第五课-DNA限制性内切酶酶切反应.ppt

第五课第五课DNA限制性内切酶酶切反应限制性内切酶酶切反应.一、核酸限制性内切酶核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA特定碱基序列的核酸水解酶。这些酶都是在原核生物中发现的，可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大类。I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一致，无固定的切割位点，不产生特异片断。III型酶和I型酶类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切割，但切割位点在识别位点之外，对基因工程的意义也不大。.一、核酸限制性内切酶II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特异的DNA片断。II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序列，但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。.一、核酸限制性内切酶II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末端：平末端、5端突出的粘性末端、和3端突出的粘性末端。BamH I识别及切割位点：5GGATC C3 3C CTAGG5 5G3 5GATCC3 3CCTAG5 3G5Xho I识别及切割位点：5CTCGA G3 3G AGCTC5.二、限制性内切酶酶切反应1.配制反应体系DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的重要因素。反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。反应容积：在DNA浓度0.4g/l的情况下，根据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降低酶活性。.二、限制性内切酶酶切反应1.配制反应体系内切酶及使用的酶量根据实验要求选择限制性内切酶。1个酶活力单位的定义：在50l反应体系中，1gDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的酶量。加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑制酶的活性。.二、限制性内切酶酶切反应2.酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星活性。星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现象。其结果是酶切条带增多。星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星活性。.二、限制性内切酶酶切反应3.终止反应：可以通过以下3种方式终止酶切反应：若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时，可加入EDTA至终浓度10mM，或加入0.1%SDS。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难。若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应，可将反应产物置65或80加热20分钟。但有些酶加热灭活不彻底。用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。4.酶切结果的鉴定酶切完成后，取适量反应液进行琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。.三、实验步骤1.按顺序，在1.5ml微量离心管中配制反应试剂：10X Buffer5lDNA(100ng/l)（质粒或PCR产物）44lBamH I(15Units/l)0.5lXho I(10Units/l)0.5l2.混匀试剂。将离心管置37水浴，反应1小时。.三、实验步骤3.琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段制备1%琼脂糖凝胶。在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓冲液，混匀。将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样27.5l。135V衡压电泳30-40分钟。在紫外灯下观察酶切条带。将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中切割下来，装入1.5ml微量离心管中。置-20保存。.本周实验报告：1.实验原理2.实验步骤3.实验结果4.实验结果分析下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶中回收DNA.