环状RNA ITCH对高糖诱导的心脏成纤维细胞活化的影响与机制研究.pdf

基础研究环状R NAI T CH对高糖诱导的心脏成纤维细胞活化的影响与机制研究许峥嵘,任卫东,谷君,宁改君,李小菊,赵香,史丽,胡利梅摘要:目的 探讨环状R NAI T CH(C i r c-I T CH)对高糖诱导的心脏成纤维细胞(C F)活化的影响及其机制。方法 体外培养人C F(HC F),按照处理方法的不同分为对照组、高糖组、过表达载体阴性对照(OV-N C)组、C i r c-I T CH过表达载体(OV-C i r c-I T CH)组;模拟物阴性对照 微小R NA(m i R)-N C 组、m i R-2 1 2-3 p模拟物(m i R-2 1 2-3 pm i m i c s)组、抑制物阴性对照(i n h i b i t o r-N C)组、m i R-2 1 2-3 p抑制物(m i R-2 1 2-3 pi n h i b i t o r)组;C i r c-I T CH过表达载体+模拟物阴性对照(OV-C i r c-I T CH+m i R-N C)组、C i r c-I T CH过表达载体+m i R-2 1 2-3 p模拟物(OV-C i r c-I T CH+m i R-2 1 2-3 pm i m i c s)组、C i r c-I T CH过表达载体+小分子干扰R NA阴性对照(OV-C i r c-I T CH+s i-N C)组和C i r c-I T CH过表达载体+S a m d同源物7小分子干扰R NA(OV-C i r c-I T CH+s i-S m a d 7)组,除对照组外,其余各组转染1 2h后采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理进行高糖诱导,检测C i r c-I T CH、m i R-2 1 2-3 p、S m a d 7表达、细胞活力及胶原纤维沉积,并验证m i R-2 1 2-3 p与C i r c-I T CH、S m a d 7靶向关系。结果 与对照组比较,高糖组C i r c-I T CH、S m a d 7mR NA和蛋白表达降低(0.4 50.0 5v s0.9 90.0 7,0.5 10.0 6v s0.9 90.0 8,0.6 80.0 5v s1.1 60.0 7,P0.0 5),m i R-2 1 2-3 p表达升高(2.1 70.1 2v s1.0 10.0 8,P0.0 5),型胶原、型胶原、平滑肌肌动蛋白(-S MA)表达及细胞活力升高(P0.0 5),胶原纤维沉积增多。C i r c-I T CH过表达升高高糖诱导的HC F细胞中S m a d 7表达,降低m i R-2 1 2-3 p、型胶原、型胶原、-S MA表达及细胞活力,减少胶原纤维沉积。m i R-2 1 2-3 p过表达抑制高糖诱导的HC F细胞中S m a d 7表达,而抑制m i R-2 1 2-3 p表达则相反。m i R-2 1 2-3 p过表达或抑制S m a d 7表达均减弱C i r c-I T CH过表达对高糖诱导的HC F细胞增殖、胶原纤维沉积的影响。HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p与C i r c-I T CH、S m a d 7存在靶向关系。结论 C i r c-I T CH靶向抑制m i R-2 1 2-3 p并上调S m a d 7表达,抑制高糖诱导的HC F细胞活化。D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-0 1 2 6.2 0 2 3.0 8.0 2 1基金项目:河北省2 0 1 9年度医学科学研究课题(2 0 1 9 0 8 7 9);张家口市科学技术局2 0 1 9年度市级科技计划项目(1 9 2 1 0 3 0 D);河北省财政厅2 0 1 8年政府资助专科能力建设项目(3 6 1 0 0 9)作者单位:0 7 5 0 0 0河北北方学院附属第一医院内分泌科通信作者:任卫东,E m a i l:1 5 5 3 0 3 9 6 5 3 21 2 6.c o m关键词:R NA,环状;循环微R NA;成纤维细胞;S m a d 7蛋白质;微小R NA-2 1 2-3 pT h e e f f e c t a n dm e c h a n i s mo f c y c l i cR N AI T C Ho nh i g hg l u c o s ei n d u c e da c t i v a t i o no f c a r d i a c f i b r o b l a s t sX uZ h e n g r o n g,R e nW e i d o n g,G uJ u n,N i n gG a i j u n,L iX i a o j u,Z h a oX i a n g,S h iL i,H uL i m e i(D e p a r t m e n t o fE n d o c r i n o l o g y,F i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fH e b e iN o r t hU n i v e r s i t y,Z h a n g j i a k o u0 7 5 0 0 0,H e b e iP r o v i n c e,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to fc i r c u l a rR NAI T CH(c i r c-I T CH)o nt h ea c t i v a-t i o no f c a r d i a c f i b r o b l a s t s(C F)i n d u c e db yh i g hg l u c o s ea n d i t sm e c h a n i s m.M e t h o d s H u m a nC F(HC F)w e r ec u l t u r e da n dd i v i d e d i n t oc o n t r o l g r o u p,h i g hg l u c o s eg r o u p,o v e r e x p r e s s i o nn e g a t i v ec o n t r o l(OV-N C)g r o u p,OV-c i r c-I T CH o v e r e x p r e s s i o n(OV-c i r c-I T CH)g r o u p,m i m i cn e g a t i v ec o n t r o l(m i R-N C)g r o u p,m i R-2 1 2-3 p m i m i cg r o u p,i n h i b i t o rn e g a t i v ec o n t r o l(i n h i b i t o rN C)g r o u p,a n dm i R-2 1 2-3 pi n h i b i t o rg r o u p,c i r c-I T CHo v e r e x p r e s s i o nv e c t o r+m i m i c sn e g a t i v ec o n-t r o l(OV-C i r c-I T CH+m i R-N C)g r o u p,c i r c-I T CH o v e r e x p r e s s i o nv e c t o r+m i R-2 1 2-3 p m i m i c s(OV-c i r c-I T CH+m i R-2 1 2-3 p)m i m i c sg r o u p,c i r c-I T CHo v e r e x p r e s s i o nv e c t o r+s m a l l i n t e r f e r i n gR NAn e g a t i v ec o n t r o l(OV-c i r c-I T CH+s i-N C)g r o u p,a n dc i r c-I T CH o v e r e x p r e s s i o n+S a m dh o m o l o g u e s7s m a l l i n t e r f e r i n gR NA(OV-c i r c-I T CH+s i-S m a d 7)g r o u p.E x c e p t f o r t h e c e l l s f r o m078中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8t h ec o n t r o l g r o u p,3 0mm o l/LD-g l u c o s ew a sg i v e nt h ec e l l so f t h eo t h e rg r o u p s f o rh i g hg l u c o s ei n d u c t i o n i n1 2ha f t e r t r a n s f e c t i o n.T h ee x p r e s s i o no f c i r c-I T CH,m i R-2 1 2-3 pa n dS m a d 7,c e l l v i a-b i l i t y,a n dc o l l a g e nd e p o s i t i o nw e r ed e t e c t e d,a n dt h et a r g e t i n gr e l a t i o n s h i po fm i R-2 1 2-3 p,c i r c-I T CHa n dS m a d 7w a sv e r i f i e d.R e s u l t s C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p,t h ee x p r e s s i o no f c i r c-I T CHa n dS m a d 7a tmR NAa n dp r o t e i nl e v e l sw e r ed e c r e a s e d i nt h eh i g hg l u c o s eg r o u p(0.4 50.0 5v s0.9 90.0 7,0.5 10.0 6v s0.9 90.0 8,0.6 80.0 5v s1.1 60.0 7,P0.0 5),a n dt h ee x-p r e s s i o no fm i R-2 1 2-3 pw a s i n c r e a s e d(2.1 70.1 2v s1.0 10.0 8,P0.0 5),a n d t h ee x p r e s s i o no ft y p ec o l l a g e n,t y p ec o l l a g e na n d-s m o o t hm u s c l ea c t i n(-S MA)a n dc e l lv i a b i l i t yw e r e i n-c r e a s e d(P0.0 5),w h i l e c o l l a g e n f i b e r d e p o s i t i o nw a s e n h a n c e d.O v e r e x p r e s s i o no fC i r c-I T CHi n-c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fS m a d 7i nh i g hg l u c o s e-i n d u c e d HC Fa n dd e c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fm i R-2 1 2-3 p,r e d u c e dt h ee x p r e s s i o no f t y p ec o l l a g e n,t y p ec o l l a g e na n d-S MAa n dc e l l v i a-b i l i t y,a n da t t e n u a t e dc o l l a g e nf i b e rd e p o s i t i o n.O v e r e x p r e s s i o no fm i R-2 1 2-3 pi n h i b i t e dt h ee x-p r e s s i o no fS m a d 7 i nh i g hg l u c o s e i n d u c e dh C F s,w h i l e i n h i b i t i o no f i t se x p r e s s i o ne x e r t e do p p o-s i t ee f f e c t s.O v e r e x p r e s s i o no fm i R-2 1 2-3 po r i n h i b i t i o no f S m a d 7e x p r e s s i o na t t e n u a t e d t h e e f f e c t so fo v e r e x p r e s s i o no f c i r c-I T CHo nh i g hg l u c o s e-i n d u c e dp r o l i f e r a t i o na n dc o l l a g e n f i b e rd e p o s i t i o ni nt h eh C F s.I nt h ec e l l s,m i R-2 1 2-3 ps h o w e dat a r g e t e dr e l a t i o n s h i pw i t hC i r c-I T CHa n dS m a d 7.C o n c l u s i o n C i r c-I T CHt a r g e t s i n h i b i t i o no fm i R-2 1 2-3 pa n du p-r e g u l a t e sS m a d 7e x p r e s s i o n,a n dt h e n i n h i b i t s t h ea c t i v a t i o no fh i g hg l u c o s e-i n d u c e dHC F.K e yw o r d s:R NA,c i r c u l a r;c i r c u l a t i n gm i c r o R NA;f i b r o b l a s t s;S m a d 7p r o t e i n;m i R-2 1 2-3 p 糖尿病心肌病(d i a b e t i c c a r d i o m y o p a t h y,D C M)与糖尿病患者心血管系统疾病的高发病率和病死率密切相关1-2。糖尿病病理刺激下,心脏成纤维细胞(C F)可发生异常增殖并向心肌成纤维细胞转化,分泌过多的细胞外基质,促进心脏纤维化,引起心力衰竭3。环状R NAI T CH(C i r c-I T CH)在糖尿病、心血管疾病中发挥重要作用。C i r c-I T CH可改善链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾脏炎症和纤维化4。但C i r c-I T CH在糖尿病相关心脏纤维化中的作用机制尚有待明确。S t a r b a s e软件分析显示,C i r c-I T CH与微小R NA(m i R)-2 1 2-3 p存在结合位点,S a m d同源物7(S m a d 7)是m i R-2 1 2-3 p的 下 游 靶 基 因。m i R-2 1 2-3 p靶向抑制S m a d 7激活肝星状细胞中转化生长因子(T G F-)通路,促进肝纤维化5。上调S m a d 7可抑制D CM心肌纤维化6。本研究旨在探讨C i r c-I T CH对高糖诱导的人C F(HC F)活化的影响及其机制,为开发D CM治疗靶点提供新的参考。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器 HC F细胞(深圳市豪地华拓生物科 技有限公司)。C i r c-I T CH过 表 达 载 体(OV-C i r c-I T CH)、m i R-2 1 2-3 p模 拟 物/抑 制 物、S m a d 7小分子干扰R NA(s i-S m a d 7)与其阴性对照(OV-N C、m i R-N C、i n h i b i t o r-N C、s i-N C)以及所用引物(上海吉玛制药技术有限公司);L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0(美国I n v i t r o g e n公司);C C K-8试剂(上海吉至生化科技有限公司);S Y B RG r e e nq P C R M a s t e rM i x(美国MC E公司);苦味酸-天狼猩红染液(上海信裕生物科技有限公司);兔抗人型胶原、型胶原、平滑肌肌动蛋白(-S MA)、S m a d 7和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GA P DH)抗体(美国A b c a m公司)。C F X 9 6T o u c h型号实时荧光定量q R T-P C R仪(美国B i o-R a d公司);热电F C型号酶标仪(赛默飞世尔);C K X 5 3型号倒置荧光显微镜(日本O l y m p u s公司);T a n o n3 5 0 0型号凝胶成像分析仪(上海天能公司)。1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养 HC F细胞于含1 0%胎牛血清和1%青、链霉素的DMEM中常规培养,消化传代后选取23代且处于对数生长期的细胞开展后续实验。1.2.2 细胞分组与处理 HC F细胞分为对照组(5mm o l/LD-葡萄糖正常培养)、高糖组(3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)、过表达载体阴性对照(OV-N C)组(转染OV-N C后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)和C i r c-I T CH过表达载体(OV-C i r c-I T CH)组(转染OV-C i r c-I T CH后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理);模拟物阴性对照(m i R-N C)组(转染m i R-N C后,采用3 0 mm o l/LD-葡萄糖处理)、m i R-2 1 2-3 p模拟物(m i R-2 1 2-3 p m i m i c s)组(转染m i R-2 1 2-3 p178中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8m i m i c s后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)、抑制物阴 性 对 照(i n h i b i t o r-N C)组(转 染i n h i b i t o r-N C后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)和m i R-2 1 2-3 p抑制物(m i R-2 1 2-3 pi n h i b i t o r)组(转染m i R-2 1 2-3 pi n h i b i t o r后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理);C i r c-I T CH过表达 载体+模拟物阴性 对 照(OV-C i r c-I T CH+m i R-N C)组(共 转 染OV-C i r c-I T CH和m i R-N C后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)、C i r c-I T CH过表达载体+m i R-2 1 2-3 p模拟物(OV-C i r c-I T CH+m i R-2 1 2-3 p m i m i c s)组(共转染OV-C i r c-I T CH和m i R-2 1 2-3 pm i m i c s后,采用3 0 mm o l/LD-葡萄糖处理)、C i r c-I T CH过表达载体+小分子干扰R NA阴性对照(OV-C i r c-I T CH+s i-N C)组(共转染OV-C i r c-I T CH和s i-N C后,采用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理)和C i r c-I T CH过表达载体+S m a d 7小分子干扰R NA(OV-C i r c-I T CH+s i-S m a d 7)组(共转 染OV-C i r c-I T CH和s i-S m a d 7后,采 用3 0mm o l/LD-葡萄糖处理),每组设6个复孔。使用L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0转染相应质粒载体1 2h后3 0mm o l/LD-葡萄糖处理。4 8h后收集各组细胞,进行相关指标检测。1.2.3 q R T-P C R检测 T R I z o l试剂提取细胞中总R NA,逆转录合成c D NA后进行扩增,获取循环阈值。以GA P DH、U 6为内参基因,采用2-C t法计算相对表达量。引物序列:C i r c-I T CH上游引物:5 -AG C AAT G C AG C AG T T T-3,下游引物:5 -T G-T AG C C C AT C AAGA C A-3;m i R-2 1 2-3 p上 游 引物:5 -G T C G T AT C C AG T G C AG G G T C C GAG-3,下游引物:5 -T G G T T C G T G G G T AA C AG T C T C C-AG T C;S m a d 7上游引物:5 -G C AT T C C T C G GA-AG T C AAGAG-3,下 游 引 物:5 -C C AG G G G C C A-GAT AAT T C G T-3;GA P DH上游引物:5 -C C T G-C C G T C T AGAAAAA C C T G-3,下游 引 物:5 -AG-T G G G T G T C G C T G T T GAAG T-3;U 6上游 引物:5 -C T C G C T T C G G C AG C A C A-3,下 游 引 物:5 -AA C G C T T C A C GAAT T T G C G T-3。1.2.4 C C K-8检测 将各组细胞以每孔3 0 0 0个接种于9 6孔板,培养2 4、4 8、7 2h后每孔添加1 0lC C K-8试剂,继续培养2h,加入1 5 0lDM S O溶液,在酶标仪上(4 5 0n m)测各孔吸光度(A值)。1.2.5 苦味酸-天狼猩红染色 各组细胞经胰蛋白酶消化离心后,4%多聚甲醛室温固定1 5m i n,添加0.5%聚乙二醇辛基苯基醚孵育2 0m i n,再添加苦味酸-天狼猩红染液染色1h,苏木精对比染色5m i n,倒置显微镜下观察细胞染色情况并拍照。1.2.6 W e s t e r nb l o t检测 提取HC F细胞总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量变性蛋白(每泳道2 0g),并转膜,5%脱脂奶粉室温封闭膜1h后加一抗型胶原(11 0 0 0)、型胶原(15 0 0 0)、-S MA(11 0 0 0)、S m a d 7(15 0 0)和GA P DH(12 5 0 0),4孵育过夜。山羊抗兔I g G二抗(15 0 0 0)室温孵育1h。显影,凝胶成像分析仪扫描图像,I m a g eJ软件分析各蛋白条带灰度值(GA P DH为内参蛋白)。1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 S t a r b a s e软件(h t t p:/s t a r b a s e.s y s u.e d u.c n/)预测C i r c-I T CH与m i R-2 1 2-3 p、m i R-2 1 2-3 p与S m a d 7的靶向结合位点。分别将预测到的C i r c-I T CH、S m a d 7与m i R-2 1 2-3 p靶 向 结 合 位 点 记 为WT-C i r c-I T CH、WT-S m a d 7,并对 靶 向 结 合 位 点 进 行 突 变 记 为 突 变(MUT)-C i r c-I T CH、MUT-S m a d 7,上述序列克隆到p s i CHE C K 2荧光报告质粒载体后分别与m i R-2 1 2-3 pm i m i c s或m i R-N C共转染至HC F细胞,转染4 8h后测定细胞相对荧光素酶活性。1.3 统计学方法 应用G r a p h P a dP r i s m8.0.1软件。计量资料以xs表示,两两比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析和q检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 C i r c-I T CH过表达对高糖诱导HC F细胞增殖的影响 与对照组比较,高糖组HC F细胞中C i r c-I T CH表达水平降低,2 4h、4 8h、7 2h细胞活力升高(P0.0 5);分别与高糖组、OV-N C组比较,OV-C i r c-I T CH组HC F细胞中C i r c-I T CH表达水平升高,2 4h、4 8h、7 2h细胞活力降低(P0.0 5,表1)。表1 C i r c-I T CH过表达对高糖诱导的HC F细胞增殖的影响(xs,n=6)组别 C i r c-I T C H细胞活力2 4h4 8h7 2h对照组0.9 90.0 7 0.2 90.0 3 0.4 20.0 30.6 50.0 4高糖组0.4 50.0 5a0.5 10.0 5a0.6 70.0 6a0.8 40.0 6aOV-N C组0.4 70.0 6 0.5 00.0 4 0.6 50.0 60.8 30.0 7OV-C i r c-I T C H组0.9 20.0 8b0.3 40.0 4b0.4 60.0 4b0.6 90.0 5b 注:与对照组比较,aP0.0 5;与高糖组和OV-N C组比较,bP0.0 52.2 C i r c-I T C H过表达对H C F细胞胶原纤维沉积和纤维化标志蛋白表达的影响 与对照组比较,高糖组HC F细胞数量增多,胶原纤维沉积增加,型胶原、型胶原、-S MA蛋白表达水平升高(0.9 4278中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.80.0 7v s0.3 90.0 4,0.8 70.0 6v s0.4 20.0 3,0.8 50.0 5v s0.4 60.0 4,P0.0 5)。与高糖组和OV-N C组比较,OV-C i r c-I T CH组HC F细胞数量较少,细胞间隙变大,胶原纤维沉积减少,HC F细胞中型胶原、型胶原、-S MA蛋白表达水平降低(0.5 30.0 5v s0.9 40.0 7和0.9 10.0 6,0.5 10.0 4v s0.8 70.0 6和0.8 60.0 5,0.5 70.0 5v s0.8 50.0 5和0.8 30.0 6,P0.0 5,图14)。图1 对照组 图2 高糖组 图3 OV-N C组 图4 OV-C i r c-I T C H组 图14 C i r c-I T CH过表达对高糖诱导HC F细胞胶原纤维沉积的影响 苦味酸-天狼星红染色 2 0 02.3 H C F细胞中C i r c-I T C H靶向m i R-2 1 2-3 p及调控S m a d 7表 达 S t a r b a s e软 件 预 测 显 示,C i r c-I T CH与m i R-2 1 2-3 p具有潜在的靶向结合位点。与WT-C i r c-I T CH和m i R-N C共 转 染 比 较,WT-C i r c-I T CH和m i R-2 1 2-3 pm i m i c s共转染HC F细胞的相对荧光素酶活性降低(0.4 50.0 5v s1.0 10.0 8,P0.0 5)。与对照组比较,高糖组HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表达水平升高(2.1 70.1 2v s1.0 10.0 8),S m a d 7信使核糖核酸(mR NA)和蛋白表达水平降低(0.5 10.0 6v s0.9 90.0 8,0.6 80.0 5v s1.1 60.0 7,P0.0 5);分别与高糖组和OV-N C组比较,OV-C i r c-I T CH组HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表达水平降低(1.2 50.1 0v s2.1 70.1 2和2.1 40.1 1),S m a d 7mR NA和蛋白表达水平升高(0.8 70.0 7v s0.5 10.0 6和0.5 20.0 5,1.0 20.0 7v s0.6 80.0 5和0.7 00.0 6,P0.0 5)。2.4 H C F细胞中m i R-2 1 2-3 p靶向S m a d 7表达 S t a r b a s e软件预测显示,m i R-2 1 2-3 p与S m a d 7具有潜在的靶向结合位点。与WT-S m a d 7和m i R-N C共转染比较,WT-S m a d 7和m i R-2 1 2-3 pm i m i c s共转染HC F细 胞 的 相 对 荧 光 素 酶 活 性 显 著 降 低(0.4 30.0 5v s0.9 90.0 7,P0.0 5)。与m i R-N C组比较,m i R-2 1 2-3 pm i m i c s组HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表达水平显著升高(2.8 90.1 2v s1.0 00.0 7),S m a d 7mR NA和蛋白表达水平显著降低(0.4 60.0 5v s1.0 20.0 8,0.3 80.0 4v s0.6 90.0 6,P0.0 5);与i n h i b i t o r-N C组比较,m i R-2 1 2-3 pi n h i b i t o r组HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表 达 水 平 显 著 降 低(0.4 30.0 6v s0.9 90.0 8),S m a d 7 mR NA和蛋白表达水平显著升高(1.7 50.1 1v s0.9 80.0 9,1.2 90.0 7v s0.7 00.0 5,P0.0 5)。2.5 m i R-2 1 2-3 p或S m a d 7介导C i r c-I T C H过表达对高糖诱导H C F细胞增殖的影响 与OV-C i r c-I T CH+m i R-N C组 比 较,OV-C i r c-I T CH+m i R-2 1 2-3 pm i m i c s组HC F细胞中的m i R-2 1 2-3 p表达水平和4 8h细胞活力显著升高(2.7 3 0.1 2v s1.0 1 0.0 8,0.6 10.0 6v s0.4 40.0 4),S m a d 7mR NA和蛋白表达水平显著降低(0.5 30.0 5v s1.0 00.0 7,0.7 50.0 5v s1.0 10.0 8,P0.0 5),4 8h细胞活力显著升高(0.6 40.0 6v s0.4 50.0 5),S m a d 7mR NA和蛋白表达水平显著降低(0.4 10.0 5v s0.9 80.0 6,0.6 90.0 6v s1.0 30.0 7,P0.0 5)。2.6 m i R-2 1 2-3 p或S m a d 7介导C i r c-I T C H过表达对高糖诱导H C F细胞胶原纤维沉积和纤维化标志蛋白表达的影响 与OV-C i r c-I T CH+m i R-N C组比较,OV-C i r c-I T CH+m i R-2 1 2-3 pm i m i c s组HC F细胞数量增多,胶原纤维沉积明显增加,HC F细胞中型胶原、型胶原、-S MA蛋白表达水平升高(0.8 40.0 8v s0.5 10.0 6,0.7 90.0 7v s0.4 80.0 5,0.7 30.0 7v s0.5 60.0 6,P0.0 5);与OV-C i r c-I T CH+s i-N C组 比 较,OV-C i r c-I T CH+s i-S m a d 7组HC F细胞数量增多,胶原纤维沉积亦明显增加,HC F细胞中型胶原、型胶原、-S MA蛋白表达水平升高(0.8 9 0.0 9v s0.5 20.0 7,0.8 50.0 7v s0.5 00.0 6,0.7 80.0 8v s0.5 50.0 5,P0.0 5,图58)。378中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8 图5 OV-C i r c-I T C H+m i R-N C组 图6 OV-C i r c-I T C H+m i R-2 1 2-3 pm i m i c s组 图7 OV-C i r c-I T C H+s i-N C组 图8 OV-C i r c-I T C H+s i-S m a d 7组 图58 C i r c-I T C H过表达基础上m i R-2 1 2-3 p过表达或抑制S m a d 7表达对高糖诱导HC F细胞胶原纤维沉积的影响 苦味酸-天狼星红染色 2 0 03 讨 论c i r c R NA充当m i R NA海绵参与调控心脏纤维化7。有报道高糖诱导大鼠系膜细胞中C i r c-I T CH表达降低,过表达可抑制高糖诱导大鼠肾系膜细胞纤维化和炎性反应4。过表达C i r c-I T CH可改善糖尿病视网膜病变,促进糖尿病足溃疡伤口愈合8。C F过度增殖、胶原纤维过量积聚是导致糖尿病心脏纤维化重要机制9。型胶原、型胶原、-S MA产生和分泌增加是心脏纤维化发生发展的主要体现1 0。本研究发现,C i r c-I T CH过表达可降低高糖诱导HC F细胞活力及型胶原、型胶原、-S MA蛋白表达,减少胶原纤维沉积。C i r c-I T CH可抑制高糖诱导的HC F细胞增殖和胶原沉积。本研究证实,C i r c-I T CH与m i R-2 1 2-3 p存在靶向关系,高糖诱导HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表达升高,C i r c-I T CH过表达可降低高糖诱导的HC F细胞中m i R-2 1 2-3 p表达。提示C i r c-I T CH可能靶向负调控m i R-2 1 2-3 p表达参与高糖诱导的HC F细胞活化。高糖诱导HC F细胞中S m a d 7mR NA和蛋白表 达 升 高,m i R-2 1 2-3 p过 表 达 可 抑 制S m a d 7mR NA和蛋白表达,而抑制m i R-2 1 2-3 p表达则作用相反。提示m i R-2 1 2-3 p可能靶向负调控S m a d 7表达参与高糖诱导的HC F细胞活化。D CM大鼠心肌中S m a d 7蛋白表达下降,上调S m a d 7可改善大鼠心功能和心肌细胞肥大、排列紊乱、间质纤维化等病理损伤。本研究显示,m i R-2 1 2-3 p过表达或抑制S m a d 7表达均可减弱C i r c-I T CH过表达对高糖诱导的HC F细胞增殖、胶原纤维沉积的影响。综上所述,C i r c-I T CH可能通过靶向抑制m i R-2 1 2-3 p调节S m a d 7表达,抑制高