体外受精与核移植动物.ppt

体外受精与核移植动物体外受精与核移植动物1为什么要进行动物人工繁殖？为什么要进行动物人工繁殖？1 1）野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，）野外大熊猫到了圈养环境中繁殖率非常低，78%78%的雌性大熊猫的雌性大熊猫不孕，圈养大熊猫不孕，圈养大熊猫90%90%的雄性大熊猫不育。的雄性大熊猫不育。2 2）野生中华鲟产卵场分布在金沙江下游和长江上游的约）野生中华鲟产卵场分布在金沙江下游和长江上游的约600600公里公里江段江段。葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线，。葛洲坝、三峡大坝阻断了洄游路线，为了补偿对中华鲟造为了补偿对中华鲟造成的不利影响，我国在宜昌成立了中华鲟研究所成的不利影响，我国在宜昌成立了中华鲟研究所,人工繁殖的幼人工繁殖的幼鲟，投放长江。鲟，投放长江。3 3）对于人类，世界范围内不孕夫妇占）对于人类，世界范围内不孕夫妇占1010左右，需要建立人工左右，需要建立人工助孕技术。助孕技术。2所有的这一切，都必须依赖于所有的这一切，都必须依赖于动物细胞工程动物细胞工程，尤，尤其是胚胎工程和核移植技术。其是胚胎工程和核移植技术。3精、卵精、卵人工授精人工授精体外受精体外受精体内体内发育发育早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植受体动物受体动物在受体子宫发育出生在受体子宫发育出生胚胎冷冻胚胎冷冻胚胎分割、融合胚胎分割、融合体体/胚胎细胞胚胎细胞 卵母细胞卵母细胞核移植核移植体外培养体外培养体外培养体外培养精、卵精、卵有有性性生生殖殖无无性性生生殖殖动物细胞工程动物细胞工程4胚胎工程胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。技术操作，获得所需要的成体动物的技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割与融合、胚胎/精子精子/卵子冷冻保存、胚胎性别控制、胚胎细胞核移卵子冷冻保存、胚胎性别控制、胚胎细胞核移植、基因导入等。植、基因导入等。第一节第一节 胚胎工程胚胎工程5胚前期胚前期：受精：受精第第2 2周末周末 受精、卵裂、形成胚泡。受精、卵裂、形成胚泡。胚胚 期期：第：第3 3周周第第8 8周末周末 三胚层的形成和分化，各主要器官原基的建立三胚层的形成和分化，各主要器官原基的建立胎胎 期期：第：第9 9周周出生出生6体外受精动物体外受精动物(试管动物试管动物)：将供体的精子和卵子在：将供体的精子和卵子在体外体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移移入受体完成发育出生的动物。入受体完成发育出生的动物。体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。境中完成受精过程的技术。第二节体外受精动物第二节体外受精动物7 发挥优良母畜的繁殖潜力发挥优良母畜的繁殖潜力 一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，而最终只有一个卵泡成熟常性周期内只有几个卵泡同时发育，而最终只有一个卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良种牛犊。一只良种母畜一并排卵，如果受精也只能生出一只良种牛犊。一只良种母畜一生只可能繁殖生只可能繁殖1010个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。如果能让更多的卵泡成熟排卵，而又让品质平凡的同种母畜如果能让更多的卵泡成熟排卵，而又让品质平凡的同种母畜“借借腹怀胎腹怀胎”，优良母畜可以获得后代的数目至少增加几十倍。，优良母畜可以获得后代的数目至少增加几十倍。意义意义8促进家畜改良的促进家畜改良的速度速度 由于提高了繁殖能力，可以使一由于提高了繁殖能力，可以使一头母畜在一个性周期内繁殖更多的仔畜，从而在短期内使头母畜在一个性周期内繁殖更多的仔畜，从而在短期内使优良种畜得到大量繁殖，促进了家畜改良的速度。优良种畜得到大量繁殖，促进了家畜改良的速度。保存遗传资源保存遗传资源 对优良母畜或稀有哺乳动物有计划地保存对优良母畜或稀有哺乳动物有计划地保存胚胎，建立起胚胎，建立起 “胚胎库胚胎库”。异地移植只需运输冷冻胚胎即。异地移植只需运输冷冻胚胎即可，而且可以有计划地进行胚胎采集和移植，优良胚胎的可，而且可以有计划地进行胚胎采集和移植，优良胚胎的利用率就会大大提高。利用率就会大大提高。9精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养；体外受精；体外受精；重组胚激活与体外培养；重组胚激活与体外培养；胚胎移植；胚胎移植；体内发育、出生。体内发育、出生。体外受精动物培育的步骤体外受精动物培育的步骤10采集精子并选择有活力的精子采集精子并选择有活力的精子精子的精子的体外获能：体外获能：是指精子获得穿卵子是指精子获得穿卵子透明带透明带能力的能力的过程。采用添加诱导精子获能物质过程。采用添加诱导精子获能物质(钙离子、血清蛋钙离子、血清蛋白、肝素等白、肝素等)的特定培养液来完成精子体外获能。的特定培养液来完成精子体外获能。1 1、精子的采集与体外获能、精子的采集与体外获能11精子的结构精子的结构头部：顶体、细胞核头部：顶体、细胞核尾部：颈、中段、主段和末尾部：颈、中段、主段和末端。端。顶体内部含有水解酶，能协顶体内部含有水解酶，能协助精子穿入卵周围的卵膜。助精子穿入卵周围的卵膜。精子质膜外表面存在有多种精子质膜外表面存在有多种凝集素受体。凝集素受体。鞭毛为鞭毛为9 92 2微管结构微管结构精子在睾丸生精小管内产生，精子在睾丸生精小管内产生，是单倍体。是单倍体。12(一一)成熟卵细胞的收集成熟卵细胞的收集 超数排卵超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，利用手术取出卵母细胞。目的是最大限育，更多的卵被排出，利用手术取出卵母细胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出5-105-10个卵母细胞）个卵母细胞）卵细胞的收集：在腹腔镜下用吸管吸出卵细胞。卵细胞的收集：在腹腔镜下用吸管吸出卵细胞。2 2、卵细胞的回收与成熟培养、卵细胞的回收与成熟培养13卵子的结构卵子的结构卵细胞内部物种空间分布具有卵细胞内部物种空间分布具有极性极性，卵内组分沿着卵的主，卵内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成动物级和植物级。卵黄积聚在植物级轴分布不均匀，形成动物级和植物级。卵黄积聚在植物级卵细胞质分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为卵细胞质分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为皮层皮层，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有皮层颗粒和色素皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有皮层颗粒和色素颗粒。大部分卵细胞质颗粒。大部分卵细胞质内质内质是液体状态，内含线粒体是液体状态，内含线粒体和生殖质。和生殖质。卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被 14卵子的发生卵子的发生在哺乳类，所有卵原细胞成熟和卵原细胞转变为卵母细胞是在哺乳类，所有卵原细胞成熟和卵原细胞转变为卵母细胞是在在胎儿分娩前胎儿分娩前完成。完成。卵母细胞形成阶段是卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵为止。为止。直到青春期卵母细胞才进行生长，以后直到青春期卵母细胞才进行生长，以后每个性周期每个性周期后有一批后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中未成熟就退化。未成熟就退化。15卵细胞卵细胞从卵巢排出的卵子，处于减数第二次分裂的中期从卵巢排出的卵子，处于减数第二次分裂的中期，卵子进入输卵，卵子进入输卵管，待受精后才完成第二次成熟分裂管，待受精后才完成第二次成熟分裂。16(二二)卵母细胞的收集、选择与成熟培养卵母细胞的收集、选择与成熟培养 活体卵巢采集活体卵巢采集；屠宰后家畜的卵巢中采集屠宰后家畜的卵巢中采集。卵母细胞的选择卵母细胞的选择:分分A A（三层以上卵丘细胞，卵母细胞质均（三层以上卵丘细胞，卵母细胞质均匀）匀）B B（卵丘细胞低于三层，卵母细胞质均匀（卵丘细胞低于三层，卵母细胞质均匀)、C C（裸露卵母（裸露卵母细胞）和细胞）和D D（死亡或退化卵母细胞）四个等级，一般选择（死亡或退化卵母细胞）四个等级，一般选择A A级和级和B B级卵母细胞。级卵母细胞。17卵母细胞的体外成熟卵母细胞的体外成熟培培养成熟养成熟的标志：生发泡的标志：生发泡破裂；染色体凝集；极破裂；染色体凝集；极体排出；透明带软化；体排出；透明带软化；卵丘细胞扩展。卵丘细胞扩展。18精卵放在一起培养精卵放在一起培养共培养体外受精：共培养体外受精：显微受精技术：透明带下注射法、卵浆内精子注射显微受精技术：透明带下注射法、卵浆内精子注射法、透明带修饰法。法、透明带修饰法。受精卵是否可以发育至受精卵是否可以发育至囊胚囊胚是受精是否成功的标志。是受精是否成功的标志。3 3、体外受精、体外受精19精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。20体外受精体外受精21受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能受精卵需在体外培养发育至桑椹期或囊胚期才能进行移植。移植的进行移植。移植的较佳时期较佳时期是发育至是发育至8-168-16细胞期细胞期的胚胎。的胚胎。4 4、胚胎培养、胚胎培养22卵裂：卵裂：合子发生分裂形成若干小细胞。卵裂细胞不生长合子发生分裂形成若干小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。化的过程。桑椹胚：桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名。卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名。受精卵在进行卵裂的同时，逐渐向子宫腔移动。受精后受精卵在进行卵裂的同时，逐渐向子宫腔移动。受精后7272小时小时，桑椹胚进入子宫腔。，桑椹胚进入子宫腔。23卵巢卵巢24胚泡：胚泡：哺乳动物的胚胎处于哺乳动物的胚胎处于16细胞期的桑椹期时，胚胎是球细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。囊胚：囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层。的细胞组成囊胚层。原肠胚：原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。胚泡腔胚泡腔内细胞群内细胞群25哺乳动物胚泡着床哺乳动物胚泡着床内细胞团：内细胞团：在胚泡胚极一端，能够发育成在胚泡胚极一端，能够发育成为胚胎主体的一团细胞。为胚胎主体的一团细胞。滋养层细胞：滋养层细胞：外层发育成为胎盘的细胞。外层发育成为胎盘的细胞。着床：着床：或叫植入，胚泡和子宫壁相互接触或叫植入，胚泡和子宫壁相互接触并侵入子宫组织的过程。并侵入子宫组织的过程。u时间：时间：在受精后在受精后5 56 6天开始，至天开始，至11111212天完成天完成 u部位：部位：通常在子宫底部或体部通常在子宫底部或体部 26胚泡桑椹胚4细胞 2细胞卵裂受精排卵排卵、受精与卵裂过程排卵、受精与卵裂过程27 5 58 8周周人人胚胚外外形形演演变变2829概念：概念：是指将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵是指将发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的、但未经配种的“受体受体”母畜输卵管或子宫的技术。母畜输卵管或子宫的技术。供体：供体：提供胚胎的个体。提供胚胎的个体。受体：受体：接受胚胎的个体。接受胚胎的个体。“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”胚胎的来源：胚胎的来源：体外受精、培养的胚胎体外受精、培养的胚胎 经超排、输精（体内人工受精）后，回收的早期胚胎经超排、输精（体内人工受精）后，回收的早期胚胎移植的方法：移植的方法：有手术法（小型家畜）和非手术法（大型家畜）有手术法（小型家畜）和非手术法（大型家畜）5 5、胚胎移植、胚胎移植30我国从我国从2020世纪世纪7070年代开始胚胎移植的研究，先后在山羊年代开始胚胎移植的研究，先后在山羊（19741974年）、牛（年）、牛（19781978年）、家兔（年）、家兔（19791979年）上获得成功。年）上获得成功。中国首例胚胎移植的藏獒中国首例胚胎移植的藏獒31胚胎分割：胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎成胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎利用率的一种有效途径。胚胎分割是扩大胚胎利用率的一种有效途径。胚胎分割技术不仅可以使胚胎移植的胚胎数目成倍增加，而胚胎分割技术不仅可以使胚胎移植的胚胎数目成倍增加，而且可以产生遗传性状相同的后代，因此是一种广义上的克隆且可以产生遗传性状相同的后代，因此是一种广义上的克隆技术。技术。胚胎分割与胚胎融合胚胎分割与胚胎融合3233胚胎融合：胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。合体后代的技术。将同一种类的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以获得多个黑白相间将同一种类的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以获得多个黑白相间的花鼠。的花鼠。将不同种的绵羊和山羊的胚胎融合，可得到拥有绵羊和山羊将不同种的绵羊和山羊的胚胎融合，可得到拥有绵羊和山羊双重特性的新品种双重特性的新品种“绵山羊绵山羊”。大鼠大鼠-小鼠、绵羊小鼠、绵羊-山羊、马山羊、马-斑马、黄牛斑马、黄牛-水牛等属间嵌合体水牛等属间嵌合体动物。动物。34异种嵌合体：山羊绵羊异种嵌合体：山羊绵羊35囊胚注射法：囊胚注射法：把某些种类把某些种类细胞（卵裂球、内细胞团细胞（卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞）注射是已经分化的细胞）注射入囊胚的囊胚腔中。入囊胚的囊胚腔中。胚胎融合的方法胚胎融合的方法聚合法：聚合法：两个不同的两个不同的桑椹胚去透桑椹胚去透明带后聚合。明带后聚合。36为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段可以形成具有高度杂种优势的杂合体可以形成具有高度杂种优势的杂合体不仅可成倍缩短家畜改良时间，而且也为创造新型不仅可成倍缩短家畜改良时间，而且也为创造新型的家畜品种提供新的技术手段（如生产具特殊皮毛的家畜品种提供新的技术手段（如生产具特殊皮毛特性的新品种特性的新品种）胚胎融合的意义胚胎融合的意义3719781978年世界首例试管婴儿在英国成功。年世界首例试管婴儿在英国成功。19831983年，澳大利亚创造了世界第一个冷冻试管婴儿。年，澳大利亚创造了世界第一个冷冻试管婴儿。19841984年，澳大利亚诞生了一胚年，澳大利亚诞生了一胚4 4胎的试管婴儿，创造了世界胎的试管婴儿，创造了世界 多胚胎试管婴儿的记录。多胚胎试管婴儿的记录。第三节第三节 试管婴儿试管婴儿世界上第世界上第1 1 例试管婴儿例试管婴儿Louis Brown 在英国诞生在英国诞生38试管婴儿：试管婴儿：体外受精结合胚胎移植技术（体外受精结合胚胎移植技术（IVF-EF），），分别将卵子和精子取出后体外受精，发育成胚胎后分别将卵子和精子取出后体外受精，发育成胚胎后再植回母体子宫内发育、出生获得婴儿的技术。再植回母体子宫内发育、出生获得婴儿的技术。39n n 现在全世界范围内已出生数以万计，妊娠成功率都有迅速的现在全世界范围内已出生数以万计，妊娠成功率都有迅速的提高提高,妊娠率提高到妊娠率提高到20-30%20-30%。n 我国在这方面的工作相对起步较晚，我国在这方面的工作相对起步较晚，19851985年我国台湾省出年我国台湾省出生第生第1 1例试管婴儿，例试管婴儿，19861986年香港也出生年香港也出生1 1例。大陆首例试管婴儿例。大陆首例试管婴儿于于19881988年年3 3月月1010日在北大三院诞生。她的母亲是一位日在北大三院诞生。她的母亲是一位3838岁、原岁、原发不孕发不孕2020年、双侧输卵管不通的患者。年、双侧输卵管不通的患者。40中国双胞胎试管婴儿中国双胞胎试管婴儿41三个阶段的试管婴儿三个阶段的试管婴儿第一代试管婴儿第一代试管婴儿 19771977年年SteptoeSteptoe和和EdwardsEdwards创造的常规试管婴儿为创造的常规试管婴儿为第一代试管婴儿。第一代试管婴儿。42第一代第一代“试管婴儿试管婴儿”正确的称呼应该是正确的称呼应该是体外受精和胚胎移植体外受精和胚胎移植，将卵子和精子先分别在玻璃器皿中培育两天，然后让卵子受将卵子和精子先分别在玻璃器皿中培育两天，然后让卵子受精，待受精卵分裂成有精，待受精卵分裂成有4-84-8个细胞的早期胚胎，再移植入人的个细胞的早期胚胎，再移植入人的子宫内继续生长发育直至分娩。目前全球已诞生了数十万子宫内继续生长发育直至分娩。目前全球已诞生了数十万“试管婴儿试管婴儿”。第一例第一例“试管婴儿试管婴儿”是是19781978年英国专家定制了世界上第一个年英国专家定制了世界上第一个试管婴儿名叫露易丝试管婴儿名叫露易丝-布朗，已婚。第一代布朗，已婚。第一代“试管婴儿试管婴儿”主要主要适合于输卵管堵塞，子宫内膜异位症等引起的不孕症患者。适合于输卵管堵塞，子宫内膜异位症等引起的不孕症患者。全部过程手术费及药费约全部过程手术费及药费约1500015000元。元。43第二代试管婴儿第二代试管婴儿 19921992年年PalermoPalermo的的单精子注射卵细胞浆内单精子注射卵细胞浆内（ICSIICSI）是）是第二代试管婴儿。第二代试管婴儿。通过先进的显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内通过先进的显微注射仪将单个精子注射进卵细胞内使其受精，因此这种方法又称为使其受精，因此这种方法又称为显微受精显微受精。第二代试管婴儿的技术关键在于显微操作系统与注第二代试管婴儿的技术关键在于显微操作系统与注射技术的建立等。射技术的建立等。44第二代第二代“试管婴儿试管婴儿”正确的称呼是正确的称呼是胞质内单精子注射胞质内单精子注射。这是。这是一种精确而细巧的技术，需要在显微镜下操作。一种精确而细巧的技术，需要在显微镜下操作。国内医学界将国内医学界将ICSIICSI称为第二代试管婴儿技术。称为第二代试管婴儿技术。ICSIICSI不仅提高不仅提高了成功率，而且使试管婴儿技术适应症大为扩大，全部过程了成功率，而且使试管婴儿技术适应症大为扩大，全部过程手术费及药费约手术费及药费约18000元元-20000元。此项技术的成功率元。此项技术的成功率45%-45%-50%50%。45第三代试管婴儿第三代试管婴儿 通过通过种植前遗传学诊断种植前遗传学诊断（PGD）技术培育出的试管婴）技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿。儿将被称为第三代试管婴儿。从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断，排除从体外受精的胚胎取出部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎后再进行移植，从而实现胚胎着床带致病基因的胚胎后再进行移植，从而实现胚胎着床前即诊断出遗传病症的愿望。前即诊断出遗传病症的愿望。19901990年，世界首例年，世界首例PGDPGD试管婴儿成功培育。试管婴儿成功培育。46第三代第三代“试管婴儿试管婴儿”实际上侧重于实际上侧重于胚胎着床前的遗传诊断。胚胎着床前的遗传诊断。与第一、二代与第一、二代“试管婴儿试管婴儿”一样，要经过体外受精获得胚胎。一样，要经过体外受精获得胚胎。当胚胎发育到当胚胎发育到4-84-8个细胞的胚胎时，镜下取出个细胞的胚胎时，镜下取出1 1或或2 2个细胞（医个细胞（医学上通常称为分裂球）进行遗传学检查，并保持其完整性。学上通常称为分裂球）进行遗传学检查，并保持其完整性。如果明确如果明确胚胎没有遗传病胚胎没有遗传病，再将它移植到人的子宫内，使之，再将它移植到人的子宫内，使之继续生长发育。继续生长发育。在在19891989年已取得成功。人群中有年已取得成功。人群中有1/5-1/41/5-1/4患有遗传性疾病，平患有遗传性疾病，平均每人携带均每人携带5-65-6个隐性基因，若能够在胚胎移植前就明确有无个隐性基因，若能够在胚胎移植前就明确有无遗传性疾病，将大大提高出生后婴儿的质量。遗传性疾病，将大大提高出生后婴儿的质量。47 借助别人卵浆增强自己卵子活力借助别人卵浆增强自己卵子活力 特征：特征：卵浆置换卵浆置换 主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性。主要针对那些卵子质量不高、活力差的高龄女性。第四代试管婴儿第四代试管婴儿48第四代第四代“试管婴儿试管婴儿”是是卵浆置换技术卵浆置换技术的简称。的简称。20032003年年6 6月月5 5日，武汉大学人民医院生殖医学中心为日，武汉大学人民医院生殖医学中心为4040岁的李女士成功进行卵浆置换手术，标志第四代岁的李女士成功进行卵浆置换手术，标志第四代“试管婴儿试管婴儿”首次在我国成功运用。首次在我国成功运用。手术中医生通过显微镜将李女士卵子内的卵浆与另手术中医生通过显微镜将李女士卵子内的卵浆与另一健康女性的卵浆置换，增强其卵子活力，与其丈一健康女性的卵浆置换，增强其卵子活力，与其丈夫的精子体外结合，受精卵再移入体内。夫的精子体外结合，受精卵再移入体内。49世界试管婴儿诞生记录世界试管婴儿诞生记录 英国女世界第一个试管婴儿英国女世界第一个试管婴儿印度女印度第一个印度女印度第一个英国男第一个男性婴儿英国男第一个男性婴儿澳洲女澳洲第一个澳洲女澳洲第一个澳洲一男一女首例试管婴儿双胞胎澳洲一男一女首例试管婴儿双胞胎英国女第一个黑白混血儿试管英国女第一个黑白混血儿试管 婴儿婴儿美国女美国第一个美国女美国第一个 以色列女以色列第一个以色列女以色列第一个瑞典女瑞典第一个瑞典女瑞典第一个新加坡男东南亚第一个试管婴儿新加坡男东南亚第一个试管婴儿澳洲二女一男首例三胞胎澳洲二女一男首例三胞胎澳洲四男首例四胞胎澳洲四男首例四胞胎50中国台湾男中国台湾男 台湾首例试管婴儿台湾首例试管婴儿中国大陆女中国大陆女 中国大陆首例试管婴儿中国大陆首例试管婴儿北医大三院北医大三院中国大陆男中国大陆男 中国大陆首例三胞胎中国大陆首例三胞胎北医大三院北医大三院中国大陆男中国大陆男 中国大陆首例赠卵试管婴儿中国大陆首例赠卵试管婴儿北医大三院北医大三院中国大陆女中国大陆女 中国大陆首例冻融胚胎试管婴儿中国大陆首例冻融胚胎试管婴儿北医大三院北医大三院51女方超排卵与取卵女方超排卵与取卵精子采集与体外获能处理精子采集与体外获能处理体外受精体外受精受精卵体外培养受精卵体外培养胚胎移植胚胎移植胚胎移植（选择胚胎移植（选择8 8细胞胚胎）与观察细胞胚胎）与观察子宫内发育、婴儿诞生子宫内发育、婴儿诞生 试管婴儿（第一代试管婴儿（第一代 ）技术步骤）技术步骤 52 第四节第四节 核移植动物核移植动物53细胞核移植细胞核移植:是利用显微操作技术将一种动物的细胞是利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物细胞核移植动物又称又称克隆动物克隆动物:用特定发育阶段的核用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。包括育出生的动物。包括胚胎细胞克隆动物胚胎细胞克隆动物和和体细胞克体细胞克隆动物隆动物。54发展历程发展历程19521952年，年，美国人罗伯特美国人罗伯特.布里格斯对豹蛙发育到囊胚布里格斯对豹蛙发育到囊胚期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。食的豹蛙幼体。19581958年到年到19621962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。非洲爪蟾。使用最多的克隆方法使用最多的克隆方法胚胎细胞克隆胚胎细胞克隆551996-1997年首只体细胞克隆动物年首只体细胞克隆动物“多莉多莉”羊的成功证明了羊的成功证明了成熟的体细胞核成熟的体细胞核也具有全也具有全能性。能性。里程碑式的突破里程碑式的突破56Creating DollyCreating Dolly！1997年年2月月22日，英国日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉多莉”羊的克隆成功，羊的克隆成功，从此震惊了世界。从此震惊了世界。57多莉的生命历程多莉的生命历程19981998年年4 4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育克隆动物也能生育。2003.2.142003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊多莉是穿着羔羊服装的老羊”。581 1、核供体细胞的选择（胚胎细胞、核供体细胞的选择（胚胎细胞/胚胎干细胞胚胎干细胞/成体细胞）与成体细胞）与细胞核细胞核的获得。的获得。2 2、核受体细胞的选择（成熟的卵母细胞）与细胞核的去除、核受体细胞的选择（成熟的卵母细胞）与细胞核的去除（显微去核（显微去核/射线去核射线去核/化学法去核）化学法去核）。3 3、细胞核移植：将供体核移植入已去核的受体细胞内常用方、细胞核移植：将供体核移植入已去核的受体细胞内常用方法直接法直接(胞质内胞质内)注射和透明带下注射两种方法注射和透明带下注射两种方法4 4、重组胚泡的激活、重组胚泡的激活(电激活和化学激活电激活和化学激活)。1 1、细胞核移植动物培育流程、细胞核移植动物培育流程595 5、重组胚的培养和移植、重组胚的培养和移植 激活的重组胚激活的重组胚 桑椹胚桑椹胚/囊胚囊胚 胚胎移植胚胎移植6 6、体细胞核移植后代的鉴定、体细胞核移植后代的鉴定体外培养体外培养 体内培养体内培养60使用最多的克隆方法使用最多的克隆方法胚胎细胞分化程度低，容易成功。胚胎细胞分化程度低，容易成功。2 2、胚胎细胞核移植克隆动物、胚胎细胞核移植克隆动物61核移植小鼠（核移植小鼠（19811981年年1 1月月ScienceScience杂志）杂志）62真正意义的克隆真正意义的克隆体细胞克隆体细胞克隆 3 3、体细胞克隆动物、体细胞克隆动物6364应用与意义应用与意义1 1、检验动物细胞全能性、检验动物细胞全能性 2 2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物3 3、利用转基因克隆动物进行生物药物的生产、利用转基因克隆动物进行生物药物的生产4 4、异种器官移植（结合特异基因的敲除）、异种器官移植（结合特异基因的敲除）5 5、治疗性克隆（可以用患者本人细胞培育出新组织）、治疗性克隆（可以用患者本人细胞培育出新组织）65有关克隆动物与人有关克隆动物与人存在的存在的问题？问题？661 1、技术尚不成熟、技术尚不成熟得得到到的的克克隆隆动动物物具具有有极极大大的的偶偶然然性性和和随随机机性性。迄迄今今为为止止，克克隆隆试试验验的的成成功功率率始始终终很很低低。例例如如，在在培培育育多多莉莉的的过过程程中中，科科学学家家共共克克隆隆出出277个个绵绵羊羊胚胚胎胎，最最终终成成功功使使母母羊羊受受孕孕并并生生产产的的只有只有多莉一个多莉一个。目目前前，多多莉莉羊羊的的制制备备还还不不能能重重复复，更更不不能能肯肯定定克克隆隆多多莉莉羊羊的的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。672 2、遗传、疾病问题、遗传、疾病问题 克隆动物克隆动物夭折率高夭折率高，不少克隆动物，不少克隆动物天生患有疾病天生患有疾病或或体形过大。体形过大。克隆动物克隆动物没有没有遗传物质的遗传物质的交流和互补交流和互补，将会加剧一，将会加剧一些遗传疾病的发生。些遗传疾病的发生。683 3、社会、伦理学问题、社会、伦理学问题69社会关系社会关系父子？兄弟？父子？兄弟？母亲？母亲？归属感？归属感？70问题问题1 1：克隆人是不是正常的人？怎样看待克隆人是不是正常的人？怎样看待克隆人？克隆人？71谁生他谁生他?谁养他谁养他?谁爱他谁爱他?谁嫁他谁嫁他?克隆人如克隆人如何生存？何生存？前提：前提：与技术问题脱钩，与技术问题脱钩，只面对情感与伦理只面对情感与伦理。克隆人生出来就是一个与常人无异的人。克隆人生出来就是一个与常人无异的人。72问题问题2：英雄、伟人可以再生吗？英雄、伟人可以再生吗？73性格与情感上：是否完全一样？性格与情感上：是否完全一样？克隆人同正常人一样有情感和感受，但克隆人的情克隆人同正常人一样有情感和感受，但克隆人的情感和被克隆人并不一样。感和被克隆人并不一样。虽然一个人的性格一部分由基因决定，是天生的，虽然一个人的性格一部分由基因决定，是天生的，但外部环境对形成一个人的性格起更大作用。但外部环境对形成一个人的性格起更大作用。74问题问题3 3：身体上任何一部分的细胞是否：身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆？都可以用来克隆？75问题问题4 4：人可以无休止地被克隆吗？人可以无休止地被克隆吗？76问题问题5 5：是否是人类的倒退？是否是人类的倒退？77许多国家出台法律禁止生殖性克隆。许多国家出台法律禁止生殖性克隆。有性生殖是历史进化的结果有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存，利于种族繁衍和生存，以及优良性状的形成。选择以及优良性状的形成。选择无性生殖无性生殖克隆的方式克隆的方式不利于遗传多样性的保护。从有性繁殖到无性繁殖不利于遗传多样性的保护。从有性繁殖到无性繁殖,就就进化而言是一种进化而言是一种退化退化。78保证人工受精、胚胎移植不受环境、地点和时间保证人工受精、胚胎移植不受环境、地点和时间的限制的限制为建立优良动物胚胎库提供可能为建立优良动物胚胎库提供可能 第五节第五节 冷冻保存技术冷冻保存技术79非冷冻保存非冷冻保存 胚胎冷藏保存法：一般在胚胎冷藏保存法：一般在0 044左右保存左右保存冷冻法冷冻法 是指是指196196保存胚胎，保存胚胎，此技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件，同时此技术为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件，同时也便于胚胎的运输与移植。也便于胚胎的运输与移植。抗冻保护剂的选择抗冻保护剂的选择 冷冻方法的选择冷冻方法的选择 胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存80抗冻保护剂的选择抗冻保护剂的选择渗透型冷冻保护剂：属于渗透型冷冻保护剂：属于细胞内冷冻保护剂细胞内冷冻保护剂。常见的有甘油、。常见的有甘油、二甲基亚砜、丙二醇和乙二醇。二甲基亚砜、丙二醇和乙二醇。非渗透型冷冻保护剂：属于非渗透型冷冻保护剂：属于细胞外冷冻保护剂细胞外冷冻保护剂，一般为高分，一般为高分子物质。常见的有单糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）、三糖。子物质。常见的有单糖（葡萄糖）、二糖（蔗糖）、三糖。81冷冻方法的选择冷冻方法的选择程序冷冻与复苏胚胎程序冷冻与复苏胚胎将采集到的胚胎在含将采集到的胚胎在含20%20%小牛血清的小牛血清的PBSPBS溶液中洗涤溶液中洗涤2 2次。次。将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol/L1.4mol/L甘油和甘油和20%20%小牛小牛血清的血清的PBSPBS的冷冻液中平衡的冷冻液中平衡20min20min。将胚胎和冷冻液装入将胚胎和冷冻液装入0.25mL0.25mL胚胎冷冻细管中，封口，并在细胚胎冷冻细管中，封口，并在细管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等。管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等。82将装入胚胎的细管放入冷冻仪中，在将装入胚胎的细管放入冷冻仪中，在00平衡平衡10min10min，以，以1/min1/min的速度降至的速度降至-7-7至至-6-6，平衡，平衡10min10min，然后以，然后以0.30.3的速度降温至的速度降温至-38-38至至-35-35，投入液氮保存。，投入液氮保存。解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10s10s，立即置于立即置于3737水浴解冻，水浴解冻，1min1min后取出完成解冻过程。后取出完成解冻过程。将细管中的冷冻液及胚胎推出，在显微镜下找到胚胎并移将细管中的冷冻液及胚胎推出，在显微镜下找到胚胎并移入解冻液。入解冻液。83玻璃化冷冻与复苏胚胎玻璃化冷冻与复苏胚胎将胚胎在含将胚胎在含20%20%小牛血清的小牛血清的PBSPBS溶液中洗涤溶液中洗涤2 2次。次。将洗涤过的胚胎在室温条件下加入将洗涤过的胚胎在室温条件下加入1.4mol/L1.4mol/L甘油和甘油和20%20%小牛血小牛血清的清的PBSPBS的冷冻液中平衡的冷冻液中平衡10min10min。将胚胎转移到含将胚胎转移到含10%10%甘油甘油+20%+20%乙二醇乙二醇+20%+20%小牛血清的小牛血清的PBSPBS溶液溶液中，立即装入胚胎冷冻细管。中，立即装入胚胎冷冻细管。84将细管在液氮罐颈部预冷将细管在液氮罐颈部预冷5min5min后投入液氮中保存。后投入液氮中保存。解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡解冻时从液氮中取出细管，在空气中平衡7s7s，迅速投入，迅速投入2020温水中，摇动细胞管使其解冻均匀。温水中，摇动细胞管使其解冻均匀。将解冻后的胚胎移入含将解冻后的胚胎移入含1.0mol/L1.0mol/L蔗糖蔗糖+20%+20%小牛血清的小牛血清的PBSPBS溶液溶液中平衡中平衡10min10min，除去保护剂，再用含，除去保护剂，再用含20%20%小牛血清的小牛血清的PBSPBS溶液溶液洗涤洗涤2 2次后用于移植。次后用于移植。85常温保存（常温保存（15-3015-30）低温保存（低温保存（0-50-5）冷冻保存（冷冻保存（-79 /-196-79 /-196）精子的冷冻保存精子的冷冻保存86 玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法 一步化冷冻法一步化冷冻法 超快冷冻法超快冷冻法 卵母细胞的冷冻保存卵母细胞的冷冻保存87性别控制主要有两条途径：性别控制主要有两条途径：1 1 受精前性别控制选择受精前性别控制选择：X X、Y Y精子精子2 2 胚胎移植前性别控制胚胎移植前性别控制：在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后：在移植前对胚胎进行性别鉴定，然后对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目对所需要性别的胚胎进行移植，从而达到控制后代性别的目的，这是动物性别控制较为实用的方法。的，这是动物性别控制较为实用的方法。第六节第六节 性别控制性别控制88免疫学分离法免疫学分离法：Y Y精子存在精子存在H-YH-Y抗原，利用抗原，利用H-YH-Y抗体检测精子质膜上是否存抗体检测精子质膜上是否存在在H-YH-Y抗原。抗原。离心分离法离心分离法：X X精子精子DNADNA含量略大于含量略大于Y Y精子，因此精子，因此X X精子密度较精子密度较Y Y精子略大。精子略大。电泳分离法电泳分离法：Y Y精子负电荷略步小于精子负电荷略步小于X X精子，利用表面电荷差异采用电泳进精子，利用表面电荷差异采用电泳进行分离。行