霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其免疫调节作用.pdf

黄科，林启焰，杨迎，等.霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其免疫调节作用 J.食品工业科技，2023，44（20）：213220.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120003HUANG Ke,LIN Qiyan,YANG Ying,et al.Study on Process Optimization and Immunomodulatory Effect of DendrobiumHuoshanense TeaJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(20):213220.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120003 工艺技术 霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其免疫调节作用免疫调节作用黄科1,2，林启焰2,3，杨迎1,2，侯婷婷1,2，韩邦兴2,3，刘东2,3,*（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230012；2.安徽省中药生态农业工程研究中心，安徽六安237012；3.皖西学院生物与制药工程学院，安徽六安237012）摘要：为了探究霍山石斛（Dendrobium huoshanense，DH）与祁门红茶（Keemunblacktea，KBT）协同预防免疫力降低的效果，以石斛多糖提取率和红茶多酚提取率为指标，通过单因素实验和正交试验对霍山石斛和祁门红茶的料液比、提取时间和提取次数因素进行研究，分别优化霍山石斛与祁门红茶的提取工艺，再通过对RAW264.7 细胞的毒性试验和吞噬活力试验确定红茶与石斛的最佳配比。结果表明，石斛多糖的最佳提取条件为：料液比 1:80（g/mL），提取时间 80min，提取次数 4 次；茶多酚的最佳提取条件为：料液比 1:80（g/mL），提取时间 25min，提取次数 5 次。通过观察不同比例的混合物对巨噬细胞的影响，确定红茶与石斛的配比。体外试验结果表明，75%红茶和 25%石斛配比的祁门红茶和霍山石斛提取混合物（KeemunblackteaandDendrobiumhuoshanense，KTDH）具有最佳的免疫增强效果。体内试验结果表明 KTDH 高剂量组对小鼠由于免疫抑制而显著上调作用的细胞因子 IL-2 和 IL-6 水平有显著回调作用（P0.01）。综上所述，霍山石斛与祁门红茶可协同增强免疫力并预防免疫力下降，可为霍山石斛和祁门红茶的开发应用途径提供新思路。关键词：霍山石斛，祁门红茶，提取工艺，免疫调节本文网刊:中图分类号：TS278文献标识码：B文章编号：10020306（2023）20021308DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120003StudyonProcessOptimizationandImmunomodulatoryEffectofDendrobiumHuoshanenseTeaHUANGKe1,2，LINQiyan2,3，YANGYing1,2，HOUTingting1,2，HANBangxing2,3，LIUDong2,3,*（1.CollegeofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230012,China；2.AnhuiEcologicalAgricultureEngineeringResearchCenterofTraditionalChineseMedicine,Liuan237012,China；3.CollegeofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Liuan237012,China）Abstract：ToexplorethesynergisiceffectofDH(Dendrobium huoshanense)andKBT(Keemunblacktea)onpreventingimmunityreduction.Thesolid-liquidratio,extractiontimeandextractiontimesofDHandKBTwerestudiedbysinglefactortestandorthogonaltestwiththeextractionrateofDendrobiumpolysaccharideandblackteapolyphenolsasindexes,theextractiontechniquesofDHandKeemunblackteawereoptimizedrespectively.TheoptimalratioofKBTandDHwasdeterminedbytoxicitytestandphagocytosistestonRAW264.7cells.TheresultsshowedthattheoptimumextractionconditionsofDHpolysaccharidewereasfollows:Theratioofmaterialtoliquidwas1:80(g/mL),theextractiontimewas80min,andtheextractiontimeswere4times.TheoptimumextractionconditionsofKBTpolyphenolswereasfollows:收稿日期：20221205基金项目：安徽省高校协同创新项目（GXXT-2019-049）；安徽省科技省重大专项项目（202103b06020004）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）。作者简介：黄科（1999），男，硕士，研究方向：中药药理学，E-mail：。*通信作者：刘东（1984），男，博士，副教授，研究方向：中药和天然产物及其纳米药物的制备及质量控制研究，E-mail：。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023Theratioofmaterialtoliquidwas1:80(g/mL),theextractiontimewas25min,andtheextractiontimeswere5times.TheratioofKBTtoDHwasdeterminedbyobservingtheeffectofdifferentproportionsofthemixtureonmacrophages.Theresultsofthein vitroexperimentshowedthattheextractmixtureof75%KBTand25%DHhadthebestimmune-enhancingeffect.Theresultsofthein vivotestshowedthatthehigh-dosegroupofKTDHcouldsignificantlyreducethechangesoflevelsofcytokinesIL-2andIL-6duetoimmunosuppressioninmice(PAB，也就是提取次数料液比提取时间。因此可以确定在实际操作中提取次数对祁门红茶提取效果影响最大，提取时间影响最小。由表 3 可知其组别中得率最高的提取条件为 A3B1C3，而根据各条件 K 值推断得出的最佳提取条件则是 A3B3C3，对两种方法进行重复实验对比，发现两种提取条件无显著性差异，为了节约时间成本，因此最终选用 A3B1C3作为最后的提取条件。将该条件经过 3 次重复性验证，确定其方法具有稳定性和较好的提取效果。霍山石斛的正交试验结果如表 4 所示，根据极差分析，影响霍山石斛多糖得率的各提取因素的主次顺序为 ACB，也就是料液比提取次数提取时间。说明在提取过程中料液比对霍山石斛多糖得率的影响最大，提取时间影响最小。由表 4 可知，最佳提取条件为 A2B3C2。将该条件经过 3 次重复性验证，确定其方法具有稳定性和较好的提取效果。表4霍山石斛正交试验结果Table4ResultsoforthogonaltestofDendrobiumhuoshanensis实验号A料液比B提取时间C提取次数多糖得率（%）111162.52212271.55313368.25421173.10522370.25623276.40731370.32832171.67933274.94K1202.32205.94207.29K2219.75213.47222.89K3216.93219.59208.82R17.4313.6515.60最佳条件A2B3C22.4提取混合液对免疫细胞增殖活力与吞噬活力的影响以不同浓度的 KTDH（0、2.5、5、10、20、40、50、100g/mL）孵育 RAW264.7 细胞 24h，观察 KTDH对 RAW264.7 细胞的毒性作用。从图 3 可以看出，KTDH（100%霍山石斛）对细胞活力没有明显增强甚至略有降低，该结果可能是由于霍山石斛多糖具有免疫调节作用，而其他成分对细胞有微弱毒性，细胞吞噬过程中二者皆有摄入，因此导致本组的免疫细胞活力增强不明显甚至降低。KTDH（100%祁门红茶）对细胞的抑制作用随着浓度的增加而增强可能是由于祁门红茶中的细胞毒性成分含量较高。KTDH（75%1008060得率(%)402001:201:401:601:80料液比(g/mL)1:1001008060得率(%)4020020406080提取时间(min)1001008060得率(%)402001234提取次数5图2料液比、提取时间和提取次数对霍山石斛多糖得率的影响（n=3）Fig.2Effectsofsolid-liquidratio,extractiontimeandextractiontimesonpolysaccharideyieldofDendrobiumhuoshanensis(n=3)表3祁门红茶正交试验结果Table3ResultsoforthogonaltestofKeemunblacktea实验号A料液比B提取时间C提取次数多酚得率（%）11118.8921229.1131339.9642119.0852239.4262329.15731311.1883219.38933210.11K127.9629.1527.35K227.6527.9128.37K330.6729.2230.56R3.021.313.21最佳条件A3B1C3第44卷第20期黄科，等：霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其免疫调节作用217霍山石斛加 25%祁门红茶）对细胞的抑制趋势与KTDH（100%霍山石斛）相似，皆呈现抑制效果，但KTDH（75%霍山石斛加 25%祁门红茶）抑制作用更强，原因可能是由于加入了祁门红茶配比的提取液整体中具有细胞毒性的物质增多。KTDH（50%霍山石斛加 50%祁门红茶）和 KTDH（25%霍山石斛加 75%祁门红茶）在一定浓度范围内显著增强细胞活力（P0.05），且增强幅度相似的原因有可能是因为霍山石斛的多糖成分和祁门红茶的多酚成分发挥的免疫调节作用6,10。200150细胞活力(%)100500DH*KT1DH:1KT 3DH:1KT 1DH:3KT0 g/mL2.5 g/mL5.0 g/mL10 g/mL20 g/mL40 g/mL50 g/mL100 g/mL图3不同浓度和比例的混合溶液对细胞增殖活性的影响（n=6）Fig.3Effectsofdifferentconcentrationsandratiosofmixedsolutiononcellproliferationactivity(n=6)注：DH：100%霍山石斛、KT：100%祁门红茶、1KT:1DH：50%祁门红茶+50%霍山石斛、1KT:3DH：25%祁门红茶+75%霍山石斛、3KT:1DH：75%祁门红茶+25%霍山石斛；*表示与空白组相比 P0.05，*表示与空白组相比 P0.01；图 4 同。以不同浓度的 KTDH（2.5、5、10、20、40、50和 100g/mL）和 LPS（10g/mL）孵育细胞 24h，用中性红染色法检测细胞的吞噬活性。从图 4 中可以看出，除 KTDH（100%霍山石斛）和 KTDH（25%霍山石斛加 75%祁门红茶）外，其他处理对细胞吞噬活性的增强效果都不如 LPS，KTDH（25%霍山石斛加75%祁门红茶）的免疫增强效果强于 KTDH（100%霍山石斛）。综合考虑，选择 KTDH（25%霍山石斛加 75%祁门红茶）作为后续动物实验的给药配方。200150吞噬活力(%)100500DH*KT1DH:1KT 3DH:1KT 1DH:3KTLPS2.5 g/mL5.0 g/mL10 g/mL20 g/mL40 g/mL50 g/mL100 g/mL图4不同浓度和比例的混合溶液对细胞吞噬活性的影响（n=6）Fig.4Effectsofdifferentconcentrationsandratiosofmixedsolutiononcellphagocyticactivity(n=6)2.5茶与石斛提取液混合液对环磷酰胺造成的免疫抑制的预防作用通过建立环磷酰胺诱导的动物模型，探讨 KTDH对血液生化指标的影响；采用相关试剂盒检测血清IL-2、IL-6 和 TNF-水平。不同组小鼠 IL-2 和 IL-6的含量如图 5a 和图 5b 所示，与 NC 组相比，MC 组IL-2 和 IL-6 水平显著降低（P0.05）。同时，图 5a 显示各浓度 KTDH 对 IL-2 水平的恢复均有积极作用（P0.01），图 5b 显示 KTDH（400）对 IL-6 水平的恢复有积极作用（P0.01）。从图 5c 可以看出，与NC 组相比，MC 组的 TNF-水平明显升高（P0.01）。KDTH（400）对 TNF-水平的恢复起正向作用（P0.01），而 KDTH（100）对 TNF-水平的恢复起负向作用（P0.05）。80a60#*IL-2(pg/mL)40200NCMCKTDH(400)KTDH(200)KTDH(100)15b10#*IL-6(pg/mL)50NCMCKTDH(400)KTDH(200)KTDH(100)150c100#*TNF-(pg/mL)500NCMCKTDH(400)KTDH(200)KTDH(100)图5不同浓度 KTDH 对血清细胞因子水平的影响（n=10）Fig.5EffectofdifferentconcentrationsofKTDHonserumcytokinelevels(n=10)注：NC：正常对照组，MC：模型对照组，KTDH（400）：400mg/mLKTDH，KTDH（200）：200 mg/mL KTDH，KTDH（100）：100mg/mLKTDH；#表示与 NC 组比较 P0.05，#表示与NC 组比较 P0.01，*表示与 MC 组比较 P0.05，*表示与MC 组比较 P0.01。218食品工业科技2023 年10月如图 6 所示，NC 组和 KDTH（400）组细胞形态相似。脾髓、脾体形态结构规整有序。脾脏内淋巴细胞数量多，排列紧密。脾红髓形态正常，无异常充血。MC 组脾体结构疏松，淋巴细胞数量较少。而且，脾的红髓淤血也很严重。与 MC 组比较，KTDH组（100、200、400mg/kg）脾小体数量和面积增加，红髓充血程度也不同程度减轻。因此，环磷酰胺可能部分通过减少脾小体发挥免疫抑制作用，而 KTDH 可能通过保护脾小体，恢复淋巴细胞数量，增强免疫功能。实验结果表明，祁门红茶与霍山石斛的提取物混合液对于环磷酰胺导致的免疫力低下有明显预防作用。3结论与讨论环磷酰胺是临床上常用的用于肿瘤治疗和血液及骨髓移植的药物，具有良好的免疫抑制效果22。因此，通过注射环磷酰胺在小鼠中诱导免疫抑制是一种被广泛接受的免疫抑制模型。白细胞和单核巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，血清中 IL-2、IL-6 和 TNF-的水平变化是反映免疫活动的重要指标2324。细胞因子作为机体免疫应答系统中的重要因素，不仅可以单独起效，还可以与其他细胞因子相互诱生，相互影响而在免疫反应过程中发挥生物学效应25。因此 IL-2、IL-6 和 TNF-水平变化在一定程度上会影响到免疫反应的进程。有报道表明，霍山石斛多糖可通过激活 p38、ERK、JNK 和核 NF-B 易位，显著刺激 RAW264.7 巨噬细胞分泌 NO、TNF-、IL-6 和 IL-10，具有良好的免疫调节活性26。而关于茶多酚的研究表明其对白细胞介素的表达具有一定的抑制作用27。因此推测霍山石斛与祁门红茶之间的配伍可以发挥免疫调节作用，不仅可以预防免疫系统被抑制，还可以在免疫系统活动过强时抑制其炎症相关因子的分泌，机制可能是与 IL-2、IL-6 和 TNF-等炎症因子的表达通路相关。本研究通过 KTDH 连续灌胃 10d，随后腹腔注射环磷酰胺的方法，研究了 KTDH 对免疫抑制的预防作用。结果表明，模型组 IL-6、IL-2 水平显著性降低（P0.05），这与之前的研究一致。经 KTDH 治疗后，小鼠血清中细胞因子 IL-6、IL-2 水平较模型组有明显升高，证明 KTDH 可能是通过提高 IL-6、IL-2 血清水平改善免疫功能。有研究表明，环磷酰胺可引起炎症反应28。从血清 TNF-水平的变化来看，环磷酰胺明显引起炎症反应，从而使血清 TNF-水平显著升高（P0.01）。经 KTDH 处理后，高剂量组TNF-水平明显受到抑制（P0.01）。表明高剂量KTDH 可抑制环磷酰胺诱导的炎症反应。实验结果表明，祁门红茶与霍山石斛的提取物混合液对于环磷酰胺导致的免疫力低下有明显预防效果，可以作为日常生活中的免疫调节剂以及在临床上对病患的免疫预防起到一定作用。本研究为探究中草药与一些常规饮品的配伍奠定基础以及开发方向。同时，此研究对于霍山石斛资源和红茶的资源开发具有重要意义，对未来的本草产品和茶产品的开发应用也具有指示意义。最后，本研究为霍山石斛茶饮作为一种有效的免疫调节剂的应用奠定了基础，并为未来发现和开发具有医疗价值的本草产品提供了丰富的理论支持和数据支持。参考文献1ZHAXQ,ZHAOHW,BANSALV,etal.ImmunoregulatoryactivitiesofDendrobium huoshanensepolysaccharidesinmousein-testine,spleen and liverJ.International Journal Of BiologicalMacromolecules，2014，64：37782.2SIHY,CHENNF,CHENND,etal.Structuralcharacterisa-tionofawater-solublepolysaccharidefromtissue-culturedDendro-bium huoshanenseC.Z.TangetS.J.ChengJ.NaturalProductRe-search，2018，32（3）：25260.3SHANGZZ,QINDY,LIQM,etal.Dendrobium huosha-nensestempolysaccharideamelioratesrheumatoidarthritisinmiceviainhibitionofinflammatorysignalingpathwaysJ.CarbohydratePolymers，2021，258：117657.4WANJ,GONGX,WANGF,etal.Comparativeanalysisofchemicalconstituentsbyhplc-esi-ms(n)andantioxidantactivitiesofDendrobium huoshanenseanddendrobiumofficinaleJ.Biomedi-calChromatography，2022，36（1）：e5250.5LINJ,CHANGYJ,YANGWB,etal.Themultifacetedef-fectsofpolysaccharidesisolatedfromDendrobium huoshanenseonNC 10WPWPWPWPWPWPWPWPWPWPWPWPWPWPRPRPRPRPRPRPKTDH(100)10KTDH(200)10KTDH(400)10MC 10图6不同浓度 KTDH 对脾脏的影响Fig.6EffectsofdifferentconcentrationsofKTDHonthespleen注：NC：正常对照组，MC：模型对照组；KTDH（400）：400mg/mLKTDH；KTDH（200）：200mg/mLKTDH；KTDH（100）：100mg/mLKTDH；WP：白髓，RP：红髓。第44卷第20期黄科，等：霍山石斛茶饮的制备工艺优化及其免疫调节作用219immunefunctionswiththeinductionofinterleukin-1receptorantag-onist(IL-1ra)inmonocytesJ.PLoSOne，2014，9（4）：e94040.6LEECT,KUOHC,CHENYH,etal.CurrentadvancesinthebiologicalactivityofpolysaccharidesindendrobiumwitsourceJ.CurrentMedicinalChemistry，2017，24：119.7李囡囡,周远远.霍山石斛药理学研究及其在保健食品中的应用进展J.宜春学院学报，2022，44（6）：2527,107.LINN,ZHOUYY.Pharmacologicalresearchofdendrobium huoshanenseand its application in health foodJ.Journal of Yichun College，2022，44（6）：2527,107.8GAOY,XUY,RUANJ,etal.Seleniumaffectstheactivityofblack tea in preventing metabolic syndrome in high-fat diet-fedSprague-DawleyratsJ.JournalofTheScienceofFoodAndAgri-culture，2020，100（1）：22534.9DASAS,DASD,MUKHERJEEM,etal.Phytoestrogenicef-fectsofblackteaextract(Camellia sinensis)inanoophorectomizedrat(Rattus norvegicus)model of osteoporosisJ.Life 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