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DB36∕T 885-2015 南方水稻黑条矮缩病毒RT-PCR检测技术规范.pdf

上传人:au****99 文档编号:206523 上传时间:2023-01-08 格式:PDF 页数:8 大小:436.95KB
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资源描述

1、 ICS 67.060 B22 备案号:48489-2016 DB36 江西省地方标准 DB 36/T 8852015 南方水稻黑条矮缩病毒 RT-PCR 检测技术规范 Rule of RT-PCR Detection on Southern Rice Black-streaked Dwarf Virus 2015-12-21 发布 2016-03-15 实施江西省质量技术监督局 发 布 DB36/T 8852015 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术语和定义.1 3 样品采集.1 4 样品处理.2 5 总 RNA 提取.2 6 RT-PCR.2 7 琼脂糖凝胶电泳.2 8 凝胶成像

2、分析.2 附录 A(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病病原.3 附录 B(规范性附录)TRIzol 法提取总 RNA 技术流程.4 附录 C(规范性附录)SRBSDV 标准样品 RT-PCR 电泳图.5 DB36/T 8852015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业厅提出并归口。本标准起草单位:江西省农业科学院植物保护研究所、江西农业大学农学院。本标准主要起草人:杨迎青、兰波、李湘民、崔汝强、孙晓棠、魏洪义、蒋军喜、陈洪凡、王广利、熊艳。DB36/T 8852015 1 南方水稻黑条矮缩病毒 RT-PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了南方

3、水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的样品采集、样品处理、总RNA提取、RT-PCR、琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析。本标准适用于水稻疑似病株及白背飞虱样品对SRBSDV的RT-PCR检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1 引物 primer 指一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点,在核酸合成反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。2.2 退火温度 annealing temperature 为引物和模板结合时候的温度参数,当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分

4、子时的温度。2.3 反转录PCR reverse transcription PCR(RT-PCR)指一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。2.4 琼脂糖凝胶电泳 agarose gel electrophoresis 指用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。3 样品采集 3.1 水稻疑似病株样品采集 田间将疑似病株连根拔起,用吸水纸包住根部,整株带回实验室,保存于4冰箱、备用。3.2 灯下白背飞虱样品采集 收集测报灯下的白背飞虱,保存于4冰箱、备用。3.3 田间白背飞虱样品采集 DB36/T 8852015 2 在发病田块采用盘拍法采集白背飞虱样品,4冰

5、箱保存、备用。4 样品处理 4.1 疑似病株样品处理 取疑似病株叶片组织100 mg,置于研钵中,加液氮研磨至粉末状。4.2 白背飞虱样品处理 取单头白背飞虱,置于2 mL离心管中,用牙签捣碎成匀浆。5 总 RNA 提取 用TRIzol试剂或试剂盒提取疑似水稻病株及白背飞虱样品的总RNA,TRIzol法提取流程详见附录B,试剂盒提取方法按照相应说明书进行。6 RT-PCR 以实验室保存的标准SRBSDV总RNA为阳性对照,以健康水稻叶片总RNA为阴性对照,采用特异性引物S10-oF(5-CGCGTCATCTCAAACTACAG-3)和S10-oR(5-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-

6、3)对待测样品进行检测。反应在15 L体系中进行,各组分如下:21 Step Buffer 5 L、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.4 L、上下游s10-of/s10-oR各1 L、Total RNA模板 1 L,加RNase Free ddH2O至15 L。扩增程序:50反应30 min;94预变性3 min;94变性30 s,52退火30 s,72延伸1 min,30个循环;72延伸10 min。7 琼脂糖凝胶电泳 取扩增样品5 L,加入1 L 6倍上样缓冲液(6loading buffer),混匀,点样于1.0%的琼脂糖凝胶(含0.05 L/ml EB或G

7、oldview)上样孔中,用0.5TBE缓冲液在5 V/cm8 V/cm电压条件下电泳30 min。8 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶从电泳槽中取出,置于凝胶成像系统下观察、拍照。并参照阳性对照条带大小,确定待测样品是否携带SRBSDV。DB36/T 8852015 3 A A 附 录 A(资料性附录)南方水稻黑条矮缩病病原 南方水稻黑条矮缩病于2001年在我国广东省阳江市首次发现,其症状类似水稻黑条矮缩病,田间调查及室内传毒实验表明,白背飞虱(Sogatella furcifera)是该病毒的主要传毒介体。根据该病原病毒粒体形态、所致水稻细胞病理学特征、自然寄主范围、传毒昆虫种类及其传毒特性、病

8、毒基因组特性及电泳图谱、病毒基因组S9及S10序列,认为该病毒应为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的一个新种,并暂定名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)。DB36/T 8852015 4 B B 附 录 B(规范性附录)TRIzol 法提取总 RNA 技术流程 B.1 取疑似病株组织 100 mg,置于研钵中,加液氮研磨至粉末状。或取单头白背飞虱,置于 2 mL离心管中,用牙签捣碎成匀浆。B.2 处理后的样品置于 2 mL离心管中,加入 1 mL TRIzol充分匀浆

9、,室温静置 5 min。B.3 如样品中含有较多杂质,28,12,000 r/m离心 5 min10 min,用移液器吸取上清,转到一个新的 2 mL离心管中(可选步骤)。B.4 加入 0.2 mL氯仿,剧烈振荡 15 s30 s,静置 2 min3 min。B.5 4,12,000 r/m离心 15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的 60。B.6 小心吸取上清至一新的DEPC处理过的 1.5 mL EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入 0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10

10、min。B.7 4,12,000 r/m离心 10 min。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。B.8 弃上清,于沉淀中加入 75%乙醇(4冰箱预冷)1 mL,4,7,500 r/m离心 5 min,小心吸取弃去上清。B.9 室温放置 5 min10 min,充分干燥RNA沉淀。B.10 加入适量(50 L100 L)DEPC(Rnase Free)H2O溶解RNA(65促溶 10 min15 min)。B.11 取 2 L进行电泳,其余-80保存。DB36/T 8852015 5 C C 附 录 C(规范性附录)SRBSDV 标准样品 RT-PCR 电泳图 注:M:DL2000 DNA Marker;1-2:SRBSDV标准样品;3-4:健康稻株样品。_

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