需的各种技术体系。的各种技术体系。4.医学分子生物学的研究医学分子生物学的研究主要在两个方面：主要在两个方面：1.进进行行基基因因与与基基因因组组结结构构与与功功能能研研究究因因为为只只有有对对正正常常基基因因、变变异异基基因因、外外源源基基因因、疾疾病病易易感感基基因因的的功功能能有有了了详详细细了了解解，才能从本质上解释疾病的发病机制。才能从本质上解释疾病的发病机制。2.进进行行细细胞胞间间通通讯讯和和信信号号转转导导机机制制的的研研究究因因为为细细胞胞间间通通讯讯和和细细胞胞内内信信号号转转导导是是体体内内细细胞胞功功能能、调调控控的的分分子子基基础础，多多种种疾疾病病的的发发生生常常常常与与某某些些信信号号分分子子的的结结构构与与功功能能改变有关。改变有关。5.医学分子生物学的应用医学分子生物学的应用1.应应用用基基因因诊诊断断和和基基因因治治疗疗对对某某些些疾疾病进行诊断和治疗；病进行诊断和治疗；2.用基因分析来确定病因；用基因分析来确定病因；3.通通过过对对基基因因功功能能研研究究和和应应用用基基因因克克隆与表达技术研制新型疫苗和新型药物。隆与表达技术研制新型疫苗和新型药物。6.一、研究进展一、研究进展现现代代分分子子生生物物学学实实验验的的基基础础主主要要包包括括分分子子克克隆隆、体体外外DNA扩扩增增技技术术、DNA测测序序以以及及核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术。1970年年，Smith等等人人发发现现了了限限制制性性内内切切酶酶，这这种种酶酶类类的的发发现现为为核核酸酸的的研研究究提提供供了了有有用用的的工工具具。也也为为基基因因工工程程提提供供了了条条件件。为为此此Smith等等人人也也获获得得诺诺贝贝尔尔奖奖。基基因因工工程程技技术术的的出出现现，标标志志着着人人类类深深入入认认识识生生命命本本质质并并能能改造生命的新时期的开始。改造生命的新时期的开始。7.DNA序序列列测测定定方方法法的的建建立立英英国国剑剑桥桥大大学学分分子子生生物物学学实实验验室室Sanger教教授授1975年年建建立立了了DNA测序方法，测序方法，1980年获得诺贝尔奖。年获得诺贝尔奖。20世世纪纪80年年代代的的中中期期，Mullis等等人人发发明明PCR技技术术，引引发发了了分分子子生生物物学学的的方方法法学学革革命命。并并衍衍生生出出定定量量PCR、原原位位PCR、RT-PCR等等技术。技术。20世世纪纪90年年代代中中期期，生生物物芯芯片片技技术术的的诞诞生生，及及双双向向电电泳泳、生生物物质质谱谱等等技技术术的的运运用用，必将推动必将推动21世纪分子生物学研究的发展。世纪分子生物学研究的发展。8.二、人类基因组概念二、人类基因组概念基基因因组组(Genome)：生生物物体体一一套套完完整整遗遗传传物物质质的的总总和和。人人类类基基因因组组包包括括23对对染染色色体体，即即22对对常常染染色色体体及及一一对对性性染染色色体体（XX或或XY）DNA的总和。的总和。基基因因（Gene）：一一个个功功能能性性遗遗传传单单位位。一一个个基基因因不不仅仅包包括括编编码码蛋蛋白白质质的的序序列列，还还包包括括调调控控序序列列，5端端不不翻翻译译序序列列，内内含含子子，及及3端非编码序列。端非编码序列。9.基基因因组组学学（Genomics）：1986年年由由美美国国遗遗传传学学家家罗罗德德里里克克（T.H.Roderick）提提出出来来的的，以以适适应应新新学学科科的的发发展展。目目前前，基基因因组组学学又又分分为为结结构构基基因因组组学学及及功功能能基基因因组组学学。结结构构基基因因组组学学就就是是对对基基因因组组进进行行作作图图和和测测序序。功功能能基基因因组组学学是是对对已已经经知知道道的的序序列列进进行行功功能能研究。研究。10.人人类类基基因因组组结结构构总总长长约约3109bp，包包含含约约34万万个个基基因因，分分散散在在23条条染染色色体体上上。如如果果接接成成直直线线的的话话，长长约约1.02M，其其中中编编码码蛋蛋白白质质的的结结构构基基因因仅仅占占2%3%，按按每每个个基基因因在在基基因因组组出出现现的的频频率率分分为为单单拷拷贝贝顺顺序及重复顺序。序及重复顺序。细细菌菌的的基基因因组组以以E.Coli为为例例,DNA总总长长为为4106bp，包包含含4000个个基基因因，基基因因组组是是一一条染色体，双链闭环条染色体，双链闭环DNA。病毒核酸大小不一病毒核酸大小不一（3kb300kb）。）。11.一、一、HGP的提出的提出1986年年，美美国国生生物物学学家家诺诺贝贝尔尔奖奖获获得得者者杜杜泊泊克克（Delbecco）在在“Science”发发表表题题为为“癌癌症症研研究究的的转转折折点点人人类类基基因因组组全全序序列列分分析析”。他他提提出出人人类类疾疾病病包包括括癌癌症症在在内内直直接接或或间间接接与与基基因因有有关关，应应该该从从整整体体研研究究基基因因组组。他他首首先先提提出出HGP概概念念。他他写写道道“这这样样的的工工作作任任何何一一个个实实验验室室也也难难以以承承担担的的，它它应应该该成成为为国国际际性性的的项项目目，人人类类的的DNA序列是人类真諦序列是人类真諦”。12.二、二、HPG研究的内容研究的内容（一一）遗遗传传图图 又又称称连连锁锁图图（linkagemap），它它以以遗遗传传多多态态性性为为“路路标标”,以以遗遗传传学学距距离离厘厘摩摩（cM，centrimorgan）为为图图距距的的基基因因组组作作图图。遗遗传传多多态态性性即即在在1个个遗遗传传位位点点上上具具有有两两个个以以上上的的等等位位基基因因，在在群群体体中中出出现现频频率率高高于于1%的的称称遗遗传传多多态态性性。厘厘摩摩是是在在减减数数分分裂裂事事件件中中，两两个个位位点点之之间间进进行行交交换换、重重 组组 的的 百百 分分 率率。1%的的 重重 组组 率率 称称 1cM。1cM=1000kb.13.1988年年美美国国能能源源部部和和国国家家卫卫生生研研究究院院先先成成立立了了“人人类类基基因因组组研研究究中中心心”请请冷冷泉泉港港研研究究所所所所长长，沃沃森森（Watson）教教授授担担任任第第一一任中心主任。任中心主任。1990年年美美国国国国会会批批准准HGP计计划划，预预计计30亿亿美美元元，15年年完完成成。随随后后几几个个发发达达国国家家也也相相继继宣宣布布HGP计计划划。1994年年美美、日日、德德、法法、英英五五国国联联合合正正式式启启动动这这一一计计划划。中中国国于于1999年年9月月在在英英国国伦伦敦敦举举行行的的第第五五次次人人类类基基因因组组会议上正式加入该计划。会议上正式加入该计划。14.2001年年2月月15日日在在”Nature”上上发发表表了人类基因组成果。了人类基因组成果。1.人人类类基基因因组组共共有有2.91Gbp。大大约约有有34万万个个蛋蛋白白质质编编码码区区，只只有有2%的的基基因因编编码蛋白质。码蛋白质。2.人人类类基基因因组组基基因因分分布布不不均均匀匀。部部分分基基因因密密集集，如如19号号染染色色体体；部部分分区区域域基基因因贫瘠，如贫瘠，如13号染色体。号染色体。3.人人类类基基因因组组中中35.3%包包含含重重复复顺顺序序。其功能尚待研究。其功能尚待研究。4.人人类类基基因因99.8%是是相相同同的的。0.2%有有差异，种族之间无明显差异。差异，种族之间无明显差异。15.5.男男、女女差差别别。男男性性基基因因突突变变率率是是女女性性2倍，大部分遗传疾病基因在倍，大部分遗传疾病基因在Y染色体上。染色体上。6.插插入入基基因因约约有有200多多个个是是来来至至于于细细菌菌的的基基因因。可可能能是是在在人人类类的的免免疫疫系系统统建建立立之之前前，寄寄生生于于人人类类身身体体中中的的细细菌菌与与人人类类基基因因交换的结果。交换的结果。7.蛋蛋白白质质组组的的复复杂杂性性。人人类类的的进进化化不不仅仅靠靠产产生生的的蛋蛋白白质质，更更重重要要靠靠重重排排已已有有的的蛋蛋白质，实现蛋白质的种类和功能的多样性。白质，实现蛋白质的种类和功能的多样性。16.HGP研究的意义：研究的意义：1.在在人人类类历历史史上上，100多多年年前前HenryGray绘绘制制了了完完整整的的人人体体解解剖剖图图，奠奠定定了了现现代代医医学学的的基基础础，HGP从从分分子子水水平平上上给给人人类类画画了了第第二二张张解解剖剖图图，揭揭开开了了人人类类生生、老老、病、死的遗传信息。病、死的遗传信息。2.在在医医学学领领域域，推推动动了了医医学学的的发发展展，对对疾疾病病的的发发生生、发发展展、诊诊断断、预预防防提提出出了了全新的概念。全新的概念。3.推推动动了了生生物物界界的的革革命命，随随着着人人类类基基因因组组的的破破译译，许许多多生生物物的的基基因因组组相相继继被被揭揭开，如果蝇、水稻、小鼠、大鼠等。开，如果蝇、水稻、小鼠、大鼠等。17.中国在人类基因组研究中的作用：中国在人类基因组研究中的作用：我我国国人人类类基基因因组组的的研研究究在在1994年年开开始始启启动动，以以“中中国国人人类类遗遗传传多多样样性性”的的研研究究作作为为重重点点，我我国国有有56个个民民族族和和许许多多遗遗传传隔隔离离群群，这这对对中中国国和和世世界界都都是是一一个个重重要要的的贡贡献献1999年年9月月我我国国参参与与了了世世界界人人类类基基因因组组大大会会，接接受受了了完完成成第第3号号染染色色体体短短臂臂的的序序列列分分析析。2001年年8月月26日日通通过过了了人人类类基基因因组组验验收收，完完成成了了3000万万bp的的测测序序工工作作，准准确确率率99.99%。18.目前核酸的分离纯化主要包括目前核酸的分离纯化主要包括4个步骤个步骤1.制备细胞及破碎细胞；制备细胞及破碎细胞；2.消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂质等大分子；质、多糖及脂质等大分子；3.去除其他不需要的核酸分子；去除其他不需要的核酸分子；4.沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。质。19.一、一、DNA的分离纯化的分离纯化DNA是是遗遗传传信信息息的的载载体体，是是分分子子生生物物学学研研究究的的主主要要对对象象，因因此此，DNA的的提提取取是是分分子子生生物物学学实实验验技技术术中中的的最最重重要要、最最基基本本的的操操作作。在在DNA提取过程中应做到：提取过程中应做到：1.根根据据不不同同研研究究需需要要，保保证证结结构构的的相相对对完整性；完整性；2.尽尽量量排排除除其其它它大大分分子子成成分分的的污污染染（蛋蛋白质、多糖及白质、多糖及RNA等）；等）；3.保保证证提提取取样样品品中中不不含含对对酶酶有有抑抑制制作作用用的有机溶剂及高浓度的金属离子。的有机溶剂及高浓度的金属离子。20.（一）基因组总（一）基因组总DNA的分离与纯化的分离与纯化基基本本过过程程为为粉粉碎碎动动植植物物组组织织，裂裂解解细细胞胞，有有机机溶溶剂剂抽抽提提，使使进进入入水水相相的的核核酸酸与与蛋蛋白白成成分分开，降解分分开，降解RNA，得纯度较高的，得纯度较高的DNA样品。样品。1.样样本本制制备备生生物物组组织织；培培养养细细胞胞；血液。血液。2.DNA提提取取提提取取方方法法主主要要有有氯氯仿仿法法、去去污污法法和和酚酚抽抽提提法法。主主要要利利用用核核酸酸与与蛋蛋白白质质对对酚酚和和氯氯仿仿变变性性作作用用的的反反应应不不同同以以分分离离核核酸酸和和蛋蛋白白质质。（SDS、蛋蛋白白酶酶K消消化化蛋蛋白白质质，EDTA抑制抑制DNA酶）酶）21.二、二、RNA的分离与纯化的分离与纯化RNA的提取过程中的五个关键点：的提取过程中的五个关键点：1.样品细胞或组织的破碎；样品细胞或组织的破碎；2.有效地使核蛋白复合体变性；有效地使核蛋白复合体变性；3.对内源对内源RNA酶的抑制；酶的抑制；4.有有效效地地将将RNA从从DNA和和蛋蛋白白混混合合物物中分离；中分离；5.对对于于多多糖糖含含量量高高的的样样品品还还牵牵涉涉到到多多糖糖杂杂质质的的除除去去。但但其其中中最最关关键键的的是是抑抑制制RNA酶酶活性。活性。22.RNA的的提提取取目目前前阶阶段段主主要要可可采采用用两两种种途径：途径：1.提提取取总总核核酸酸，再再用用氯氯化化锂锂将将RNA沉沉淀淀出来；出来；2.直直接接在在酸酸性性条条件件下下抽抽提提，酸酸性性下下DNA与与蛋蛋白白质质进进入入有有机机相相而而RNA留留在在水水相相。第第一一种种提提取取方方法法将将导导致致小小分分子子量量RNA的的丢丢失失，目目前该方法的使用频率已很低。前该方法的使用频率已很低。23.（一）总（一）总RNA的提取的提取总总RNA纯纯化化系系统统采采用用两两种种RNA酶酶抑抑制制剂剂，异异硫硫氰氰酸酸胍胍(GTC)和和-巯巯基基乙乙醇醇，整整个个操操作作在在冰冰浴浴下下进进行行，能能显显著著降降低低RNA的的降降解解速速率率。采采用用酸酸性性酚酚-氯氯仿仿混混合合液液抽抽提提，低低pH值值的的酚酚将将使使RNA进进入入水水相相，与与仍仍留留在在有有机机相相中中的的蛋蛋白白质质和和DNA分分离离。水水相相中中的的RNA用用异异丙丙醇醇沉沉淀淀浓浓缩缩。将将RNA沉沉淀淀复复溶溶于于GTC溶溶液液中中，用用异异丙丙醇醇进进行行二二次次沉沉淀淀，用用乙乙醇醇洗洗涤涤沉沉淀淀，即即可去除残留的蛋白质和无机盐。可去除残留的蛋白质和无机盐。24.（二）（二）mRNA的分离与纯化的分离与纯化mRNA分分子子最最显显著著的的结结构构特特征征是是具具有有5帽帽子子结结构构（m7G）和和3端端的的poly（A）尾尾巴巴。通通常常以以寡寡聚聚（dT）-纤纤维维素素拄拄层层析析或或poly（U）琼琼脂脂糖糖拄拄的的亲亲和和层层析析发发最最为为常常用。用。25.限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是一一类类能能识识别别和和切切割割双链双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸酶。分子中特定碱基顺序的核酸酶。类类：具具修修饰饰与与切切割割双双链链DNA功功能能，但但切切割位点是随机的，无大作用。割位点是随机的，无大作用。类类：能能识识别别和和切切割割双双链链DNA的的特特异异顺顺序序，产产生生特特异异DNA片片段段，在在重重组组DNA中中具具有有重重要要价值。价值。类类：具具修修饰饰和和切切割割双双链链DNA功功能能，能能在在识识别别位位点点附附近近切切割割DNA，但但切切割割位位点点难难预预测，该类酶亦无大作用。测，该类酶亦无大作用。26.一、一、PCR的基本原理的基本原理PCR(Polymerase chain reaction)中中文文叫叫聚聚合合酶酶链链反反应应，是是DNA体体外外扩扩增增技技术术，它它可可以以在在几几小小时时内内将将任任何何微微量量DNA特特异异性地扩增成千上万倍。性地扩增成千上万倍。DNA高高温温变变性性成成为为单单链链再再在在低低温温下下引引物物与与单单链链DNA退退火火在在DNA聚聚合合酶酶作作用用下下，合合成成一一条条与与单单链链DNA互互补补的的新新DNA链链这这一一变变性性、退退火火与与引引物物延延伸伸作为一个循环，进行作为一个循环，进行2040次。次。27.模板模板DNA94变性变性55退火退火72引物延伸引物延伸第二次循环第二次循环模板变性退火模板变性退火延伸延伸经经25-30次循环，目的次循环，目的DNA增加增加106-7PCRPCR原理示意图原理示意图28.1234522557294时间（时间（min）温温度度（）PCR的基本原理的基本原理适温延伸适温延伸3高温变性高温变性1低温退火低温退火2重复重复13步步2530轮轮目的目的DNA片段片段扩增扩增100万倍以上万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍29.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA9430.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9455引物1引物2DNA引物31.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶32.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始33.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaq34.PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束35.1.TaqDNA聚合酶聚合酶TaqDNA聚聚合合酶酶能能以以DNA为为模模板板，从从结结合合在在特特定定DNA模模板板上上的的引引物物为为出出发发点点，将将4种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸以以碱碱基基配配对对方方式式，按按53方方向向，合合成成新新的的DNA链链。这这种种酶酶的的最最适适温温度度为为7075，酶酶量量一一般般为为13U/反反应应管管，过过高高会会引引起起非特异性产物的扩增。非特异性产物的扩增。二、二、PCR反应体系反应体系36.2.寡核苷酸引物寡核苷酸引物能与模板特异结合，引物设计的原则：能与模板特异结合，引物设计的原则：引物长度，引物长度，1530碱基。碱基。引物中碱基的分布是随机的。引物中碱基的分布是随机的。避免两引物间的互补。避免两引物间的互补。引物的碱基顺序不应与非扩增区互补。引物的碱基顺序不应与非扩增区互补。引物的引物的3末端一定要与模板配对末端一定要与模板配对其浓度通常是其浓度通常是0.11mol/L37.3.三磷酸脱氧核苷酸（三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）dNTP稳稳定定性性好好，使使用用浓浓度度为为20200mol/L，且且四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸浓浓度度要要接接近近。使使用用时时要要用用NaOH调调pH值值7.07.5再再分分装装，不不要要过过多多冻冻融融。高高浓浓度度核核苷苷酸酸会会增增加加聚聚合合的的错错误误和和成成本本，低低浓浓度度会会导导致致反反应应速速度度下下降，但可提高实验的精确性。降，但可提高实验的精确性。Mg2+可可与与dNTP结结合合，使使游游离离Mg2+降降低低。要注意要注意Mg2+浓度与浓度与dNTP浓度之间的关系。浓度之间的关系。38.4.PCR反应缓冲液反应缓冲液Tris-Cl(pH8.38.8)，KCl(50mmol/L)，MgCl2(1.5mmol/L)，明胶，明胶(0.1%)和甲酰胺和甲酰胺(5%)。其其中中Mg2+最最为为重重要要，其其浓浓度度可可影影响响酶酶活活性性与精确度以及产物的特异性。与精确度以及产物的特异性。体体系系的的pH为为8.38.8是是因因为为70时时反反应应体体系系的的pH会会下下降降一一个个多多单单位位，而而pH低低于于7.0会会影影响聚合酶的活性。响聚合酶的活性。KCl合合适适浓浓度度能能促促进进引引物物退退火火，但但过过高高会会抑制聚合酶活性。抑制聚合酶活性。明胶主要用来稳定酶活性。明胶主要用来稳定酶活性。甲酰胺主要用来加强反应的特异性。甲酰胺主要用来加强反应的特异性。39.5.模板模板DNA要要求求不不严严格格，主主要要避避免免标标本本间间的的交交叉叉污染，模板中不能有聚合酶抑制剂。污染，模板中不能有聚合酶抑制剂。6.PCR的循环数的循环数一一般般为为30个个循循环环，过过少少产产物物量量不不多多，过过多多非非特特异异性性产产物物会会增增加加，标标准准扩扩增增条条件件是是9430秒，秒，5530秒，秒，7230秒。秒。40.三、三、PCR技术在医学上的应用技术在医学上的应用1.感染性疾病病原体的检测感染性疾病病原体的检测如结核杆菌如结核杆菌2.遗传病相关基因的检测遗传病相关基因的检测如如镰镰刀刀性性红红细细胞胞贫贫血血，可可设设计计一一对对引引物物把把包包含含突突变变的的DNA片片段段进进行行扩扩增增，扩扩增增产产物物用用限限制制性性内内切切酶酶酶酶切切，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳后后染染色色观观察察：正正常常人人有有2个个片片段段即即191和和103，镰镰刀刀细细胞胞贫贫血血的的纯纯合合子子只只有有1个个片片段段即即294，杂杂合子有合子有3个片段即个片段即191、103和和294）。）。3.恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤的诊断和研究举例说明（缺失片段包含设计的引物）举例说明（缺失片段包含设计的引物）41.核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术是是利利用用DNA变变性性后后具具有有互互补补序序列列的的两两条条单单链链在在一一定定条条件件下下，可可通通过过碱碱基基配配对对原原则则，重重新新聚聚合合形形成成双双链链的的原原理。理。包包 括括 DNA-DNA，DNA-RNA和和 RNA-RNA。一、分子杂交一、分子杂交42.（一（一）探针的概念和特征探针的概念和特征核核酸酸探探针针是是指指能能与与特特定定核核苷苷酸酸序序列列发发生生特特异异互互补补杂杂交交，杂杂交交后后又又能能被被特特殊殊方方法法检检测的已知被标记的核苷酸链。测的已知被标记的核苷酸链。1.要加以标记，带有示踪物。要加以标记，带有示踪物。2.应是单链。应是单链。3.具有高度特异性，只与靶核酸杂交。具有高度特异性，只与靶核酸杂交。4.长度为十几到上千个长度为十几到上千个bp。5.具有高灵敏度、稳定、标记方法简便具有高灵敏度、稳定、标记方法简便。43.（二）探针的种类及制备（二）探针的种类及制备1.基基因因组组DNA探探针针一一般般从从基基因因文文库库中中选选取取某某一一基基因因片片段段，将将其其与与质质粒粒或或噬噬菌菌体体载载体体连连接接，进进行行克克隆隆后后酶酶切切获获得得，也也可可用用PCR来制备。来制备。2.cDNA探探针针 这这种种探探针针是是以以特特定定mRNA为为模模板板，经经反反转转录录获获得得cDNA后后，进进行行克克隆隆，即即可可作作为为探探针针使使用用。与与基基因因组组DNA探探针针相相比比，cDNA探探针针不不存存在在内内含含子子及及其其它它高高度度重重复复序序列列，是是一一种种理理想想的的核核酸酸分分子探针子探针。44.3.RNA探探针针通通过过基基因因克克隆隆和和转转录录可可得得到到RNA探针。特点：探针。特点：杂杂交交反反应应效效率率高高，非非特特异异性性杂杂交交少少，可通过可通过RNase来降低本底干扰。来降低本底干扰。可以测定基因正向和反向转录水平。可以测定基因正向和反向转录水平。RNA探针易降解，标记复杂。探针易降解，标记复杂。4.寡寡核核苷苷酸酸探探针针是是人人工工合合成成的的DNA探探针针，这这类类探探针针不不如如克克隆隆探探针针好好，如如灵灵敏敏度度较较差差，其其优优点点是是可可大大量量合合成成且且价价格格低低，容容易易进进行非放射性标记。行非放射性标记。45.（三）探针的标记物（三）探针的标记物1.放射性核素标记物放射性核素标记物优点：优点：灵灵敏敏度度高高，在在最最适适条条件件下下，可可检检测测小小于于1000个分子的核酸含量或个分子的核酸含量或1018g的物质。的物质。不影响酶促反应不影响酶促反应。不影响碱基配对的特异性和稳定性不影响碱基配对的特异性和稳定性。缺点：缺点：易造成放射性污染。易造成放射性污染。常用的有常用的有32P、3H、35S和和125I、131I等。等。46.2.非放射性核素标记物非放射性核素标记物主主要要标标记记物物有有：生生物物素素、地地高高辛辛、荧光素、酶等。荧光素、酶等。特特点点：灵灵敏敏度度较较放放射射性性核核素素标标记记的的探探针针低低，但但具具有有稳稳定定、安安全全、经经济济及及实实验周期短验周期短。47.（四）标记方法（四）标记方法1.酶酶标标记记法法是是指指将将标标记记物物预预先先标标记记在在单单核核苷苷酸酸分分子子上上，然然后后利利用用酶酶促促反反应应将将它它掺掺入入到到探探针针分分子子中中或或将将核核苷苷酸酸分分子子上上的的标记基团交换到探针分子上。标记基团交换到探针分子上。2.化化学学标标记记法法是是指指利利用用标标记记物物分分子子上上的的活活性性基基团团与与探探针针分分子子上上的的基基团团发发生生化化学学反反应应，从从而而将将标标记记物物直直接接结结合合到到探探针针分分子上。子上。48.DNaseE coliDNApoldATPdATPdGTPdCTPdTTP切口平移法标记探针切口平移法标记探针35535353353549.dATPdATPdGTPdCTPdTTPE coliDNApol随机引物随机引物变性变性随机引物法标记探针随机引物法标记探针变性变性3553355350.1.Southern印迹杂交：印迹杂交：2.Northern印迹杂交：印迹杂交：3.斑点杂交：斑点杂交：4.原位杂交：原位杂交：将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中细胞或组织中的的核酸进行杂交，称为原位杂交。核酸进行杂交，称为原位杂交。能在成分复杂的组织中进行单一细能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态功能状态Northern印迹杂交印迹杂交与与Southern印迹杂交基本相似，但所印迹杂交基本相似，但所检测的是检测的是RNA（主要是主要是mRNA）。操作操作中不能被中不能被RNA酶污染，电泳时有变性剂，酶污染，电泳时有变性剂，印迹前要将变性剂去掉。印迹前要将变性剂去掉。Southern印迹杂交印迹杂交这是一种这是一种DNA/DNA杂交，是杂交，是检测特检测特异异DNA的方法，的方法，将将DNA电泳、转印到固电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。相支持物上，用探针进行检测的方法。因因Southern发明而得名。发明而得名。斑点杂交斑点杂交将将RNA或或DNA变性后直接点样于变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点杂交。优点：简单、快速、在同一张点杂交。优点：简单、快速、在同一张膜上可同时检测多个样品。膜上可同时检测多个样品。（五）核酸分子杂交的基本方法（五）核酸分子杂交的基本方法51.DNA芯芯片片技技术术是是近近年年来来综综合合运运用用分分子子生生物物学学、微微电电子子学学、微微加加工工和和计计算算机机等等多多学学科交叉融合而成的高新技术。科交叉融合而成的高新技术。在在每每平平方方厘厘米米的的芯芯片片上上可可密密集集排排列列成成千千上上万万个个生生物物分分子子，能能快快速速、准准确确地地检检测测核核酸，获取样品中的有关信息。酸，获取样品中的有关信息。DNA芯芯片片技技术术在在基基因因测测序序、基基因因表表达达、基基因因突突变变及及多多态态性性检检测测、基基因因诊诊断断和和基基因因药药物设计等方面有着广泛的应用。物设计等方面有着广泛的应用。52.（一）（一）DNA芯片技术的概念芯片技术的概念基基因因芯芯片片指指对对大大量量DNA片片段段同同时时进进行行处处理理、分分析析的的技技术术，由由于于常常用用计计算算机机硅硅芯芯片片作为固相支持物，故称为作为固相支持物，故称为DNA芯片。芯片。基基因因芯芯片片技技术术指指将将大大量量探探针针分分子子固固定定于于支支持持物物上上后后与与标标记记的的样样品品分分子子进进行行杂杂交交，通通过过检检测测每每个个探探针针分分子子的的杂杂交交信信号号强强度度进进而而获获取样品分子的数量和序列信息。取样品分子的数量和序列信息。53.（二）（二）DNA芯片的主要类型芯片的主要类型从从点点阵阵的的制制备备方方法法来来分分主主要要有有两两类类：原原位合成芯片与位合成芯片与DNA微集阵列微集阵列。1.原原位位合合成成型型采采用用光光介介导导和和电电打打印印等等技技术术在在芯芯片片的的特特定定部部位位原原位位合合成成寡寡核核苷苷酸酸而而制成的芯片称为原位合成芯片。制成的芯片称为原位合成芯片。2.DNA微微集集阵阵列列将将预预先先制制备备的的DNA片片段段用用显显微微打打印印的的方方式式有有序序地地固固定定于于支支持持物物表表面面而而制制成成的的芯芯片片称称为为DNA微微集集阵阵列列，也也称称DNA微集芯片。微集芯片。54.（1）光光介介导导原原位位合合成成法法首首先先使使支支持持物物羟羟基基化化，并并用用光光敏敏保保护护基基团团将将其其保保护护起起来来，选选取取适适当当的的蔽蔽光光膜膜（mask）使使需需要要聚聚合合的的部部位位透透光光，其其它它部部位位不不透透光光。这这样样，光光通通过过蔽蔽光光膜膜照照射射到到支支持持物物上上，受受光光部部位位的的羟羟基基解解保保护护，进进而而与与单单体体分分子子共共价价结结合合。因因为为合合成成所所用用的的单单体体分分子子一一端端按按传传统统固固相相合合成成方方法法活活化化，另另一一端端受受光光敏敏保保护护基基的的保保护护，所所以以发发生生偶偶联联的的部部位位反反应应后后仍仍旧旧带带有有光光敏敏保保护护基基团团。因因此此，每每次次通通过过控控制制蔽蔽光光膜膜的的图图案案（透透光光与与不不透透光光），以以及及所所用用单单体体的的种种类类和和反反应应次次序序就就可可以以实实现现在在特特定定位位点点合合成成大量预定序列寡聚体的目的。大量预定序列寡聚体的目的。55.优点：优点：合成速度快，点阵密度高。合成速度快，点阵密度高。缺点：缺点：设备昂贵，技术复杂，合成长度一设备昂贵，技术复杂，合成长度一般小于般小于30bp56.光介导寡聚核苷酸合成示意图光介导寡聚核苷酸合成示意图57.58.（2）压压电电打打印印合合成成法法基基本本原原理理与与普普通通彩彩色色打打印印机机相相似似，在在墨墨盒盒中中装装入入4种种单单核核苷苷酸酸，在在计计算算机机控控制制下下，通通过过喷喷嘴嘴有有序序开开放放和和关关闭闭将将单单核核苷苷酸酸喷喷射射到到预预设设的的经经包包被被的的支支持持物物表表面面。然然后后去去保保护护、偶偶联联、冲冲洗洗等等步步骤骤，进行寡聚核苷酸的延伸。进行寡聚核苷酸的延伸。59.移动喷射移动喷射接触表面接触表面移动喷头移动喷头重复重复重复重复输送液滴输送液滴喷墨打印法喷墨打印法针式打印法针式打印法微集阵列微集阵列微集阵列微集阵列60.（三（三）基因芯片的杂交检测基因芯片的杂交检测1.样品的准备样品的准备样样品品的的准准备备包包括括样样品品的的分分离离纯纯化化，扩扩增增和和标记标记等过程。等过程。扩扩增增：采采用用固固相相PCR系系统统，在在靶靶DNA上上设设计计一一对对双双向向引引物物，并并固固化化在在丙丙烯烯酰酰胺胺薄薄膜膜上上，加加入入模模板板DNA及及PCR试试剂剂，在在固固相相表表面面进行进行PCR反应。反应。标标记记：主主要要采采用用荧荧光光标标记记法法，也也可可用用生生物物素素、放放射射性性核核素素等等标标记记。样样品品的的标标记记在在PCR、RT-PCR过程中进行。过程中进行。61.2.分子杂交分子杂交待待测测样样品品经经扩扩增增和和标标记记等等处处理理后后，即即可可与与DNA芯芯片片上上的的探探针针阵阵列列进进行行分分子子杂杂交交。DNA芯芯片片上上集集成成了了大大量量的的探探针针，使使检检测测过过程程平平行行化化，一一次次可可对对大大量量的的样样品品信信息息检检测测分分析析。由由于于集集成成的的显显微微化化，使使得得杂杂交交所所需需的的探探针针和和样样品品用用量量大大大大减减少少，杂杂交交时时间间缩缩短短，一一般可在般可在30min内完成。内完成。62.3.检测分析检测分析待待测测样样品品与与DNA芯芯片片上上的的探探针针阵阵列列杂杂交交后后，荧荧光光标标记记的的样样品品结结合合在在芯芯片片的的特特定定位位置置上上，未未杂杂交交分分子子被被去去除除。然然后后在在激激光光的的激激发发下下，含含荧荧光光标标记记的的DNA片片段段发发射射荧荧光光。样样品品与与探探针针严严格格配配对对的的杂杂交交分分子子的的热热力力学学稳稳定定性性较较高高，所所产产生生的的荧荧光光强强度度最最强强；不不完完全全杂杂交交的的分分子子热热力力学学稳稳定定性性低低，荧荧光光信信号号弱弱；不不能能杂交的分子杂交的分子则则检测不到荧光检测不到荧光信号信号。63.（四）（四）DNA芯片的应用芯片的应用DNA芯芯片片技技术术现现已已广广泛泛应应用用于于生生物物科科学学的的众众多多领领域域中中。基基本本应应用用可可分分为为两两个个主主要要方方面面：对对大大量量的的生生物物样样品品进进行行快快速速、高高效效、敏敏感感的的定定量量分分析析，如如测测序序和和突突变变检检查查。定定性性分分析析，如如基基因因表表达达研研究究（基基因因功功能能分分析析、疾病发生机制探讨、药物研究和筛选）。疾病发生机制探讨、药物研究和筛选）。64.1.DNA序列测定序列测定2.基因突变多态性分析基因突变多态性分析3.基因表达分析（基因表达分析（组织差异性表达、代组织差异性表达、代谢过程差异性表达、病理学研究）谢过程差异性表达、病理学研究）4.基因组研究基因组研究5.基因诊断基因诊断（产前筛查诊断、疾病预测）（产前筛查诊断、疾病预测）6.药物研究与开发药物研究与开发（新药筛选、药物靶（新药筛选、药物靶标发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物标发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用分子原理、药物活性、毒性评价、中药作用分子原理、药物活性、毒性评价、中药成分筛选等）成分筛选等）65.本章小结1.分分子子生生物物学学技技术术的的研研究究进进展展，人人类类基基因组概念，分子生物学检验技术。因组概念，分子生物学检验技术。2.DNA的的分分离离与与纯纯化化；RNA的的分分离离与与纯纯化；限制性核酸内切酶分析的基本原理。化；限制性核酸内切酶分析的基本原理。3.聚聚合合酶酶链链反反应应的的原原理理；聚聚合合酶酶链链反反应应的一般操作；聚合酶链反应的临床应用。的一般操作；聚合酶链反应的临床应用。4.探探针针的的标标记记；常常用用分分子子杂杂交交技技术术；基基因芯