基于AMPK信号通路介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响.pdf

论著基于 信号通路介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响尹 侠李宏玉朱路文唐 强(.黑龙江中医药大学 黑龙江 哈尔滨.黑龙江中医药大学附属第二医院黑龙江 哈尔滨)摘要 目目的的 基于腺苷酸活化蛋白激酶()介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制 方方法法 按照随机数字法将 只雄性 大鼠分成对照组、模型组、电针 运动组、电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组每组 只 各预处理组先接受 周电针干预及运动干预然后采用 灌流系统对除对照组外的其他 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模(缺血 复灌 )其中电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组分别在造模前 腹腔注射生理盐水和 法检测心肌组织中 含量透射电镜观察心肌组织超微结构免疫组化染色观察心肌组织中转录因子()表达情况 法检测心肌组织中、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()、及、蛋白表达情况 结结果果 模型组大鼠心肌线粒体中 含量明显低于对照组(.)电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌线粒体中 含量均明显高于模型组和电针 运动 组(均.)透射电镜观察模型组大鼠心肌细胞胞质中度水肿线粒体肿胀呈圆形基质间隙变宽电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌细胞中见自噬小体与散在分布的溶酶体胞质轻度水肿线粒体轻度肿胀电针 运动 组大鼠线粒体轻度水肿嵴密度降低 模型组大鼠心肌组织中 阳性表达较对照组显著增加电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 阳性表达较模型组和电针 运动 组明显减少 电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 /比值与蛋白表达量均明显高于模型组和电针 运动 组(均 )/比值与 蛋白表达量均明显低于模型组和电针 运动 组(均 .)结结论论 电 针结合运动预处理可通过信号通路促进自噬流从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤关键词 心肌缺血再灌注电针运动预处理自噬流:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 尹侠女在读博士研究生研究方向为冠心病的中医康复通信作者 唐强 :.基金项目 黑龙江省博士后基金项目()黑龙江中医药大学研究生创新基金()(.)现代中西医结合杂志 ():().().()().()(.)./(.)/(.).:/冠心病和急性心肌梗死()是人类死亡的主要原因经皮冠状动脉介入治疗()、溶栓治疗是目前最有效的治疗措施但在恢复心肌血氧供应的同时可能会引起心肌缺血再灌注损伤 目前研究认为缺血再灌注损伤的发生机制包括活性氧产生增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞激活和损伤以及自噬等这些有害影响导致心肌细胞死亡、心肌梗死范围扩大、心律失常和血流动力学受损 既往研究证实缺血预适应在再灌注早期可激活自噬并促进受损的自噬流发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用而腺苷酸活化蛋白激酶()作为调节细胞内自噬/溶酶体途径的上游信号通路一直以来都是人们关注的热点 课题组前期研究证实运动预处理和电针预处理均可通过调节自噬发挥心肌保护作用 但联合应用对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制尚未阐明本研究基于 信号通路及通路下游的相关自噬蛋白的表达变化探讨了电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护机制 实验材料与方法 实验动物 只 级 雄性大鼠体重 购自辽宁长生生物技术有限公司动物许可证号:(辽)饲养于黑龙江中医药大学动物实验中心 保持室内湿度()温度控制在()自然昼夜节律标准饲料喂养自由饮食、饮水 实验仪器与试剂 超低温冰箱和 冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)离现代中西医结合杂志 ()体心脏灌流实验系统(江苏赛昂斯生物技术有限公司)凝胶成像系统(公司)石蜡切片机赛默飞世尔(上海)仪器有限公司荧光正置显微镜()(抑制剂 中国)山羊抗兔 、显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)内参()裂解液(碧云天生物技术有限公司)多聚甲醛(天津光科密欧有限公司)肝素钠注射液(天津生物化学制药有限公司规格:万/)抗体(武汉三鹰 )、(武汉三鹰 )、()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(武汉三鹰 )实验方法适应性饲养 周后随机将 只 大鼠分为对照组、模型组、电针 运动组、电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组每组 只 各预处理组先接受 周电针干预及运动干预然后采用 灌流系统对除对照组外的其他 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模其中电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组分别在造模前 腹腔注射生理盐水和 /(./)预处理方法 电针方案:参照实验针灸学取双侧心俞穴(第 胸椎棘突下双侧各旁开约 )、神门穴(前肢内侧腕部横纹尺骨边缘)用华佗牌.毫针直刺连接 电针仪(苏州医疗用品有限公司)电针参数:频率 电压 连续波 每日 次每次 /每周连续干预 取双侧心俞穴并在穴位下方 各刺一针作为参考电极、神门穴(在大鼠尾部针刺一处作为参考电极)负极连接心俞穴、神门穴正极接参考电极处 运动方案:进行电动跑台梯度运动训练跑台起始速度为 /第 天运动时间为 每 运动时间增加 直至运动时间 /每周连续干预 心肌缺血再灌注造模方法腹腔注射 戊巴比妥钠溶液 /麻醉大鼠同时给予肝素钠注射液 /腹腔注射抗凝 固定大鼠开胸后快速取出心脏将其放入 营养液中并充分挤压心脏内血液然后用动脉夹将心脏固定在装置上用 号线结扎采用 液(含 和 )于 下恒温恒压灌流 对照组大鼠心脏灌注 各造模组大鼠灌注 后在无氧和无灌流液的条件下于 下缺血 后复灌 检测指标及方法 线粒体 含量实验结束后用 对心脏进行冲洗滤纸吸干水分放在玻璃皿内置于冰上 用手术刀切取.心肌组织用镊子移至离心管中加入 进行清洗弃掉 溶液将盛有组织的离心管置于冰上用小研磨棒进行均匀研磨加入 冰浴 离心、弃上清加入 胰酶消化液置于冰上 离心、弃上清加入 线粒体分离试剂移液枪混匀离心、弃上清加入 线粒体分离试剂在冰上进行研磨离心后小心把上清转移至新的离心管中离心、弃上清余下的沉淀即为分离得到的心肌线粒体用 相应的线粒体储存液重悬线粒体置于冰上根据 试剂盒说明进行测定计算出 含量 心肌组织超微结构 切取约 大小心肌组织放入 的.戊二醛磷酸缓冲液中固定 然后进行漂洗、梯度丙酮脱水、浸透、包埋、切片(厚度 )、染色透射电镜下观察心肌细胞内自噬小体和自噬溶酶体等结构 心肌组织中转录因子()表达情况切片常规脱蜡至水进行抗原修复将柠檬酸抗原修复液()稀释至 将切片放入塑料染色缸倒入配好的抗原修复液(九分满盖子放在上面不要盖严)微波炉中火加热 冷却至室温 洗 次加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育 缓冲液冲洗 次滴加山羊血清 孵育 以封闭非特异性的背景染色甩掉山羊血清滴加一抗工作液(可以 稀释抗体或 配制的 稀释抗体)孵育 或 过夜 缓冲液冲洗 次滴加酶标兔抗山羊 聚合物(二抗)在室温下孵育 缓冲液冲洗 次加入适量新鲜配制的 显色液室温孵育 自来水充分冲洗苏木素染色液复染 分化、冲洗返蓝脱水、透明、封片镜下观察 心肌组织中 、蛋白表达情况采用 法检测:取各组液氮速冻后的相同位置心肌组织每.组织中加入 裂解液研磨后低温匀浆离现代中西医结合杂志 ()心取上清 法进行蛋白定量采用酶标记法进行检测 样本中的蛋白质含量由标准曲线计算 按照先前所算出的溶酶体溶液中蛋白质的含量进行制样根据蛋白分子量制备分离胶()、浓缩胶()上样在恒定电压 的条件下进行电泳电泳器调节到恒流 薄膜旋转 进行转膜使用 脱脂奶封闭液在室温条件下封闭 加入一抗摇床孵育过夜弃掉一抗稀释液用 缓冲液冲洗加入兔二抗稀释液(稀释于含 脱脂奶粉的 中)室温孵育 弃掉二抗稀释液在 中冲洗 反应显色、曝光成像用凝胶处理系统进行灰度值计算 统计学方法采用 .软件对研究数据进行处理所有数据行正态性检验后均符合正态分布多组间比较采用 单因素方差分析若方差齐两两差异比较采用 检验若方差不齐则采用塔姆黑尼 检验 以 .表示差异有统计学意义 结 果 各组大鼠心肌线粒体中 含量 模型组大鼠心肌线粒体中 含量明显低于对照组()电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌线粒体中 含量均明显高于模型组和电针 运动 组(均.)见图 图 对照组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌线粒体中 含量 各组大鼠心肌组织透射电镜下表现对照组大鼠心肌组织超微结构正常肌节排列整齐线粒体结构完整散在分布于肌纤维之间心肌间质未见明显异常改变模型组大鼠心肌细胞中肌丝模糊部分溶解变性胞质中度水肿线粒体肿胀呈圆形基质间隙变宽电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌细胞中见自噬小体与散在分布的溶酶体胞质轻度水肿线粒体轻度肿胀电针 运动 组大鼠心肌肌原纤维排列稍整齐少部分肌丝间隙发生水肿肌丝断裂线粒体轻度水肿嵴密度降低 见图 各 组大鼠心肌组织中阳性表达情况图 对照组和心肌缺血再灌注各组大鼠透射电镜下心肌组织超微结构()现代中西医结合杂志 ()被染成棕黄色与对照组比较模型组 阳性表达显著增多与模型组比较电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 阳性表达明显减少与电针 运动组、电针 运动 生理盐水组比较电针 运动 组 阳性表达明显增多 见图 图 对照组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌组织中转录因子 阳性表达情况(免疫组化染色)各组大鼠心肌组织中 、蛋白表达情况与模型组比较电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 /比值与 蛋白表达量均明显增高(均.)/比值与 蛋白表达量均明显降低(均 .)与电针 运动组、电针 运动 生理盐水组比较电针 运动 组 /比值与 蛋白表达量均明显降低(均.)/比值与 蛋白表达量均明显增高(均 .)见图及图 讨 论图 对照组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌组织中 、蛋白表达灰度图现代中西医结合杂志 ()图 对照组和心肌缺血再灌注各组大鼠心肌组织中依次为 /、/比值及、蛋白相对表达量 目前预处理已成为防治心肌缺血再灌注损伤的重要手段其中缺血预适应的心肌保护作用已得到证实 但由于缺血是一个不可预测的因素这限制了其在临床实践中的应用 因此探索一种安全、有效、低不良反应的治疗方法已成为该领域的研究热点既往研究表明电针预处理对冠心病、心律失常和心肌缺血再灌注损伤有保护作用 本课题组前期研究证实单独电针和运动预处理可通过调控自噬以及炎性通路来减轻心肌缺血再灌注损伤 但单纯从自噬体的数量以及标志性自噬蛋白的表达来评价自噬变化严格意义上是不准确的因为自噬本身是一个动态发生的过程自噬流是否通畅能够更加准确地评价自噬的发生发展故本实验基于 介导的自噬流探讨了电针和运动联合预处理对心肌缺血再灌注损伤的影响在调控自噬的过程中 作为细胞内调控能量稳态的重要激酶和细胞能量感受器其可以对低 水平作出应答并且被激活之后能够正向调控信号转导途径从而来补充细胞的 供给是经典的自噬途径蛋白 是 下游的一个底物活化的 能够通过抑制 来调控细胞内自噬水平当 信号通路受到抑制时细胞内的自噬水平随之下降 作为自噬和溶酶体生物合成的主要转录调节因子能够被 直接进行磷酸化修饰其被认为是自噬 溶酶体基因转录的主要激活剂 作为自噬标志性的蛋白定位于自噬体膜分为型和型 当自噬受激活启动时泛素化的 与自噬膜上的磷脂酰乙醇胺结合形成 的早期积聚预示自噬体的形成增加成为自噬体的标志物 但是单纯的自噬水平升高究竟是上游自噬通量的增加引起还是下游自噬体与溶酶体融合或溶酶体的降解受阻导致的需要进行验证明确 作为一种自噬特异性底物它能够与 相互作用在自噬溶酶体的促进下渗透入自噬细胞并对其发生过程进行进一步的监测 当 升高而 降低时表明自噬流通畅如果 和 均升高表明自噬起始正常但下游不通自噬体和溶酶体不能融合自噬流受阻本实验结果显示电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 /比值与 蛋白表达量均明显高于模型组 /比值与 蛋白表达量均明显低于模型组 阳性表达明显少于模型组提示电针结合运动预处理可激活 的磷酸化并抑制 的下调使现代中西医结合杂志 ()启动 可以促使自噬体的数量增加并促进了溶酶体的产生说明自噬体与溶酶体融合通畅这与透射电镜的观察结果是相一致的 为了进一步证实电针联合运动预处理可调控 所在通路本实验加入了 抑制剂来进行对照结果显示与电针 运动组、电针 运动 生理盐水组比较电针 运动 组 /比值与 蛋白表达量均明显降低/比值与 蛋白表达量均明显增高提示 可能通过 途径部分抵消掉电针结合运动预处理对 通路调控自噬的促进作用 因此本研究认为电针结合运动预处理可通过调控 信号通路促进自噬流发挥了对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护作用其更深入的关系有待继续进行研究利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .:.():.():.():.():.():.覃琴王琛乔世刚等.信号通路调控的自噬在七氟烷后处理保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的机制研究.生物医学工程研究():.钟永康.曲美他嗪促进 依赖的自噬流减轻心肌细胞缺氧复氧损伤.广州:南方医科大学.唐强张继瑶李宏玉等.基于细胞自噬探讨运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.康复学报():.尹侠李宏玉朱路文等.电针预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注心肌组织自噬的调控作用.现代中西医结合杂志():.李忠仁.实验针灸学.版.北京:中国中医药出版社:./:.():.:.():.陈婉莹仲泽昊白桦等.不同时间电针预处理抗 的效应差异及其与自噬的相关性.中国针灸():.谢亚宁.电针预处理对经皮冠状动脉支架术患者心肌保护作用的研究.西安:第四军医大学.陈晨田静冯秋菊等.电针预处理配合药物治疗冠心病心绞痛疗效观察.上海针灸杂志():.赵晓惠李静白海燕.电针预处理联合生活干预护理对老年冠心病患者心绞痛症状控制及负面情绪的影响.中国医刊():.唐强尹侠朱路文等.电针预处理内关穴对心肌缺血再灌注大鼠炎性损伤的影响.现代中西医结合杂志():.王鹏博王国干.自噬在心力衰竭中的利弊评价 从自噬体到自噬流.心血管病学进展():.张娅.利拉鲁肽通过 信号通路促进自噬流减轻 大鼠心肌损伤.广州:南方医科大学.:.():.():.收稿日期 现代中西医结合杂志 ()