噬菌体抗体库技术.ppt

噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术1.噬菌体抗体库技术概述2.噬菌体展示系统3.噬菌体抗体技术的操作1.1 1.1 噬菌体抗体库技术原理噬菌体抗体库技术原理1.2 1.2 噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体库的分类1.3 1.3 噬菌体抗体库技术的发展关键噬菌体抗体库技术的发展关键2.1 2.1 丝状噬菌体生物学丝状噬菌体生物学2.2 2.2 噬菌体展示所使用的衣壳蛋白噬菌体展示所使用的衣壳蛋白2.3 2.3 噬菌粒与辅助噬菌体噬菌粒与辅助噬菌体2.4 2.4 多价展示与单价展示多价展示与单价展示3.1 3.1 抗体可变区基因的获得抗体可变区基因的获得3.2 3.2 噬菌体抗体库载体的构建噬菌体抗体库载体的构建3.3 3.3 噬菌体抗体库的筛选噬菌体抗体库的筛选3.4 3.4 影响抗体库筛选效率的因素影响抗体库筛选效率的因素治疗性抗体的发展经历了异源抗体、人源化抗体和人源性抗体几个阶段。目前，人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，而噬茵体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。1.1 噬菌体抗体库技术原理噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术：聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)扩增抗体的扩增抗体的全套可变区基因全套可变区基因,通过噬菌体表面展通过噬菌体表面展示技术示技术,把把Fab段或单链抗体段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面表达在噬菌体的表面,经过经过“吸附吸附-洗脱洗脱-扩增扩增”过程筛选并富集特异性过程筛选并富集特异性抗体。抗体。1.1 噬菌体抗体库技术原理构建的噬菌体抗体库根据其来源可分为2大类，一类为免疫抗体库，另一类为非免疫抗体库。免疫抗体库的抗体基因来源于抗原免疫的个体，因此不需要很大的库容量即可从该类抗体库中筛选到针对某一抗原的特异性抗体。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗体库制备针对弱抗原自身抗原及具有毒性抗原的抗体均无效,而且某一特定的抗体库只能产生针对特定抗原的抗体，不能作为一个广泛应用的平台。1.2 噬菌体抗体库的分类非免疫抗体库包括天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库是采用不经过免疫的淋巴细胞构建的抗体库,半合成抗体库是人工合成一部分可变区序列与另一部分天然序列组合构建的抗体库,而全合成抗体库是指抗体可变区序列全部由人工合成。非免疫抗体库的优点是抗体均来源于人类,是完全的人源化抗体,但亲和力通常较低,除非生成大量的抗体片段。构建这种抗体库的原始材料是种系的VH和/或VL基因片段或者是重排的可变区片段,在这里,一个或多个CDR要进行随机重排。在人类的重链片段中,第一和第二个CDR是由种系编码的,基本上是具有规范结构的。而CDR3是通过D区和J区组合而成的,具有高度的多样性,长度可以从2个氨基酸到26个氨基酸不等,是抗体多样性和特异性的决定因素。因而,半合成抗体库是指用人工合成长度为58或6一巧个氨基酸的CDR3随机序列与人胚系可变区基因(含CDRI和CDRZ)重组而成,在体外模拟V(D)J重排所构建的抗体库。半合成抗体库（1 1）PCRPCR技术的发展技术的发展为了大量扩增抗体基因片段，可设计一系列相应引物，根据抗体中某些序列的相对保守性，利用不同的PCR技术简单有效地扩增出全套抗体可变区基因。一旦多样的IgV区基因组能够扩增，从噬菌体抗体库中即能得到针对不同抗原的高亲和力抗体。1.3 噬菌体抗体库技术的发展关键（2 2）利用大肠埃希菌成功分泌有功能的抗体片段）利用大肠埃希菌成功分泌有功能的抗体片段在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5端加入细菌的信号肽序列，抗体片段即可分泌到周质腔，并在那里完成折叠，成为有功能的蛋白质分子。（3 3）有效筛选系统的建立）有效筛选系统的建立传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原，依赖噬菌体颗粒对目的抗原的亲和力差异来获得较高亲和力的抗体。而目前，可以在体外用完整的固化哺乳动物细胞原核细胞和组织中的天然抗原筛选噬菌体抗体片段。1.3 噬菌体抗体库技术的发展关键2.噬菌体展示系统2.1 丝状噬菌体生物学丝状噬菌体：M13、f1和fd。单链DNA病毒,6407bp。基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白质。与展示密切相关的有两种结构蛋白质。DNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒2.1 丝状噬菌体生物学pIII蛋白结合于E.Coli的F纤毛;病毒ssDNA进入细菌的胞浆合成dsDNA；以dsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNA。第一代噬菌体在感染10分钟后出现在培养液中（37）。感染后1小时内平均每个细胞分泌1000个噬菌体。LifeCycleofM13由于M13噬菌体在增殖期间不裂解宿主菌。简化了噬菌体纯化步骤，只用简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开。2.2 噬菌体展示所使用的衣壳蛋白次要衣壳蛋白次要衣壳蛋白pIIIpIII406aa组成，5个拷贝，位于噬菌体的尾部。由三个功能区组成：N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。N2受体结合区：负责结合F菌毛。CT疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关。G1、G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性。主要衣壳蛋白pVIIIpVIII每个病毒子含约2700个拷贝，约10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表达的多肽是低价的，而以pVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子200个拷贝）。这种高价pVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价pIII展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上。所有Ph.D.文库都是pIII融合方式（每个病毒子展示5个拷贝的外源多肽）。pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?pVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。pIII只要不影响感染，可以展示300aa的多肽。噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86kDa。丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每个 病毒子含个拷贝的pIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。拷贝数不同。2.3 噬菌粒与辅助噬菌体通常用于噬菌体展示的载体有两类：即噬菌体载体和噬菌粒载体。由于噬菌粒载体具有基因组较小、易于操作、可插入的片段较大、转化效率高、产生的重组体更加稳定等优点，目前最常用的就是噬菌粒载体。正常情况下大肠杆菌表达的蛋白并不排出体外，需要前导肽,引导蛋白穿膜，并且在后来被剪切掉。IPTG可以诱导lac操纵子启动转录SacI:GAGCTCXbaI:TCTAGAXhoI:CTCGAGSpeI:ACTAGTHelperphage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶。如果没有Helperphage，噬菌粒就像质粒一样进行扩增。包装后的噬菌体含有两种不同来源的成分：噬菌体质粒和Helperphage。使用野生型辅助噬菌体会导致噬菌体污染,使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段。当有噬菌质粒时，由于噬菌质粒含有野生型M13或者f1复制起始点，因此，单链噬菌质粒的DNA会被优先包装并分泌。Helperphage2.4 多价展示与单价展示使用多价展示还是单价展示的选择与载体类型的选择有关。带有噬菌体正常启动子的普通噬菌体载体一般会形成多价展示。用噬菌体质粒时，以pIII展示为例：10%病毒展示为单价，非常少量的展示为两个拷贝，绝大多数只展示野生型pIII。多价展示会无法鉴定出筛选中亲和性最高的克隆，因为多价位会使弱结合性克隆具有高表观亲和性。单价展示可以保证基于单纯亲和性的筛选。反过来，在一些初始候选者的结合性非常低的应用中（如与一个给定靶标结合的多肽的从头筛选），多价位增加了分离出稀少的及弱结合性的克隆的机会。在这样的项目中，一个常用的实验策略就是以多价展示开始，然后当被展示多肽的亲和性成熟时，转为单价展示。3.噬菌体抗体技术的操作3.1抗体可变区基因的获得构建一个噬菌体抗体库,首先必须克隆出B细胞内抗体的全套可变区基因。考虑到高亲和力抗体筛选所需要的步骤和抗体的多样性,选用淋巴结细胞建库是比较好的。目前,获得可变区基因的途径主要有2个:一是从基因文库中获取可变区基因，但这一过程相当费时,而且由于Ig基因结构的复杂以及大量非功能性假基因的存在,使得从基因文库中筛选出的阳性基因并不一定是可变区基因,还需要将功能性和非功能性重排片段区别开来;二是用PCR法扩增Ig的vH和vL基因,这得益于通用引物的合成并极大地推动了基因工程抗体的研究。但用PCR法扩增某些特定位点Ig的v区基因时,必须严格控制PCR反应条件,以减少非特异性“模板的完整性及浓度高低,引物的设计,退火温度和时间的选择,循环次数的多少等,均可能影响PCR的结果。首先提取细胞的总首先提取细胞的总首先提取细胞的总首先提取细胞的总RNA,RNA,经过经过经过经过RTRT-PCRPCR扩增可变区基因扩增可变区基因扩增可变区基因扩增可变区基因酶切酶切酶切酶切轻链轻链轻链轻链PCRPCR产产产产物和表达载体物和表达载体物和表达载体物和表达载体二者连接，转入感受态细胞中扩增二者连接，转入感受态细胞中扩增二者连接，转入感受态细胞中扩增二者连接，转入感受态细胞中扩增成为轻链库成为轻链库成为轻链库成为轻链库重链的重链的重链的重链的PCRPCR产物产物产物产物酶切酶切酶切酶切酶切酶切酶切酶切二者按照一定比例连接二者按照一定比例连接二者按照一定比例连接二者按照一定比例连接转化入感受态细胞转化入感受态细胞转化入感受态细胞转化入感受态细胞加入噬菌体加入噬菌体加入噬菌体加入噬菌体收集噬菌体颗粒收集噬菌体颗粒收集噬菌体颗粒收集噬菌体颗粒噬菌体总抗体库噬菌体总抗体库噬菌体总抗体库噬菌体总抗体库3.2 噬菌体抗体库载体的构建单链抗体单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面表达在噬菌体的表面3.3噬菌体抗体库的筛选（1）亲和筛选亲和筛选分为直接法和间接法。直接法是将蛋白质分子偶联到固相支持物上,文库噬菌体与固相支持物温育,洗去未结合的噬菌体,即获得亲和噬菌体。间接法是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上,洗去未结合的噬菌体,保留得到的结合状态的噬菌体。改变洗脱条件洗脱结合的噬菌体,用这部分噬菌体感染细菌,扩增后进行下一轮的筛选,通过反复几次筛选即可得到高亲和力的抗体。（2）细胞筛选亲和筛选技术的前提条件是所针对抗原的性质明确,且可获得纯品。对于无法提纯或性质不确定的抗原(如癌细胞表面受体或某种组织、细胞表面,以及在特殊分化或疾病诱导状态下细胞表面的新型标志物),亲和筛选方法就不再适用。将阳性抗原细胞用荧光素或生物素标记后与阴性抗原细胞混合,再加入抗体库温育,最后通过流式细胞术或磁珠分离。用细胞系从单链抗体库中筛选出了与细胞表面受体结合的噬菌体抗体。但细胞筛选在应用中仍存在一定难度,表现为非特异性大、背景值高、洗涤过程中特异性配体损失等。这主要由于细胞膜表面成分极其复杂,有许多蛋白、糖类、脂类结构,非特异性噬菌体抗体结合到细胞表面的几率更大,且膜表面抗原密度很低,很难获得针对某一抗原的单链抗体。（3）体内筛选体内筛选适用于无法分离培养用于筛选的细胞,或抗体与体内细胞间的相互作用过于复杂无法在体外实现的情况。使用体内筛选时将噬菌体抗体库注射入动物机体,回收动物器官分离抗体,再经过多轮的筛选,扩增,纯化得到目的抗体。但由于该方法涉及体内的多种生物学过程,影响因素多且无法预测,成功率低,还有待于进一步的发展。3.43.4影响抗体库筛选效率的因素影响抗体库筛选效率的因素（1）库容量通常筛选库容量较小的抗体库(E7E8)时,在前几轮采用中等的严谨度有利于避免高亲和性低表达的克隆的丢失,而对较大的抗体库的筛选,则可采用较高的严谨度以便较快地富集亲和性克隆。（2）去污剂在结合或清洗Buffer中添加去污剂（通常是Tween-20）能降低噬菌体与靶分子和/或封阻试剂BSA之间的非特异性相互作用。最初几轮淘选中用较低浓度的Tween会增加洗脱物滴度，然后每轮逐渐增加Tween浓度（最大可到0.5%）来逐步提高选择的严格性。用0.5%恒定Tween浓度和逐步增加的Tween浓度（0.1,0.3,0.5%）分别进行三轮淘选，获得了相同的共有序列。当所研究的相互作用特异性比较强，以至于最初几轮淘选洗脱物的滴度（即：可结合序列的数目）可能会非常低时，建议初始几轮淘选使用较低的Tween浓度。（3）温度根据所研究的结合相互作用是焓驱动还是熵驱动，可以通过提高结合步骤的温度来分别增加和降低选择的强度。建议试用的结合温度为：4、室温和37。温度可以高至55而不失活噬菌体。（4）结合和洗脱时间结合时间短，易于筛选到快速结合（kon）的小肽；相反，洗脱时间长，容易筛选到解离速度（koff）慢的小肽。由于小肽结合到靶分子上的结合平衡常数ka等于kon/koff，那么，就可以通过缩短结合时间和延长洗脱时间的方式来提高筛选的严格度。在最后几轮淘选试验中，洗脱可以在两个阶段进行：在短时间内洗脱的噬菌体抛弃，长时间洗脱下来的噬菌体进行下一轮淘选或铺板。如果用pH2.2的甘氨酸缓冲液洗脱，时间不要长于10 min，否则噬菌体的感染性会降低。（5）靶分子的浓度如果在液相中对靶分子进行淘选，可以通过降低靶分子的浓度来提高淘选的严格程度。建 议 用10 nM的初始靶分子浓度，在最后几轮筛选纳摩尔级亲和力配体时也可将浓度降低到1 nM。（6）淘选轮数每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的肽序列在噬菌体库中得到富集。保持每轮的噬菌体加入浓度相同，就会使展示特定结合序列的病毒子在库中的含量逐步增加，直到大多数或所有洗脱粒子都会展示一个共有序列。根据所研究的相互作用和所施加的筛选严格度的不同，通常会在2-3轮淘选后能达到这种情况。如果3轮淘选后也没有明显的共有序列发现，则第三轮的洗脱物应当继续扩增进行第四轮淘选试验。此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！此课件下载可自行编辑修改，此课件供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！