基因编辑技术.ppt

CELLECTIS S.A.NASDAQCELLECTIS S.A.NASDAQ1精选ppt2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功 2精选ppt基因组编辑技术简介基因组编辑技术简介Genome Editing2015.11.22 HuangCH J2083精选ppt修改遗传信息的第一步：修改遗传信息的第一步：按我们的设计来重组按我们的设计来重组DNADNA4精选ppt第一节第一节 基基 本本 概概 念念5精选ppt重组重组DNADNA技术：技术：是指在基因水平上，将是指在基因水平上，将目目的的DNADNA在体外在体外重组重组于能自我复制于能自我复制的的载体载体DNADNA分子分子上，然后将重组上，然后将重组DNADNA导入宿主细胞中进行增生，导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的以获得大量的目的DNADNA片段，或片段，或以此为基础，通过基因的诱导以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。物的过程。又称为又称为分子克隆技术分子克隆技术或或基基因工程技术因工程技术6精选ppt第二节第二节 重组重组DNADNA技术的发展史技术的发展史7精选ppt基因工程的诞生基因工程的诞生1 1、BergBerg的开创性实验第一个实现的开创性实验第一个实现DNADNA重组重组1980年年Nobel化学奖化学奖猴病毒猴病毒SV40SV40的的DNA+DNA+噬菌体的噬菌体的DNADNA2 2 2 2、Boyer-CohenBoyer-CohenBoyer-CohenBoyer-Cohen实验实验实验实验第一个取得基因工程成功第一个取得基因工程成功19731973年构建年构建双重抗药性重组质粒双重抗药性重组质粒19731973年是基因工程诞生的元年年是基因工程诞生的元年8精选ppt第三节第三节 工具酶工具酶9精选pptWerner Arber Werner Arber 理论预见限制酶理论预见限制酶Hamilton O.Smith Hamilton O.Smith 得到第一个限制酶得到第一个限制酶Daniel Nathans Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 SV40 DNADNA片断片断19781978年年NobelNobel生理或医学奖生理或医学奖10精选ppt1.1.定义：定义：能识别双链能识别双链DNADNA分子中某分子中某特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列，并，并 在识别序列内或附近切割在识别序列内或附近切割DNADNA双链结构的一类核双链结构的一类核 酸内切酶（酸内切酶（在核酸分子链的在核酸分子链的内部内部制造切口的酶）制造切口的酶）。2.2.来源来源：原核生物原核生物11精选ppt型酶、型酶、型酶：型酶：具具有有限限制制切切割割与与甲甲基基化化修修饰饰活活性性。型型和和型型酶酶都都没没有多大的实用价值。有多大的实用价值。型酶：型酶：应用广泛，能在应用广泛，能在DNADNA分子内部的特异位点，识别和切分子内部的特异位点，识别和切割双链割双链DNADNA，其切割位点的序列可知、固定。其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制性内切酶就是指通常所说的限制性内切酶就是指型酶。型酶。3.分类分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。：根据结构、作用特点不同，分为三类。12精选ppt识别位点：识别位点：即为即为型酶识别的特殊型酶识别的特殊DNADNA序列。序列。通常是通常是4 48 8个碱基对、具有个碱基对、具有回文序列回文序列的的DNADNA片段片段 5 G A A T T C-3 3 C T T A A G-54.识别和切割位点：识别和切割位点：13精选ppt 5 5突出粘性末端突出粘性末端 3 3突出粘性末端突出粘性末端 平头（钝性末端）平头（钝性末端）14精选ppt55突出黏性末端突出黏性末端(EcoR)：33突出黏性末端突出黏性末端(Pst)：平端缺口（钝性末端）平端缺口（钝性末端）(Sma）5-5-G GAATTC-3 5-G AATTC-3 AATTC-3 5-G AATTC-3 3-CTTAA 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5G-5 3-CTTAA G-5+5-5-CTGCACTGCAG-3 5-CTGCA G-3G-3 5-CTGCA G-33-G3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5ACGTC-5 3-G ACGTC-5+5-5-CCCCCCGGG-3 5-CCC GGG-3GGG-3 5-CCC GGG-33-GGG3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5CCC-5 3-GGG CCC-5+切割方式：切割方式：对对dsDNA 2条链同时切割产生条链同时切割产生3种种不同缺口不同缺口15精选ppt 催化催化DNADNA中相邻的中相邻的55端磷酸基和端磷酸基和3-3-OHOH末端之间形成末端之间形成3535磷酸二酯键。磷酸二酯键。大肠杆菌连接酶大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，只能连接粘性末端，T4T4噬菌体连接酶噬菌体连接酶不不但能连接粘性末端，但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。还能连接齐平末端。ACG-OH P-AATTCGTTACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA16精选ppt具有具有5353聚合活性、聚合活性、5353外切酶活性、外切酶活性、3535外外切酶活性。切酶活性。可用于合成双链可用于合成双链cDNAcDNA分子或片断连接，探针制备，序分子或片断连接，探针制备，序列分析等。列分析等。耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 最适反应温度为最适反应温度为75758080 具有具有5353外切酶活性，不具有外切酶活性，不具有3535外切酶活性外切酶活性17精选ppt （1 1）55端标记端标记 （2 2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接，提高重组效率。连接，提高重组效率。碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAPBAP）和牛小肠碱性磷酸和牛小肠碱性磷酸 酶（酶（CIPCIP）。）。CIPCIP能在能在 1%1%SDSSDS溶液中溶液中68 68 加热加热15 15 minmin而而 失活，故失活，故CIPCIP较为常用。较为常用。去除去除DNA、RNA、dNTP和和NTP 5端的磷酸根。端的磷酸根。18精选ppt催化单脱氧核苷酸转移到催化单脱氧核苷酸转移到DNA3-DNA3-端羟基上。端羟基上。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸55羟基末端磷酸化。羟基末端磷酸化。用途：用途：放射性标记放射性标记DNADNA的的55端端 使缺少使缺少5-5-磷酸基的磷酸基的DNADNA磷酸化用于连接反应。磷酸化用于连接反应。单链核酸内切酶，降解单链单链核酸内切酶，降解单链DNADNA或或RNARNA。19精选ppt第四节第四节 重组重组DNADNA技术常用载体技术常用载体20精选ppt 是指能携带目的基因进入宿主细胞进行是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增扩增和和表达表达的一的一类类DNADNA分子。分子。分类：分类：克隆载体：克隆载体：用于在宿主细胞中用于在宿主细胞中克隆克隆和和扩增扩增外外 源源DNADNA片段。片段。表达载体：表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因用于在宿主细胞中获得外源基因 表达表达产物。产物。21精选ppt1 1、具备复制能力。、具备复制能力。2 2、具备一个或多个筛选标志。、具备一个或多个筛选标志。3 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。4 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位克隆位 点，点，MCSMCS）。）。5 5、具有较高的遗传稳定性。、具有较高的遗传稳定性。22精选ppt 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。的限制酶切点等。质粒质粒DNADNA、噬菌体、噬菌体DNADNA、病毒、病毒DNADNA、酵母、酵母DNADNA23精选ppt1 1、质粒（、质粒（plasmidplasmid）:质粒为细菌染色体之外一些能质粒为细菌染色体之外一些能独立复制独立复制并保持并保持稳稳定遗传定遗传的复制子。结构上，它是一种的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状双链闭合环状的的DNADNA分子分子。24精选pptpBR322pBR322质粒载体质粒载体相对分子质量小，长度为相对分子质量小，长度为4.34.3kbkb。含有氨苄青霉素和四环素的抗性含有氨苄青霉素和四环素的抗性基因基因(AmpAmpr r和和TetTetr r)。有有2424种限制性内切酶位点。种限制性内切酶位点。有一个复制起始点（有一个复制起始点（oriori）及与及与DNADNA复制有关的序列，赋予该质粒复制有关的序列，赋予该质粒复制子特性。复制子特性。为松弛型复制子。为松弛型复制子。25精选ppt 是感染细菌的一类病毒，是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。菌细胞，故称噬菌体。2 2、噬菌体（、噬菌体（bacteriophage,phage)bacteriophage,phage)26精选ppt噬噬菌菌体体生生活活周周期期27精选ppt28精选ppt4 4、病毒、病毒3 3、酵母、酵母酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）：用于大片段：用于大片段DNADNA的克隆。的克隆。29精选ppt第五节第五节 重组重组DNADNA技术技术30精选ppt目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌目的基因与载体目的基因与载体连接成重组连接成重组DNADNA克隆载体的选择克隆载体的选择重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 31精选ppt（1 1）化学合成：）化学合成：已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列或或根据基因产物的氨基酸序根据基因产物的氨基酸序列推导出相应基因列推导出相应基因DNADNA碱基序列。碱基序列。目前使用目前使用DNADNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小合成仪合成的片段长度有限，一般用于小分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用连接酶加以连接。连接酶加以连接。32精选ppt（2 2）构建基因组）构建基因组DNADNA文库：文库：将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基整个基因组因组DNADNA用物理或酶学的方法用物理或酶学的方法切割成预期大小的切割成预期大小的片断片断，并将，并将所有这些片断都与适当的载体所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。保存和扩增。理论上讲，这些重组载体理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基上带有了该生物体的全部基因，称为因，称为基因文库基因文库。33精选ppt(3)(3)构建构建cDNAcDNA文库：文库：34精选ppt(5)(5)直接用限制性内切酶切取、分离：直接用限制性内切酶切取、分离：对一些物理图谱已经确定，背景资料对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。得目的基因。(4)(4)聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）已知目的基因的基因序列，用已知目的基因的基因序列，用PCRPCR从基因组从基因组DNADNA中获得目的基因，或用逆转录中获得目的基因，或用逆转录PCRPCR方法直接从方法直接从mRNAmRNA获得特定基因的获得特定基因的cDNAcDNA。35精选ppt 用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的噬菌体噬菌体和黏性质粒；和黏性质粒；cDNA cDNA文库和克隆较小文库和克隆较小DNADNA片段通常选片段通常选pUCpUC系列质粒；系列质粒；待测待测DNADNA序列使用序列使用M13M13噬菌体。噬菌体。36精选ppt 由同一种限制酶切由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割割或不同的限制酶切割形成形成互补的黏性末端互补的黏性末端。经退火后，由经退火后，由DNADNA连接连接酶连接。酶连接。粘性末端连接：粘性末端连接：37精选ppt 平端平端 DNADNA片段可以在片段可以在T4 DNAT4 DNA连接酶的作连接酶的作用用下相连接，但连接效率较低。为提高连接效下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率率,所用的所用的ATPATP及及T4 DNAT4 DNA连接酶的浓度比粘性末连接酶的浓度比粘性末端端连接要高些。连接要高些。（2 2）平端连接）平端连接：38精选ppt（3 3）定向连接：）定向连接：Eco Eco RR切割位点切割位点BgBg ll切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4T4 DNADNA连接酶连接酶重组体重组体39精选ppt（4 4）同聚物加尾连接：）同聚物加尾连接：40精选ppt（5 5）人工接头连接：）人工接头连接：接头接头是指含有某些是指含有某些限制性内切酶切点的寡限制性内切酶切点的寡核苷酸片段。核苷酸片段。CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R41精选ppt将重组将重组DNADNA或其他外源或其他外源DNADNA导入宿主细胞的常用方法：导入宿主细胞的常用方法：转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。转化（转化（transformationtransformation）：是指将重组质粒：是指将重组质粒DNADNA导入受体细胞。导入受体细胞。转转染染（transfectiontransfection）：将将重重组组噬噬菌菌体体DNADNA直直接接引引入入受受体体细细胞胞的过程。的过程。转导（转导（transductiontransduction）：重组噬菌体：重组噬菌体DNADNA分子，在体外经过包分子，在体外经过包装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将重组重组DNADNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。）。42精选ppt 筛选是指通过某些特定方法，从被转化筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子的过程。阳性重组子的过程。43精选ppt （一）根据遗传表型进行筛选的方法（一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1 1）抗生素抗性筛选）抗生素抗性筛选 （2 2）-半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选（二）（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法根据重组子结构特征进行筛选的方法方法：方法：44精选ppt（1 1）抗生素抗性筛选）抗生素抗性筛选:大多数载体均带有抗生素抗性基因大多数载体均带有抗生素抗性基因b.b.插入失活法插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种抗生素的培养基中生长。这种抗生素的培养基中生长。a.a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞未转化的细胞 则不能生长。则不能生长。45精选ppt(插插入入失失活活法法)抗抗生生素素抗抗性性筛筛选选46精选ppt（2 2）-半乳糖苷酶系统筛选半乳糖苷酶系统筛选47精选ppt48精选ppt（1 1）快速裂解菌落并鉴定分子大小）快速裂解菌落并鉴定分子大小（2 2）内切酶酶切图谱鉴定）内切酶酶切图谱鉴定（3 3）分子杂交）分子杂交（4 4）PCRPCR（5 5）核酸序列测定）核酸序列测定49精选ppt（1 1）分分离：提取和获得目的基因和载体离：提取和获得目的基因和载体（2 2）切切割：分别对目的基因和载体割：分别对目的基因和载体DNADNA 酶切；酶切；（3 3）连连接：目的基因与载体连接，形成接：目的基因与载体连接，形成 新的重组新的重组 DNADNA分子；分子；（4 4）转转化：用重组化：用重组DNADNA分子转化受体细分子转化受体细 胞；胞；（5 5）筛筛选：选：筛选筛选转化成功的细胞克隆转化成功的细胞克隆（6 6）表表达：培养获得外源基因的细胞或达：培养获得外源基因的细胞或 生物体，获得所需的遗传性生物体，获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。状或表达出所需要的产物。小结：小结：50精选ppt修改遗传信息的第二步：修改遗传信息的第二步：怎样将需要的信息导入到细胞？怎样将需要的信息导入到细胞？51精选ppt重组质粒重组质粒DNADNA转化微生物转化微生物化学转化法化学转化法电转化法电转化法基因枪转化法基因枪转化法52精选ppt电转化法的特点电转化法的特点适用微生物多适用微生物多效率高效率高死亡率高死亡率高化学转化法的特点化学转化法的特点适用微生物较少适用微生物较少效率较高效率较高53精选ppt基因枪转化法的特点基因枪转化法的特点适用微生物较少适用微生物较少效率较高效率较高54精选ppt革兰氏阳性菌的转化革兰氏阳性菌的转化一般需要制备原生质体一般需要制备原生质体55精选ppt真菌的转化真菌的转化一般需要制备原生质体一般需要制备原生质体56精选ppt植物遗传转化方法和技术植物遗传转化方法和技术 57精选ppt根癌农杆菌介导的植物转基因根癌农杆菌介导的植物转基因 图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图58精选ppt59精选ppt基因枪介导法基因枪介导法电转化法电转化法PEG转化法转化法花粉管通道法花粉管通道法60精选ppt动物遗传转化方法和技术动物遗传转化方法和技术 61精选ppt原核显微注射法原核显微注射法胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法病毒载体法病毒载体法62精选ppt1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组/敲除的技术基础1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础1987年，Thompsson et al首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善基因重组基因重组/敲除的概念及简史敲除的概念及简史63精选ppt基因敲除的原理基因敲除的原理基因突变基因突变RNAi同源重组同源重组64精选pptRNAi引起基因敲除的机制引起基因敲除的机制65精选pptY同源重组进行的基因敲除是通常意义上同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除的基因敲除Y适用范围适用范围：适用的细胞既可以是适用的细胞既可以是原核细原核细胞胞，也可以是，也可以是真核细胞真核细胞;Y原理原理(应用应用DNA同源重组同源重组原理原理)：通过外源通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组间的同源重组,使外源使外源DNA定点整合到靶定点整合到靶细胞的特定的基因座上细胞的特定的基因座上同源重组引起的基因敲除同源重组引起的基因敲除66精选ppt单交换单交换双交换双交换图图1图图2同同 源源 重重 组组 原原 理理 图图 示示67精选ppt构建与靶基因同源构建与靶基因同源(1015kb)的载体的载体外显子插有外显子插有新霉素抗新霉素抗性基因性基因（neor）作为）作为正选择正选择疱疹病毒胸苷激酶疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为基因作为负选择负选择neor 和和HSV-tk作双重筛选作双重筛选 存活的存活的ES细胞细胞将重组体导入将重组体导入ES细胞，体外培养细胞，体外培养显微注射显微注射回交得到回交得到X被敲除的动物被敲除的动物表型分析表型分析同源重组引起的基因敲除同源重组引起的基因敲除ES细胞细胞技技 术术 路路 线线68精选ppt图图 示示69精选ppt70精选pptZFN 技术原理技术原理锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。71精选pptZFN 技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。72精选ppt73精选ppt崭新的技术崭新的技术-TALEN经典的挑战经典的挑战 染色体染色体DNA序列的人工编辑修改序列的人工编辑修改 （点）突变：（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frame shift（基因敲除，（基因敲除，Knockout）片段删除片段删除 片段插入片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战74精选ppt靶向基因技术经典方法：自杀质粒，同源重组 几率低(1 HR event per 106 cells），难！饱含希望与失望的技术：ZFN，被Sigma公司垄断新的里程碑：TALEN75精选pptTALEN技术技术基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。76精选ppt1989年 植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonas spp.）avrBs3 基因被克隆。2007年 发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3 TA2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17-18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue,RVD)对应识别一个目标碱基 TALEN 发展过程发展过程77精选ppt人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元 14 18个重复真核表达 14 18个重复特异识别指定的14-18 个核酸序列并与之结合34氨基酸单元78精选pptTALEN 发展过程79精选pptTALEN(TALE+FOK I)表达质粒对 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体80精选pptTALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级Donor plasmidHRDonor plasmidLeft armRight armDonor plasmidLeft armRight arm点突变片段删除基因敲入81精选ppt2011年8月，Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。一篇人类干细胞 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 两篇斑马鱼 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇综述Move over ZFNTALEN的最前沿82精选pptTALEN靶向（基因敲除）技术基本流程1.选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X 2X 2X 283精选ppt靶点的靶点的DNADNA序列特征：序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cermak et al.,Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting,Nucleic Acids Research,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软件：https:/boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-https:/boglab.plp.iastate.edu/node/add/talef-off/off/选择确定TALE靶点84精选ppt TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确 欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14-18个）串联克隆即可。TALE识别模块串联构建85精选ppt具专利保护的克隆构建系统具专利保护的克隆构建系统86精选ppt具专利保护的克隆构建系统具专利保护的克隆构建系统步骤一：靶点识别单元串联87精选ppt步骤二：TALEN表达质粒构建具专利保护的克隆构建系统具专利保护的克隆构建系统88精选ppt将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14-18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。X 2真核表达TALEN质粒对89精选ppt步骤三步骤三.将将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。FOKI 内切酶打断靶点区90精选ppt内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。突变体形成91精选pptPCR 酶切法酶切法 利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。经验规律：=2%可用，=10%很好TALEN切割效率检测92精选pptTALEN切割效率检测启动子 ABCDEF stop-Target site-DEFHIJK启动子 ABCDEFHIJK共转染共转染荧光素酶检测质粒荧光素酶检测质粒+TALEN质粒 1+TALEN质粒 2荧光素酶检测法荧光素酶检测法发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。93精选pptTALE技术应用范围细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。真菌：有报道，TALE原理可行。植物：TALE原理发现于植物，需特定转基因技术。动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基因动物构建实验周期较长）。TALEN应用扩展的技术关键：应用扩展的技术关键：切实可靠的表达系统。高效的转基因及克隆筛选技术。94精选pptTALEN与主要类同技术比较siRNA优于TALEN可瞬时转染快速观察效果Knockdown效果确实，可用于必须基因逊于TALEN瞬时转染效果短暂不是彻底knockout慢病毒稳转发生染色体随机整合ZFN优于TALEN经验积累多，技术较成熟逊于TALEN技术复杂，难度高，被Sigma公司垄断靶点序列要求高，难找Off-targeting现象严重经常有显著细胞毒性95精选pptCRISPR-CasCRISPR-Cas系统基因系统基因修饰技术修饰技术96精选pptBiotechnology:RewritingagenomeNature495,5051(07March2013)doi:10.1038/495050a97精选ppt1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大学（年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。两端还存在一段不太长的特有的序列。u2013以后，研究者们在包括以后，研究者们在包括science和和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。的基因修饰。98精选ppt1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。99精选pptCRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两部分组成：识别识别切割切割1 CRISPR-Cas概述概述100精选ppt1.1 CRISPR结构结构CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）CRISPR 是一个特殊的是一个特殊的DNA重复序列家族重复序列家族,广泛分布于广泛分布于细菌和古细菌基因组中。细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守位点通常由短的高度保守的重复序列的重复序列(repeats)组成组成,重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被重复序列之间被 2672 bp 间隔序列间隔序列(spacer)隔开。隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。）与靶基因进行识别。101精选ppt1.1 CRISPR结构结构102精选ppt1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）：存在于存在于CRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。103精选ppt2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行通过对入侵的病毒和核酸进行特异性特异性的识别，利用的识别，利用Cas蛋白进蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。行切割，从而达到对自身的免疫。104精选ppt2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现105精选ppt2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现106精选ppt2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免特异性免疫疫,而这种特异性是由间隔序列（而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（序列（spacer）来实现的。）来实现的。107精选ppt2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为）为NGG。108精选ppt2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求 在人类基因组中，平均每在人类基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。109精选ppt2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求110精选ppt3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰111精选ppt3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系统用设计好的统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。修饰。112精选ppt3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换113精选ppt3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。114精选ppt3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰115精选ppt3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰116精选ppt3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰Cas9sg-RNA117精选ppt 2013年年2月月15日在日在science上发表的上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的的crRNA实实现了同时对两个基因进行编辑。现了同时对两个基因