免疫胶体金技术.ppt

免疫胶体金技术免疫胶体金技术Immune colloidal gold technique 胶体金标记技术的相关定义胶体金标记技术的相关定义l免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。l胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金技术的发展胶体金技术的发展Development of Immune colloidal gold techniqueDevelopment of Immune colloidal gold technique 1939-1939-雏形雏形 KauscheKausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。显微镜下观察金离子呈高电子密度。1971-1971-作为标记物应用于免疫组织化学研究作为标记物应用于免疫组织化学研究 FaulkFaulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974-1974-实现间接免疫金染色法实现间接免疫金染色法 RomanoRomano将胶体金标记到马抗人的将胶体金标记到马抗人的IgGIgG上，实现了间上，实现了间接免疫金染色法接免疫金染色法胶体金技术的种类及优点胶体金技术的种类及优点l l快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法快速免疫金渗滤法(immuogoldimmuogold filtration assay,IGFA)filtration assay,IGFA)即穿流式即穿流式(flow through)(flow through)的固相膜免疫测定。的固相膜免疫测定。主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。标记结合物为免疫金。A A：金标记抗体：金标记抗体B B：标本中的抗原：标本中的抗原C C：包被抗体：包被抗体DD：NCNC膜膜E E：吸水材料：吸水材料F F：塑料盒：塑料盒 l l免疫层析法免疫层析法免疫层析法免疫层析法(immunochromatogra-phyimmunochromatogra-phy，ICA)ICA)是继是继IGFAIGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，之后发展起来的另一种固相膜免疫测定，与与IGFAIGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层基于层析作用的横流析作用的横流 （lateral flowlateral flow）)向另一端移动。移动过向另一端移动。移动过程中被分析物程中被分析物 与固定在膜上某一区域的受体与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者抗原或者抗体抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。免疫胶体金技术的特点免疫胶体金技术的特点优点优点：n n检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果；n n不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；不需仪器设备，操作人员不需特殊训练；n n试剂稳定，适用于单份测定；试剂稳定，适用于单份测定；n n无污染。无污染。n nGICAGICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。即有条件开发生产。n n干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。成为目前成为目前“病人身边检验病人身边检验”（point-of-care testingpoint-of-care testing，POCTPOCT）中广为应用的方法。中广为应用的方法。最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的备出可用于定量测定的GICAGICA试剂。试剂。RocheRoche公司生产的公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICAGICA试剂和匹配的简便测读器试剂和匹配的简便测读器Cardiac ReaderCardiac Reader，其精，其精密度和准确性均符合定量测定要求。密度和准确性均符合定量测定要求。不足：金免疫测定中应用的是单份试剂，难于进行质量控制。即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此金免疫测定一般只能用于定性试验。其定量检测和灵敏度的提高还有赖于新原料和新材料的开发与应用。Colloidal Gold Synthesisn nSolution color varies extensively with particle sizeSolution color varies extensively with particle sizeUsually a deep red,but also dark brown/purple to light Usually a deep red,but also dark brown/purple to light orange/yelloworange/yellown nColloid size can be controlled by Au:Citrate ratiosColloid size can be controlled by Au:Citrate ratiosAnywhere between 1nm-100nm+Anywhere between 1nm-100nm+n nCitrate is easily substituted by other more Au-philic molecules Citrate is easily substituted by other more Au-philic molecules(i.e thiols)(i.e thiols)H2O,100OCH2AuCl4Cit-Cit-Cit-Cit-Turkevich,et.al.Discussions Faraday Soc.1951,No.11 55-75.Procedure of Colloidal Gold SynthesisAdd 100 mL of 1.0%HAuCl4 to a 200 mL Erlenmeyer flask on a stirring hot plate.Add a magnetic stir bar and bring the solution to a boil To the boiling solution,add 1.5 mL of a 1%solution of trisodium citrate dihydrate,Na3C6H5O7.2H2O Stop heating when a deep red color is obtained.Synthesis and properties of different particle size 胶体金粒径胶体金粒径(nm)(nm)1%1%柠檬酸三钠加柠檬酸三钠加入量入量(ml)(ml)胶体金特性胶体金特性 呈色呈色 max max16162 2橙色橙色518nm518nm24.524.51.51.5橙色橙色522nm522nm41411 1红色红色525nm525nm71.571.50.70.7紫红紫红535nm535nmTEM Images of Colloidal Aun nAverage particle size 17nmAverage particle size 17nmGood gold colloids and bad(unstable)gold colloids.劣质金外形不均一，且非球形，有凝集现象，颗粒间变异系数较大 How are the antibodies coupled to the gold?Conjugation of antibodies to gold particles depends upon Conjugation of antibodies to gold particles depends upon three separate but dependent phenomena:three separate but dependent phenomena:n na).ionic attraction between the negatively charged gold and the a).ionic attraction between the negatively charged gold and the positively charged protein positively charged protein n nb).hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface b).hydrophobic attraction between the antibody and the gold surface n nc).Sulfur binding(Cysteine and Methionine)c).Sulfur binding(Cysteine and Methionine)Strongest binding suggested to be the sulfur hinge joining the the two Fc regions胶体金颗粒带电情况 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）SAMPLE GOLD CONJUGATION PROTOCOLn nAdjust the gold colloid to the proper pH;n n Determined the minimum amount of protein;n nFinal conjugation n nPurification Adjust the gold colloid to the proper pH 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pHpH值，一值，一般只有在蛋白质等电点般只有在蛋白质等电点(PI)(PI)略偏碱的条件下二者才能牢略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pHpH值调至值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的需要提高胶体金的pHpH值时可用值时可用0.1molK2CO30.1molK2CO3，需要，需要降低胶体金的降低胶体金的pHpH值时可用值时可用0.1N HCl0.1N HCl。测定金溶液的。测定金溶液的pHpH可可能损害能损害pHpH测定计的探头，因此，一般用精密的测定计的探头，因此，一般用精密的pHpH试纸测试纸测定其定其pHpH即可即可.蛋白蛋白 与胶体金结合的最佳与胶体金结合的最佳pH测定测定n n取若干取若干1.5ml1.5ml的试管，分别加入的试管，分别加入1ml1ml胶体金胶体金n n用用K2CO3K2CO3将将pHpH分别调为分别调为3 3，4 4，5 5，6 6，7 7，8 8，9 9，1010；n n去去9696孔培养板，按孔培养板，按pHpH从高到低分别将上述胶体金分别取从高到低分别将上述胶体金分别取100ul100ul加入孔中，重复三次；加入孔中，重复三次；n n每孔分别加入每孔分别加入20ul20ul浓度为浓度为10%10%的的NaClNaCl溶液，混合，室温下溶液，混合，室温下放置放置10min10min；n n观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pHpHAdjust the gold colloid to the proper pHAdjust the gold colloid to the proper pH常用几种蛋白质标记时胶体金所用的常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pHpH值值Determined the minimum amount of proteinn n（1 1）光电比色法：制备一系列不）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml1ml），），分别加入分别加入5ml5ml胶体金中，迅速混匀，胶体金中，迅速混匀，然后，各加入然后，各加入1ml 10%NaCl1ml 10%NaCl溶液，溶液，摇匀，静置摇匀，静置5min5min后测各管。根据胶后测各管。根据胶体金颗粒的大小，体金颗粒的大小，ODOD在在520520580nm580nm之间测定，以之间测定，以ODOD值为纵坐标，蛋白值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图白质用量为最适稳定量。图5.25.2中中10nm10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为稳定量为45g/ml45g/ml。n n（2 2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5g5g45g45g另设对照管）另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有，各取等体积顺序加入一系列装有1ml1ml胶体金的试管中，胶体金的试管中，5min5min后，在上述各管内分别加入后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%0.1ml 10%氯化钠，依表氯化钠，依表5-55-5顺序进行。顺序进行。n n1.Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml 1.Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml clean plastic tubes.clean plastic tubes.n n2.Adjust the antibody(0.1ug/ul)to the proper pH with 2.Adjust the antibody(0.1ug/ul)to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1.100nM K2CO3 or 100mM HC1.n n3.Add the antibody to each tube in a series from 0-3.Add the antibody to each tube in a series from 0-150ul(ie 0-15ug in steps of 0,1,2,3.15ug).150ul(ie 0-15ug in steps of 0,1,2,3.15ug).n n4.Shake each tube and leave for approximately 5 4.Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate.minutes to conjugate.n n6.To each tube add 100ul of 10%NaC1 and agitate 6.To each tube add 100ul of 10%NaC1 and agitate for 1 minute.for 1 minute.n n7.The Tube containing the minimum amount of 7.The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold sol is indicated by protein required to stabilize the gold sol is indicated by the one in which the color of the gold sol does not the one in which the color of the gold sol does not change from red to blue upon the addition of NaCl.change from red to blue upon the addition of NaCl.Final conjugation(IgG)l lTake 100ml of gold sol and adjust to Ph9Take 100ml of gold sol and adjust to Ph9l lAdjust the dialyzed and centrifuged antibody solution Adjust the dialyzed and centrifuged antibody solution(0.1ug/ul)to pH9.2(0.1ug/ul)to pH9.2l l Add the determined amount of antibody solution Add the determined amount of antibody solution dropwisedropwise to the gold while stirring rapidlyto the gold while stirring rapidlyl lAfter 5 minutes add 10ml of filtered 10%BSA at pH9 and After 5 minutes add 10ml of filtered 10%BSA at pH9 and stir gently for 10 minutes.stir gently for 10 minutes.Purification The gold conjugate must be purified from excess The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before antibody and any small clusters removed before concentrating and storing.concentrating and storing.l l Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle Spin the gold conjugate at speeds according to gold particle size.size.l lThe gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube.Discard the clear supernatant and resuspend the pellet the tube.Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer.with proper buffer.The gold conjugate,if correctly made,will be stable at 4The gold conjugate,if correctly made,will be stable at 4 for for several months.If long term storage is required is should be several months.If long term storage is required is should be aliquoted into 1ml volumes and 20%glycerol added.It may aliquoted into 1ml volumes and 20%glycerol added.It may then be frozen and kept at-20then be frozen and kept at-20 for years.for years.胶体金免疫层析法试剂的组成胶体金免疫层析法试剂的组成uu样品垫样品垫(Sample pad)(Sample pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。质，多种规格，批间稳定。样品垫的作用：样品垫的作用：减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布；去除样品中杂质颗粒；去除样品中杂质颗粒；调节样品液调节样品液pHpH值或粘度等。值或粘度等。样本垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。u结合垫(Conjugate pad)：玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材质，多种规格，批间稳定。结合垫的作用主要为：-吸附一定量的金标结合物颗粒；-吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上；-保持金标结合物颗粒的稳定性；-保证金标结合物颗粒定量完全释放等。u硝酸纤维素膜(Nitrocellulose)：推荐使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等国外公司的硝酸纤维素膜。NC膜的作用：-在检测线和对照线条带区域固定抗体；-样品在NC膜上流动并与试剂混合发生免疫反应；-反应在NC膜上显色，读检测结果 NC膜的重要参数：孔径、对称性、层析速度、表面活性剂、蛋白结合力、强度、表面质量、厚度、批间均一性等。pp硝酸纤维素膜与蛋白结合的原理硝酸纤维素膜与蛋白结合的原理 主要有两种假说：主要有两种假说：1 1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠）首先两者靠静电作用力结合，然后靠HH键和疏水作用来键和疏水作用来维持长时间结合。维持长时间结合。2 2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。时间结合。两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。工作非常依赖实践经验。硝酸纤维膜的选择硝酸纤维膜的选择uu膜的分类标准膜的分类标准膜的分类标准膜的分类标准(mm和和和和s)s)mm:指的是膜孔径，指的是膜孔径，s:s:以秒为单位的定义为，每以秒为单位的定义为，每4cm4cm膜，水的层析时间是膜，水的层析时间是*s.s.换算情况大致为：换算情况大致为：8um=135s8um=135s；6um=180s 6um=180s uu不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响不同秒数的膜对反应的影响 通过速度越快和包被在通过速度越快和包被在T T线的物质反应时间也就越短，读线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。一定就能够真正的提升灵敏度。135s135s一般用在双抗体夹心法，一般用在双抗体夹心法，一般用在双抗体夹心法，一般用在双抗体夹心法，180s180s一般用在竞争法一般用在竞争法一般用在竞争法一般用在竞争法.uu如何选择如何选择物理性能物理性能物理性能物理性能 膜的物理性能主要是膜的物理性能主要是2 2个参数，个参数，膜厚度和宽度膜厚度和宽度 厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/TC/T线宽窄不一，另外也影响爬速；线宽窄不一，另外也影响爬速；宽度宽度(检测区的长度检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系和爬速及灵敏度的关系跑水性能跑水性能跑水性能跑水性能 注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm1cm做一次标做一次标记（总长大于记（总长大于4cm4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。常现象。点样测试点样测试点样测试点样测试 C/TC/T线出线时间和灵敏度线出线时间和灵敏度 u片材：不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了产品的货架期。u吸收垫(Absorbent Pad)：提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸收纸；吸收纸的作用：主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。研究和应用研究和应用胶体金法检测胶体金法检测HEV-IgMHEV-IgM胶体金法检测胶体金法检测TB-Ab(双抗原夹心法双抗原夹心法)THANKS AND BLESSING感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！