中波紫外辐射强度(UV-B)对西藏飞蝗黑色素沉积的影响毕业论文.doc

编号：四川农业大学本科毕业论文（设计）（2015届） 题 目：中波紫外辐射强度（UV-B）对 西藏飞蝗黑色素沉积的影响院 别： 农学院 专 业： 植物保护 姓 名： 周云云 指导教师： （签名）完成日期：2015年4月20日中波紫外辐射强度（UV-B）对西藏飞蝗黑色素沉积的影响农学院 植物保护专业 周云云指导教师：李庆 植物保护专业 教授摘要:为研究西藏飞蝗(Locusta migratoria tibetensis Chen)黑色素沉积与UV-B辐射强度的关系，本试验研究了不同强度中波紫外辐射（UV-B）对西藏飞蝗黑色素累积的影响。结果表明，经黑暗处理的西藏飞蝗成虫的黑色素的含量为3.72%，较对照自然CK光照组黑色素含量（3.94%）下降了5.63%；经UV-B（8W、15W、30W）处理的西藏飞蝗的黑色素含量分别达到4.27%、5.05%、4.26%，较黑暗处理组和对照自然光照组组含量都高，且差异显著（P0.05）；处理UV-B(15W)较处理UV-B(8W)增加18.69%，处理UV-B（30W）较处理UV-B(15W)减少15.74%，差异均极显著（P0.01）；西藏飞蝗能适应高原紫外辐射环境与其体内的黑色素有着密切的关系，在UV-B胁迫下，西藏飞蝗成虫体内的黑色素含量显著增加，是西藏飞蝗对紫外辐射强度大的高原环境的一种重要适应机制。关键词：西藏飞蝗，黑色素，中波紫外辐射Effects of UV-B on content of melanin of Locusta migratoria tibetensis ChenZhou Yunyun Agronomy college of Sichuan Agricultural UniversityDirected by Li Qing(Prof.)Abstract: In order to research the effects of UV-B on the content of melanin of Locusta migratoria tibetensis Chen,we experimented with UV-B differing in strength on Locusta migratoria tibetensis adult systematically in this thesis.The results show that the content of melanin is 3.72% after the treatment of darkness, which decreased in 3.72% compared with content of the control group of natural lighting(3.94%);The treatment of UV-B(8W、15W、30W) made the content of melanin of Locusta migratoria tibetensis reached 4.27%、5.05%、4.26%,which is higher than the content of the group of darkness and control group of natural light,and they are different significantly(P0.05);The treatment of UV-B(15W) increased in 18.69% compared the content of the group of UV-B(8W),in contrast the content of treatment of UV-B(30W) decreased in 15.74% compared with the treatment of UV-B(15W);The melanin is very necessary for Locusta migratoria tibetensis to adapt the environment of Qinghai-Tibet Plateau.The content of melanin of Locusta migratoria tibetensis increased under UV-B stress represent,which is very important to adapt the environment of Qinghai-Tibet Plateau,which is characterized by the intense ultraviolet-B irradiation.Key Words: Locusta migratoria tibetensis; melanin; ultraviolet irradiation. 在3000多年前的中国，蝗灾、旱灾、水灾被列为三大自然灾害，蝗灾给生产和生活造成了极大的影响。徐光启所著农政全书记载“凶饥之因有三：曰水，曰旱，曰蝗。地有高卑，雨泽有偏被；水旱为灾，尚多幸免之处，惟旱极而蝗”1。作为一种世界性的生物灾害，在20世纪80年代至90年代，受异常气候的影响，蝗灾在非洲、中东、澳洲和东南亚的20多个国家频繁发生，给社会造成了严重的损失。为控制蝗虫的危害，澳大利亚、英国、美国以及非洲各国对蝗虫的发生规律及防治技术进行了大量研究2。全球目前已知的蝗虫种类超过1万种，中国有900余种，纵观世界蝗灾发生的历史，在几十种可以形成灾害的蝗虫中，沙漠蝗(Schistocerca gregaria (Forskal)和飞蝗（Locusta migratoria (linnaeus)）是两种最具危害性的成灾种类1,2。飞蝗是飞蝗属（Locusta）仅有的1种蝗虫，广泛分布于东半球的温带和热带部分地区，其分布的北界与欧亚大陆的针叶林地带南缘大体相符，包括亚洲、非洲、大洋洲和欧洲的部分地区，按地理分布的不同和外部形态的差异可为10个亚种2。飞蝗是构成我国蝗灾的一种重要的农牧业害虫，严重影响我国的农牧业生产3，其中在我国分布的有东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis (Meyen)）、亚洲飞蝗(Locusta migratoria migratoria L.)和西藏飞蝗(Locusta migratoria tibetensis Chen)等三个亚种4。我国由于是在飞蝗的分布发生区3，历史上有着大量有关飞蝗分布，发生或成灾的详细记载5。有关亚洲飞蝗、东亚飞蝗的生态、生理学特性已有系统的研究1,5,6,7。 西藏飞蝗是1963 年陈永林先生订立的飞蝗新亚种7，是我国分布的飞蝗亚种之一，历来是影响藏区农牧业生产的重要害虫，主要为害青稞、小麦、狗尾草、蒿草、异针茅、披碱草、芦苇、燕麦、白羊草、早熟禾等作物和杂草8。西藏飞蝗主要分布西藏阿里地区狮泉河流域、象泉河流域、孔雀河流域，日喀则地区、山南地区、林芝地区雅鲁藏布江流域，四川西部甘孜州雅砻江流域、阿坝州，青海省南部玉树州通天河流域9。因而西藏飞蝗长期以来能够适应高海拔、高紫外辐射、低氧及低气压的生活环境。国内对西藏飞蝗的研究仅限于其形态特征、分布及其发生动态等。王翠玲10等人对西藏飞蝗成虫、蝗蝻及卵形态特征进行了较为详细报道。西藏飞蝗的发生规律因地域的差别而有所差异，西藏飞蝗在西藏地区一年发生l代，以卵在土壤中越冬，蝗蝻发生高峰期为5月中下旬，7月上旬初始羽化，8月上旬始见产卵，产卵深度为4176厘米10。王思忠11等人的研究表明，西藏飞蝗在川西高原1年发生1代，某些地区发生不完整2代。西藏飞蝗能够在青藏高原上建立种群，是长期适应高原低压、强紫外辐射环境的结果。李庆22等人研究了紫外辐射胁迫对西藏飞蝗抗氧化系统的影响，研究表明，中、长波紫外辐射能显著提高西藏飞蝗抗氧化酶的活性。黑色素作为一种保护色素能增强生物对环境胁迫的耐受能力12。黑色素不仅存在于高等动物的皮肤、毛发和眼球中，而且在一些植物和昆虫体内也可以大量存在13。黑色素是由吲哚类物质或多酚类物质氧化聚合而成的一类复杂的含氮高聚物14，是目前所知的唯一能够保护生物体免受辐射伤害天然内源生物聚合体15。黑色素有许多重要的生物学功能，其一，就是由于蛋白质的交联会起到强化结构的功能；其二，黑色素形成过程中正醌的产生具有进化上的重要性，因为它们是保守的，特别是那些亲核性的基团，如巯基和氨基，使其获得抗生素特性；其三，黑色素光吸收和光衍射的特性，被利用在光受体的屏蔽上并且被认为对爬行动物体温调节起到一定的作用。据报道鱿鱼墨黑色素具有体外清除自由基螯合金属离子的特性16，鱿鱼墨黑色素还可以保护动物的血清和肝脏中的SOD和CSH-PX活性，使动物血清和肝脏中的MAD和脑脂褐质含量显著降低，起到防止自由基对集体脂质的氧化和对细胞膜的破坏，从而抑制D-半乳糖所致的衰老，有效地清除体内堆积的自由基，使体内自由基防护体系的功能得以恢复17。同时鱿鱼墨黑色素对皮肤细胞的生长和代谢具有一定的促进作用。鱿鱼墨黑色素能有效防止免疫器官的萎缩，达到延缓衰老的目的。青藏高原平均海拔40005000米，由于海拔高，空气干燥、稀薄，常年紫外辐射较强，其中主要以B波段紫外辐射为主18，5-8月是青藏高原一年中紫外辐射最强的时段，辐射量苏海拔的上升而增加，UV-BZ最高可达412.36MW/m2，并呈逐年上升的趋势19-20。西藏飞蝗能够在长期的强紫外辐射的环境下生存和建立种群，与其成虫体内基于黑色素而产生的对紫外辐射的抗逆作用密不可分。目前对西藏飞蝗的黑色素的积累与中波紫外辐射之间的关系尚未有相关研究的报道。研究不同强度的中波紫外辐射下西藏飞蝗黑色素含量的变化，对于探讨西藏飞蝗对青藏高原的环境适应机制具有重要科学价值，同时对西藏飞蝗的黑色素积累与中波紫外辐射之间的关系的揭示将帮助我们更好地预测西藏飞蝗的发生和指导西藏飞蝗的防治。1材料与方法1.1供试虫源西藏飞蝗蝗蝻采自四川省甘孜县卡攻乡(海拔3400m)，于室内以玉米叶片(25-30)培养至成虫期。选取健康、生长一致的西藏飞蝗成虫放入饲养笼中(20头/笼，雌雄各10头)，用新鲜玉米叶于智能人工气候箱(HPG-280HX，哈尔滨东联)(光照时间12h/d温度(251)、湿度50%-60%)中饲喂5-7d后，取其作为供试虫体待用。1.2试验处理1.2.1中波紫外辐射处理参照李庆21等方法。该试验设置3个不同强度中波紫外辐射处理（275-320nm,8W、15W、30W）、自然光照处理和黑暗处理，共5个处理。设置光源与虫笼距离为50cm。2笼为1重复(20头/笼，雌雄各10头)，共40头成虫，各处理重复3次。处理96h后，分别取试虫进行相关测定。1.2.2黑色素的提取与测定1.2.2.1体壁黑色素的提取取经过紫外辐射处理的西藏飞蝗成虫，剪取体壁烘干、磨碎，过100目分析筛。称取70.00g放人锥形瓶中，加入l：l的盐酸280mL，在60的水中加热14h。经离心过滤后得到黑色素粗品。依次分别用蒸馏水、乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤沉淀至洗涤液呈中性，再加入4的氢氧化钠溶液200mL，在80水浴2h，离心即得到含有黑色素的滤液。滤液用1：3的盐酸调pH至l后，在室温静下置12h，离心分离，所得沉淀即为黑色素粗提取物22。1.2.2.2标准曲线的绘制（1）最佳测定条件的选择最佳测定波长的选择：参照孙亚真23测定乌骨鸡黑色素含量的方法，选择=500nm作为西藏飞蝗黑色素的测定波长。 最佳NaOH浓度的选择：以合成的黑色素(国药集团化学试剂有限公司)为标准品，精密称取5mg黑色素，分别溶于0.01、0.05、0.1、0.5、l、2、3molL的Na0H溶液中,100水浴1h，取出，经流水冷却，离心，取上清液于500nm测定吸光度,找出最佳吸光值的NaOH浓度,绘制标准曲线25。最佳测定水浴温度的选择：以合成的黑色素为标准品，配制一定浓度的黑色素溶液测定不同水浴温度下的吸光值，找出最佳的水浴温度。最佳水浴时间的选择：以合成的黑色素为标准品，配制一定浓度的黑色素溶液测定不同水浴时间下的吸光值，找出最佳的水浴时间。（2）标准曲线绘制：称取合成的黑色素标准样品5mg，溶于lmolL的Na0H溶液中，稀释至0-0.12mg/ml,100水浴1h，取出，经流水冷却，离心，取上清液于=500nm下测定其吸光度,以浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。1.2.2.3西藏飞蝗黑色素含量的测定采用吸光值法24测定西藏飞蝗黑色素的含量。精确称取一定质量提取的黑色素，用0.1mol/L的NaOH溶解，配制成浓度为2.5、5.0、10、15、20g/mL的黑色素溶液。在100水浴下加热至完全溶解。于500nm波长下扫描，观察并记录其在可见光下的吸光值。1.2.2.4数据分析 采用SPSS17.0数据处理系统，选用最小显著极差法(LSD)对试验数据进行显著性检验，得出紫外辐射与西藏飞蝗黑色素积累之间的关系，并撰写实验论文。2. 结果与分析2.1 黑色素标准曲线测定结果2.1.1最佳NaOH浓度的选择称取5mg黑色素，分别溶于0.01、0.05、0.1、0.5、l、2、3molL的Na0H溶液中,100水浴1h，取出，经流水冷却，离心，取上清液于500nm测定吸光值,以NaOH浓度为横轴，黑色素的吸光值为纵轴得到下列曲线图，可知在NaOH浓度为0-0.1mol/L之间时，黑色素吸光值与浓度呈正相关，NaOH浓度大于0.1mol/L之后，黑色素吸光值与浓度呈负相关，因而0.1mol/L为NaOH的最佳浓度。图1 不同NaOH浓度下黑色素溶液吸光度变化曲线Fig1 Absorption curve of melanin in different concentration of NaOH2.1.2最佳测定水浴温度的选择由图2可知，随着温度的升高黑色素的溶解度逐渐增大，当温度到达80时已经大部分溶解，之后温度升高溶解度增加趋势微小，温度100时已经不再增加，因而最终确定100为最佳水浴温度。图2 不同水浴温度下黑色素溶液吸光度变化曲线Fig2 Absorption curve in different water bath temperature of melanin2.1.2.3最佳水浴时间的选择如图3可知，随着水浴时间的增加黑色素的溶解度不断增大，时间达到60分钟时间，黑色素基本完全溶解，水浴时间再延长黑色素的溶解度变化不明显，水浴时间达100分钟时黑色素的溶解度已经基本不变，因而为了确保黑色素能够完全溶解，试验选择100分钟作为黑色素的水浴时间。图3 不同水浴时间下黑色素溶液吸光度变化曲线Fig3 Absorption curve in different water time of melanin2.1.2.4标准曲线绘制结果以吸光度为纵坐标，黑色素浓度(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线（如图4），求得回归方程为y=7.689x+0.0011(R2=0.9998)。图4 黑色素标准曲线Fig4 The standard curve of melanin2.2 UV-B对西藏飞蝗黑色素沉积的影响2.2.1各处理西藏飞蝗黑色素含量按照1.2.2的方法测得各处理的三次重复西藏飞蝗黑色素含量及其平均值如表1。可知，各试验处理下三次重复西藏飞蝗黑色素含量平均值依次是，黑暗处理：3.7203%、自然光照：3.9423%、UV-B(8W)：4.2567%、UV-B(15W)：5.0523%、UV-B(30W):4.2676%。表1 各处理西藏飞蝗黑色素含量及其平均值Table1 The content of melanin of Locusta migratoria tibetensis in different treatment and the average of different treatment 注：表中同行数据平均含量不同小写字母分别表示邓肯氏新复极差测验在0.05水平的差异显著性。2.2.2西藏飞蝗黑色素含量随UV-B的变化如图5可知，经试验处理后，西藏飞蝗黑色素含量随着UV-B的增强呈现出先上升后下降的趋势，当UV-B由黑暗处理增强至UV-B(15W)时，西藏飞蝗成虫黑色素含量由3.72%增至5.05%，最大值5.05%出现在UV-B(15W)处，之后UV-B增强，西藏飞蝗成虫黑色素含量反而开始下降。图5 中波紫外辐射对西藏飞蝗黑色素沉积的影响 Fig5 Effects of UV-B on content of melanin of Locusta migratoria tibetensis注：图中小写字母a表示相邻处理间西藏飞蝗黑色素含量的差异显著，大写字母表示西藏飞蝗黑色素含量的差异极显著，P0.05为显著，P0.01为极显著。2.2 UV-B对西藏飞蝗黑色素沉积的影响的显著性分析由表2可知，经试验处理后，与空白对照相比，经黑暗处理的西藏飞蝗成虫黑色素含量下降5.63%，差异未达显著，经不同强度UV-B（8W、15W、30W）处理的西藏飞蝗成虫黑色素含量分别增加了7.80%、28.16%、7.99%，除UV-B(8W)差异达显著(P0.05)外，其余差异均达极显著(P0.01)。另外，在个UV-B处理组之间，处理UV-B(15W)较处理UV-B(8W)的黑色素含量增加18.69%，差异达极显著(P0.01)，处理UV-B(30W)较处理UV-B(15W)的黑色素含量减少15.74%，差异达极显著(P0.01)。表2 中波紫外辐射强度（UV-B）对西藏飞蝗黑色素沉积的影响Effects of UV-B on content of Locusta migratoria tibetensis注：表中最后一列的字母代表该列的处理（a）与处理（b）的差异显著性，表中“-”表示处理(a)与处理(b)下的西藏飞蝗黑色素含量相比减少。3讨论昆虫的生长、繁殖与分布跟环境有着十分密切关系。在自然界中有的昆虫种类只是分布在限定的范围内，但有的昆虫种类则在全球范围内均有分布；有的昆虫只出现在温和季节，而有的昆虫则能在几个季节都保持种群的优势24-25；昆虫不同种类的不同特性是长时间适应环境的结果，昆虫在经环境选择的过程中产生了不同的抗逆特性。生物在逆境环境下产生的活性氧自由基（ROS），使生物体的许多功能分子遭到破坏，但生物体自身的自由基平衡系统可以可以使生物体的自由基维持在一个安全水平，防止自由基对生物体的破坏从而适应不良环境。研究表明黑色素是在酚类物质的聚合和氧化过程中产生的一类黑色或者棕色的高分子化合物的统称，是生物体为了抵抗电离辐射和紫外辐射的伤害而进化而来，是生物体自我保护的一道屏障26。黑色素能够防止自由基对集体脂质的氧化和对细胞膜的破坏，从而抑制D-半乳糖所致的衰老，有效地清除体内堆积的自由基，使体内自由基防护体系的功能得以恢复17，黑色素是目前所知的唯一一种能够帮助生物体抵御辐射伤害的天然内源生物聚合体15，黑色素能够提供一定的机械力使蛋白质不被降解，某些昆虫的表面黑色化使它们更坚硬27，黑色素形成过程中正醌的产生使其获得抗生素特性,例如昆虫的免疫系统,昆虫头足部分的墨和防御性喷雾,黑色素光吸收和光衍射的特性,被利用在光受体的屏蔽上并且被认为对爬行动物体温调节起到一定的作用28。黑色素在生物对抗不良环境的过程中起到了举足轻重的作用。国内学者对西藏飞蝗的研究主要集中在其分布、形态特征、发生动态，防治极其部分生理生化特征等，关于西藏飞蝗对青藏高原的极端环境适应机制鲜有研究。青藏高原平均海拔40005000米，由于海拔高，空气干燥、稀薄，常年紫外辐射较强，其中主要以B波段紫外辐射为主19，西藏飞蝗能够在该环境下生存和发展，不仅得益于李庆22等人研究报道的西藏飞蝗的抗氧化酶系统对紫外辐射和极端温度的抗逆作用，而且还与其成虫体内基于黑色素而产生的对紫外辐射的抗逆作用密不可分。本实验表明，中波紫外辐射诱导了西藏飞蝗成虫黑色素的沉积，且其诱导作用随着UV-B的增强而增强，从而促进西藏飞蝗抗氧化能力的增强，增强了对紫外辐射的抗逆作用，是西藏飞蝗对紫外辐射强度大的青藏高原环境的一种重要适应。但UV-B达到一定程度后其诱导作用开始逐渐减弱,甚至表现出抑制作用，黑色素的含量开始下降，并对西藏飞蝗的机体造成伤害导致虫体出现畸形虫体，残肢等现象，表明此时的中波紫外辐射强度已经超过了西藏飞蝗所能承受的极限水平。西藏飞蝗能够在青藏高原的恶劣环境下生存、繁衍，是长期适应环境的结果。该实验研究表明一定强度范围内的中波紫外辐射能够促进西藏飞蝗的黑色素产生和积累，该研究结果对进一步揭示西藏飞蝗对青藏高原独特地理环境的适应机制有这重要的参考和指导价值，这可能与黑色素的含量对西藏飞蝗免疫系统和体壁硬度的影响有关。但是本实验只是从一个宏观量化的角度进行了探究，且由于试验条件的限制，本试验所使用的黑色素含量测定方法（分光光度法），由于杂质存在的原因可能会使结果存在一定误差，但是完全可以满足本试验的研究需要。至于如何从分子生物学的角度去揭示这一机制还有待进一步的深入研究和发现。参考文献：1 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B:Biointerfaces,2001, 20:315-319.致谢 本论文是在李庆老师的悉心指导下完成的，在实验过程中，得到各位师兄师姐的指导和帮助，在此对他们表示衷心的感谢！在学习期间，农学院的领导和老师们对我的学习和工作上给予了大力的支持和帮助，在此也对他们致以诚挚的谢意!