DB33∕T 2254-2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒 双重荧光定量 RT-PCR 检测方法(浙江省).pdf

TCS 65.020.30 B41 DB33 刀、，江省山巳ET且，万标准DB33/T 2254一-2020猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissible gastroenteritis virus 2020-04-08发布2020-05-08实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T 2254-2020 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省农业农村厅提出C本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位:浙江农林大学。本标准主要起草人:宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程吕勇、章先、杨杨、卫芳芳。I DB33/T 2254-2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒CPorcineepidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒CTransmissiblegastroenteritis virus,TGEV)双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测O2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3 缩略i吾下列缩略i吾适用于本文件OCt值:达到闹值的循环数CCyclethreshold)DEPC:焦磷酸二乙醋CDiethylpyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid)PBS:磷酸盐缓冲液CPhosphateBuffered Saline)PEDV:猪流行性腹泻病毒CPorcineEpidemic Diarrhea Virus)RNA:核糖核酸CRibonucleicAcid)R盯T-P町CR:逆转录聚合酶链式反应CReverseT叶ra旧ansc口r咱寸 i均ptionPolymerase Cha旧ai扫I丑1Rea肌ction丑1T刊GE盯V:猪传染性胃肠炎病毒CTransmissibleGastroenteritis Virus)4 试剂和材料4.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯:所有试剂均用无RNA酶的容器分装。o.01 mol/L PBS和DEPC水配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。4.2 Trizol:RNA抽提试剂，2 C8 C保存。4.3 氯仿2C8 C预冷。4.4 异丙醇2C8 C预冷。4.5 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，2 oC8 C预冷。4.6 DEPC水:配置方法见附录Ao宜直接购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。4.7 O.01 mol/L PBS，而7.2:配制方法见附录A。DB33/T 2254-2020 4.8 2XOne Step RT-PCR buffer(内含PCRbuffer、dNTPs和Mg2)0 4.9 DNA聚合酶HSTaq DNA聚合酶(5U/L)。4.10 反转录酶预混物(内含RNase抑制剂)。4.11 阳性对照:猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭1j!i病毒混合物。4.12 阴性对照DEPC水。4.13 用于RT-PCR反应的引物浓度为10阳ol/L，探针浓度10的nol/L，其序列分别为:PEDV上游引物F:5-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG-3 PEDV下游引物R:5-ACGAACAGCCACATTACCACCAA-3 PEDV探针P:5-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-3，其5端和3端分别标记FAM和MGB;TGEV上游寻|物F:5-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-3 TGEV下游引物R:5-CACTTCTGATGGGCGAGCAT-3 TGEV探针P:5-CACGTTCACACACAAAT-3，其5端和3端分别标记HEX和MGB;4.14 一次性耗材:乳胶手套，灭菌离心管、荧光RT-PCR反应管、无菌PCR吸头。5 器材和设备5.1 电热干燥箱。5.2 高压灭菌锅。5.3 高速台式冷冻离心机:可控温至4C，最大离心速度可达12000 r/min以上。5.4 冷藏冰箱，冷冻冰箱(-80OC)。5.5 荧光PCR检测仪。5.6 微量移液器。6 实验室分区检测实验室应有相应的生物安全设施和功能分区，包括样品处理区、核酸提取区、反应混合物配置区、加样区和扩增区。各功能区有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。7 样品的采集与处理7.1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应无菌操作，防止样本交叉污染。7.2 采样工具7.2.1 药匙、剪刀、摄子，经160oC干热灭菌2ho 7.2.2 无菌棉拭子。7.3 采样方法与样品处理7.3.1 肠内容物的采集与处理无菌操作采取病死或剖杀猪的小肠内容物1g2 g，置于15mL离心管中，按1:4倍体积加入灭菌的0.01mol/L PBS，混匀，反复冻融3次。在4oC条件下以3000 r/min离心20min，取上清液转2 DB33/T 2254-2020 入1.5 mL离心管中编号备用，持检07.3.2 粪便的采集与处理用灭菌药匙采取发病猪新鲜粪便或用无菌棉拭子采取直肠内粪便，置于15mL离心管中，按1:4 倍体积加入灭菌的0.01mol/L PBS，昆匀，反复冻融3次。在4C条件下以3000r/min离心20min,取上洁液转入1.5 mL离心管中编号备用，待检。7.3.3 细胞培养物处理细胞培养物反复冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。7.3.4 样品存放与运输采集的样品密封后，采用保温容器加冰袋或干冰，在6h8 h之内运送到实验室。采集或处理的样品在2C8 C条件下保存不应超过24h;若需长期保存，应放置于80C冰箱中，且应避免反复冻融，冻融不应超过3次。8 核酸提取8.1 一般要求在核酸提取区进行。8.2 酣-氯仿法抽提核酸8.2.1 取n个1.5 mL离心管，其中n为待检样品数、2管阳性对照及2管阴性对照之和，对每个离心管进行编号。8.2.2 每管加入500LTrizo1.分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各100此，颠倒10次泪匀，静置5min;再加入200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s，也可用于反复颠倒混匀。于4C，12000 r/min离心15mino检测过程中不得交叉污染。8.2.3 取与本标准8.2.1中相同数量的1.5 mL离心管，加入500L异丙醇，对每个离心管进行编号。取本标准8.2.2中离心后的上清液约500L转移至相应的高，心管中，在吸取上清液时注意不应吸出中间层，颠倒混匀，-20 C静置30mino 8.2.4 于4C、12000 r/min离心15min，弃上洁，1置于吸水纸上，沾干液体，加入600L75%乙醇，颠倒混匀。8.2.5 于4C、12000 r/min离心15mi丑，弃上洁，倒置于吸水纸上，沾干液体。不同样品应在吸水纸不同地方沾干。8.2.6 4 000 r/min离心10s，用微量移液器小心将残余液体吸干，室温放置3min10 mi丑。8.2.7 加入30LDEPC水，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增:若需长期保存应放置-80C冰箱。8.3 核酸提取等效方法可采用核酸提取试剂盒或全白动核酸抽提仪及配套核酸提取试剂进行核酸抽提。9 荧光定量RT-PCR检测3 DB33/T 2254-2020 9.1 荧光RT-PCR扩增体系的配制在反应混合物配制区进行。设荧光盯-PCR反应数为n，其中n为持检样品数、2管阳性对照及2管阴性对照之和，每个样品测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，转移至加样区加样。表1每个样品反应体系配制表体系组分用量2 X One Step RT-PCR buffer 10L HS Taq 0.4L RT Enzyme Mix 0.4L PEDV上游号|物F0.4 J.lL PEDV l游引物R0.4 J.lL PEDV探针F0.4 J.lL TGEV上游引物F0.4 J.lL TGEV下游引物R0.4 J.lL TGEV探针P0.4L DEPC水4.8L，户tJ4芦f三旦1 18L 9.2 加样在加样区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入按本标准8.2.7中制备的2且RNA溶液，盖紧管盖后，3 000 r/min离心30s，上机前注意检查各反应管是否盖紧。9.3 荧光RT-PCR扩增在扩增区进行。将按本标准9.2离心后的RT-PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样品摆放)11页序。循环条件设置如下:a)42 oC条件下反转录30min;b)95 oC条件下预变性10S;c)95 oC条件下变性5S;60 oC条件下扩增30s,40个循环60oC时设置荧光信号的采集。9.4 荧光通道的设定PEDV Report Dye设定为F脯，Quencher Dye设定为MGB;TGEV Report Dye设定为HEX，Quencher Dye设定为MGB，Reference设定为Noneo10 结果判定10.1 阁值设定阙f直设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以闹直线刚好超过阳性对照、品S型曲线指数扩增初期的荧光值为准。4 DB33/T 2254-2020 10.2 质控标准阳性对照品FAM和HEX通道的Ct值均应30.0，并出现典型的S型扩增曲线:阴性对照品FAM和HEX通道均无Ct值，且无典型扩增曲线。阳性对照和阴性对照同时成立可判定试验有效，否则试验无效。10.3 结果描述及判定10.3.1 若被检样品FAM通道Ct值运36.0，且出现典型的S型扩增曲线，判定为PEDV核酸阳性;若被检样品FAM通道无Ct值，且无典型的扩增由线，判为PEDV核酸阴性;若被检样品FAM通道Ct值36.0，且出现典型S型扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct值三三38.0且出现典型扩增由线者判为PEDV核酸阳性，否则判为PEDV核酸阴性。10.3.2 若被检样品HEX通道Ct值三三36.0，且出现典型的S型扩增曲线，判定为TGEV核酸阳性:若被检样品HEX通道无Ct值，且无典型的扩增由线，判为TGEV核酸阴性:若被检样品HEX通道Ct值36.0，且出现典型S型扩增曲线，宜对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct值38.0且出现典型扩增曲线者判为TGEV核酸阳性，否则判为TGEV核酸阴性。5 DB33/T 2254-2020 A.1 0.01mol/L PBS(pH7.2)的自己制附录A(规范性附录)试齐IJ自己制称取磷酸氢二铀(Na二HP01 12H20)3.0 g，磷酸二氢饵(KH2P04)O.2 g，氯化专甲(KC1)0.2 g，氧化铀(NaCl)8 g，加一级水定容至1000mL，完全溶解后用3mol/L的NaOH调pH为7.2，经121oc(i:2 OC)高压灭菌15min，室温保存。A.2 DEPC7./自甘自己审IJ一级水中加入O.l%DEPC,37 oc作用1h,121 oC(i:2 OC)高压灭菌15mino 6