蛋白组学定量蛋白质组学.ppt

蛋白质组学1第四章 定量蛋白质组学Quantitative proteomics定定量量蛋蛋白白质质组组学学，就就是是把把一一个个基基因因组组表表达达的的全全部部蛋蛋白白质质或或一一个个复复杂杂混混合合体体系系中中所所有有的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科。的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科。2n蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞蛋白质组学的研究目的是以大规模的尺度研究细胞蛋白质的功能。蛋白质的功能。n依靠依靠2-DE和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法和质谱技术，蛋白质组的研究策略和方法在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。在细胞蛋白质的鉴定上已经比较成熟。n但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功但是仅仅进行鉴定并不能提供用以阐明蛋白质的功能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞能的全部信息，监控蛋白质的表达水平对阐明细胞体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定体内存在的各种生物进程是非常重要的。因此，定量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被量蛋白质组学作为蛋白质组学研究的重要一部分被提出来。提出来。3常用研究方法常用研究方法n以质谱技术为基础的化学标记定量方法以质谱技术为基础的化学标记定量方法 n 荧荧光光差差示示双双向向凝凝胶胶电电泳泳技技术术（F2DDIGE）4化学标记定量化学标记定量n对对具具有有相相同同离离子子化化能能力力的的蛋蛋白白质质或或多多肽肽，通通过过比比较较质谱峰的强弱，可以得到其相对量的数值。质谱峰的强弱，可以得到其相对量的数值。n用用一一种种质质量量标标签签来来标标记记一一种种状状态态下下的的蛋蛋白白质质，与与另另一一种种状状态态下下没没有有标标记记的的蛋蛋白白质质混混合合起起来来，进进行行质质谱谱分分析析，然然后后比比较较某某个个蛋蛋白白质质没没有有标标记记的的峰峰和和标标记记后后峰峰的的强强弱弱，就就可可知知道道该该蛋蛋白白质质在在这这种种状状态态下下表表达达量量的变化。的变化。n常常用用的的是是在在样样品品中中加加入入包包含含稳稳定定的的重重质质同同位位素素(2H、13C、15N、18O、35S)试试剂剂,与与被被分分析析物物结结合合而而被被标标记，通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。记，通过质谱检测以确定其蛋白质的表达水平。5标记方法标记方法n体内标记体内标记n 15N体内体内代谢标记代谢标记 n稳定同位素标记的稳定同位素标记的必需氨基酸必需氨基酸体内标记体内标记(SILAC法法)n体外标记体外标记n-NH2氨基标记氨基标记 nCOOH羧基标记羧基标记 n-SH巯基标记巯基标记ICAT策略策略 6（一）体内代谢标记方法（一）体内代谢标记方法n培培养养方方法法：将将两两种种细细胞胞样样品品分分别别置置于于正正常常培培养养介介质质（14N）和和富富含含某某重重质质同同位位素素（15N）的的相相同同培培养养基基中中培养。培养。n蛋蛋白白质质提提取取：培培养养一一定定时时期期后后，将将两两者者混混合合，然然后后破破细细胞胞，提提取取相相关关部部位位感感兴兴趣趣的的蛋蛋白白质质，进进行行消消化化酶解。酶解。n 鉴鉴定定：通通过过选选择择性性亲亲和和分分离离、色色谱谱分分离离等等过过程程，最最后后进进行行质质谱谱分分析析。每每一一对对分分析析肽肽段段与与内内标标肽肽段段在在得得到到的的质质谱谱图图中中表表现现为为一一对对峰峰，峰峰的的间间距距等等于于肽肽段段中中所含的氮原子的个数。所含的氮原子的个数。7酿酒酵母酿酒酵母G1细胞周期蛋白细胞周期蛋白Cln2的影响：的影响：cln2:14NCLN2:15NA:翻译延伸因子翻译延伸因子1a cln2:CLN21：0.93B：磷酸丙糖异构酶（磷酸丙糖异构酶（Tpi1）代谢标记典型质谱图代谢标记典型质谱图8体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性体内代谢标记法具有较好的稳定性和重复性915N体体内内代代谢谢标标记记也也可可以以定量位点特异的化学修饰定量位点特异的化学修饰n磷酸化修饰定量：磷酸化修饰定量：nX：未被磷酸化的肽段：未被磷酸化的肽段nXp：被磷酸化的肽段：被磷酸化的肽段nX被被磷磷酸酸化化成成Xp后后分分子子量量会会增增大大，在在MS图图谱谱上峰会迁移上峰会迁移10特点特点n代代谢谢标标记记方方法法比比较较准准确确和和稳稳定定,可可以以检检测测蛋白质在蛋白质在pmol浓度内的浓度内的20的量的变化。的量的变化。n 不能直接用于组织样品的分析。不能直接用于组织样品的分析。n 同位素试剂需要量较大，成本高。同位素试剂需要量较大，成本高。n相相同同肽肽段段的的不不同同同同位位素素标标记记形形式式之之间间的的质质量量变变化化依依赖赖于于氮氮原原子子数数目目，因因此此对对未未知的蛋白质难以进行定量。知的蛋白质难以进行定量。11（二）（二）稳定同位素稳定同位素标记的标记的必需氨基酸体必需氨基酸体内内标记标记(SILAC法法)n高高等等动动物物细细胞胞的的生生长长中中需需要要一一些些必必需需氨氨基基酸酸的的摄摄入入，如如赖赖氨氨酸酸(Lys)、亮亮氨氨酸酸(Leu)、苯苯丙丙氨氨酸酸(Phe)等等，这这些些氨氨基基酸酸细细胞胞自自身身无法合成，需要从外界摄入补充。无法合成，需要从外界摄入补充。n在在培培养养细细胞胞时时，可可以以在在培培养养介介质质中中特特异异的的加加入入用用稳稳定定同同位位素素标标记记的的某某一一种种必必需需氨氨基基酸酸，在在经经过过适适当当的的培培养养时时间间后后，细细胞胞中中合合成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸。n收收获获不不同同同同位位素素标标记记的的不不同同生生长长状状态态下下的的细细胞胞，混混合合裂裂解解，再再做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。做质谱，就可以从质谱图上得到蛋白质差异表达量的信息。n这这种种蛋蛋白白质质定定量量策策略略称称为为SILAC(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture，细细胞胞培培养养物物中中含含有有稳稳定定同同位位素素的的氨基酸标记氨基酸标记)12SILAC法法:鼠鼠肌肌肉肉细细胞胞分分化化过程中蛋白表达量变化过程中蛋白表达量变化 Leu-d0 Leu-d3 (L-leucine-5,5,5-D3)Leu被标记：丰度最高氨基酸被标记：丰度最高氨基酸13Leu-d3可被细胞吸收可被细胞吸收肽段：肽段：VAPEEHPVLLTEAPLNPK，带，带3个电荷个电荷143-磷酸磷酸-甘油醛甘油醛-脱氢酶表达变化脱氢酶表达变化15n用用Lys来标记明显好于其他的必需氨基酸，来标记明显好于其他的必需氨基酸，n因为当用胰蛋白酶因为当用胰蛋白酶(Trypsin)酶切时，酶切时，n保保证证了了含含有有Lys残残基基的的每每个个肽肽段段都都只只含含有有一一个个标标记物记物n避避免免了了未未知知肽肽段段用用15N标标记记所所带带来来的的质质量量变变化化不不清的类似问题清的类似问题n有利于蛋白质做有利于蛋白质做MS/MS鉴定时质谱图的解析鉴定时质谱图的解析16体内标记和体外标记比较体内标记和体外标记比较n总总的的来来说说，体体内内标标记记相相对对于于体体外外标标记记方方法法来来说说具具有有一一些些自自身身的的优势优势 n省省去去了了标标记记化化学学反反应应和和分分离离纯纯化化等等步步骤骤，因因而而减减少少了了样样品品的损失的损失 n有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测 n体内标记也存在一些缺点体内标记也存在一些缺点 n培培养养细细胞胞在在富富含含稳稳定定同同位位素素的的介介质质中中生生长长，这这些些介介质质可可能能会会影影响响细细胞胞的的繁繁殖殖和和其其他他生生物物进进程程，由由此此改改变变蛋蛋白白质质的的表表达水平达水平 n这这种种方方法法受受到到同同位位素素材材料料成成本本的的限限制制，不不可可能能整整个个动动物物体体进行标记进行标记 n对对于于未未知知序序列列肽肽段段，大大多多数数的的体体内内标标记记都都无无法法确确定定标标记记物物与与肽肽段段之之间间量量的的关关系系，从从而而使使得得我我们们难难以以确确认认同同一一肽肽段段在在质谱图上成对出现的不同同位素标记形式质谱图上成对出现的不同同位素标记形式 17体外标记常用方法体外标记常用方法n-NH2氨基标记氨基标记nCOOH羧基标记羧基标记 n-SH巯基标记巯基标记ICAT策略策略18NH2标记（标记（d0/d3、d0/d4 法）法）n多肽的多肽的N末端和末端和Lys残基侧链上是残基侧链上是-NH2基团，容易跟含有基团，容易跟含有酰氧酰氧基基的小分子如琥珀酸酐、的小分子如琥珀酸酐、N-乙酰氧琥珀酰亚胺等发生乙酰氧琥珀酰亚胺等发生酰基化酰基化反应，从而对肽段进行标记。反应，从而对肽段进行标记。n采用一种正常的酰基化试剂与分别含采用一种正常的酰基化试剂与分别含3个（个（d0/d3）、）、4个氘原个氘原子（子（d0/d4）的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类的氘代酰基化试剂标记酶解后的多肽体系。该类试剂可与肽的试剂可与肽的N-端氨基端氨基发生稳定的酰基化反应，还可与肽中发生稳定的酰基化反应，还可与肽中赖氨酸的赖氨酸的-氨基氨基反应。反应。n当某肽段中不含赖氨酸时，分析物与内标物的质谱峰对分别相当某肽段中不含赖氨酸时，分析物与内标物的质谱峰对分别相差差3和和4个质量单位，被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基，该个质量单位，被分析肽段中每增加一个赖氨酸残基，该质谱峰对的差距就分别增加质谱峰对的差距就分别增加3和和4个质量单位。个质量单位。19d0/d3标记蛋白质标记蛋白质N末端原理末端原理nN-乙酰氧基琥珀酰亚胺乙酰氧基琥珀酰亚胺(N-Acetoxysuccinimide)n三氘代三氘代 N-乙酰氧基琥珀酰亚胺乙酰氧基琥珀酰亚胺(N-acetoxy-D3succinimide)20MALDI-TOF/MS 分析分析 N末端乙酰化肽段末端乙酰化肽段1195.6126 1198.641821MALDI-TOF/MS 分析分析 N末端和末端和Arg的的NH2乙酰化肽段乙酰化肽段1574.76101580.762422E.coli 半乳糖苷酶蛋白水平半乳糖苷酶蛋白水平半乳糖苷酶蛋白表半乳糖苷酶蛋白表达量可被诱导表达达量可被诱导表达提高到提高到2.5倍倍诱导表达：诱导表达：1H3标记标记未诱导表达：未诱导表达：2H3标记标记23d0/d4标记蛋白质标记蛋白质N末端原理末端原理nH4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基烟酰氧基)琥珀酰亚胺琥珀酰亚胺n四氘代四氘代 H4-Nic-NHS1-(H4-烟酰氧基烟酰氧基)琥珀酰亚胺琥珀酰亚胺24MALDI-TOF mass spectrum of a peptide labeled with succinic anhydride and deuterated succinic anhydride25d0/d4修饰修饰N末端末端NH2或或-NH2依赖反应条件依赖反应条件262728d0/d4标记用于分析蛋白质表达相对量标记用于分析蛋白质表达相对量29E.coli 在完全培养基和条件限制培养基在完全培养基和条件限制培养基中的蛋白表达比较中的蛋白表达比较30d0/d4标记标记37点，进行点，进行MS分析分析n37点点：两个蛋白两个蛋白n一个蛋白量上没有变化（一个蛋白量上没有变化（*）n一个蛋白在条件限制培养基中表达增加，一个蛋白在条件限制培养基中表达增加，1:331Lys上上-NH2特异标记方法：特异标记方法：MCATnO-甲甲基基异异脲脲(O-methylisourea)可可以以选选择择性性地地胍胍基基化化Lys残残基基上的上的-NH2。n不不标标记记N末末端端的的NH2和和其其它它残残基侧链。基侧链。n“质质 量量 标标 记记 的的 丰丰 度度 标标 签签”(Mass-Coded Abundance Tagging，MCAT)的标记策略。的标记策略。n每每标标记记上上一一个个胍胍基基，片片段段分分子量增加子量增加42Da。32MCAT策略流程：定性策略流程：定性nLys只在只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的离子都没有被修饰；所有的y离子带离子带Lys，因此被修饰。因此被修饰。n在在MS/MS图谱上，所有的图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现，离子是成对出现，丰度比例一样，且相差同样的丰度比例一样，且相差同样的m/z。n容易区分容易区分b离子和离子和y离子，容易读出氨基酸序列。离子，容易读出氨基酸序列。33MCAT策略流程：定量策略流程：定量n将来源不同样品的裂解物进行标记或不标将来源不同样品的裂解物进行标记或不标记，然后等量混合，经记，然后等量混合，经LC分离，在分离，在MS图图谱上就可分析不同蛋白量的变化谱上就可分析不同蛋白量的变化34酵母细胞提取物的离子层析和酵母细胞提取物的离子层析和LC/MS图谱：图谱：定性分析定性分析肽肽段段胍胍基基化化后后分分子子量量增增大大，在在层层析析图图上较晚出现。上较晚出现。35肽段的定量分析肽段的定量分析n肽段被胍基后，分子肽段被胍基后，分子量增加量增加42Da，但是，但是带带2个电荷，个电荷，m/z相差相差21个单位个单位n通过离子交换层析图通过离子交换层析图谱上峰的面积，可以谱上峰的面积，可以计算两种肽段的相对计算两种肽段的相对量量 0.88:136MCAT优点优点nO-甲基异脲甲基异脲(O-methylisourea)对对Lys残基残基-NH2的胍基化程度可以进行量上的控制的胍基化程度可以进行量上的控制n增加的质量（每个胍基增加的质量（每个胍基42 Da）可以很容）可以很容易在易在MS上检测到上检测到n-NH2的胍基化修饰并不影响肽的胍基化修饰并不影响肽段段的离子的离子化和带电荷程度化和带电荷程度37COOH羧基标记羧基标记n通过对羧基酯化进行通过对羧基酯化进行标记标记 n用用H和和D标记的甲醇酯标记的甲醇酯化标记，来定量研究化标记，来定量研究蛋白质表达量的差异蛋白质表达量的差异 38羧基酯化标记进行蛋白定量研究羧基酯化标记进行蛋白定量研究比例比例2:139n缺点：缺点：n特异性不是很好，在特异性不是很好，在C末端和末端和Asp和和Glu残基上都有标记，且效率不均残基上都有标记，且效率不均 n采用的标记条件容易引起天冬酰胺采用的标记条件容易引起天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺的去酰胺 40COOH羧基标记羧基标记n在在H218O的的溶溶液液中中进进行行蛋蛋白白酶酶切切，从从而而特特异异性性的只在的只在C末端引入稳定的同位素标记末端引入稳定的同位素标记这类蛋白水解酶只在肽段的这类蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入一个端引入一个18O41这类蛋白水解酶只在肽段的这类蛋白水解酶只在肽段的-COOH端引入二个端引入二个18O42标记后的肽段在质谱上的分离标记后的肽段在质谱上的分离4318O进行蛋白质组的标记和定量进行蛋白质组的标记和定量44-SH在标记反应中的作用在标记反应中的作用nCys残基上的残基上的-SH基团更具有标记反应的特异性基团更具有标记反应的特异性，如烷基化试，如烷基化试剂如碘乙酸等能专一的对剂如碘乙酸等能专一的对Cys的巯基进行烷基化的巯基进行烷基化。如果将稳。如果将稳定同位素引入这些烷基化试剂，那么就可以通过比较质谱图定同位素引入这些烷基化试剂，那么就可以通过比较质谱图谱上成对出现的质谱峰信号的强度进行相对定量了。谱上成对出现的质谱峰信号的强度进行相对定量了。nCys是一种特殊的氨基酸，在蛋白质酶切产生的多肽片段不一是一种特殊的氨基酸，在蛋白质酶切产生的多肽片段不一定含有定含有Cys残基。残基。E.coli和酵母细胞中含有和酵母细胞中含有Cys残基的蛋白质分残基的蛋白质分别占到蛋白质总量的别占到蛋白质总量的85.7%和和91.6%，而在，而在trypsin酶切产生的酶切产生的肽段中，含有肽段中，含有Cys残基的多肽分离仅占残基的多肽分离仅占9.4%和和9.3%。n如果能将这些烷基化标记的肽段给分离出来鉴定和定量，既如果能将这些烷基化标记的肽段给分离出来鉴定和定量，既能检测到足够多的蛋白质，又大大减少了工作量，更适宜大能检测到足够多的蛋白质，又大大减少了工作量，更适宜大规模操作。规模操作。45d0/d8法（法（ICAT方法）方法）同位素标记的亲和标签方法同位素标记的亲和标签方法(Isotope Code Affinity Tag)ICAT试剂是一种人工合成的有机分子，包括三个部分：试剂是一种人工合成的有机分子，包括三个部分：n反应基团反应基团，可特异的与蛋白质侧链上的，可特异的与蛋白质侧链上的Cys残基的巯基残基的巯基(-SH)进行进行反应，使试剂共价结合在蛋白质侧链上。反应，使试剂共价结合在蛋白质侧链上。n同位素标记的同位素标记的接头接头，含有稳定同位素，含有稳定同位素(H和和D)的标记。的标记。n亲和标记的亲和标记的生物素生物素，用于分离标记的蛋白质或多肽。，用于分离标记的蛋白质或多肽。46reactive groupbiotin taglinker(heavy or light)SHNNHONHOOOHHHHNHIOHHHHLight Reagent(D0)Heavy Reagent(D8)Isotope Coded Affinity Tag Reagents(ICAT)reactive groupbiotin taglinker(heavy or light)SHNNHONHOOODDDDNHIODDDD47X=Hydrogen(light)or Deuterium(heavy)SHcys+Protein(reduced)ICAT Reagent(D0 or D8)ICAT labeled Protein1)Label Proteins with D0/D8 ICAT Reagent,Digest SHN NHONHOOOXXXXNHIOXXXXScysSHN NHONHOOOXXXXNHOXXXXTrypsin(or other enzyme)48ICAT labeled peptide+other peptides+Wash off other peptides then Elute from AvidinAvidinEluteWashICAT labeled peptide2)Purify ICAT Labeled PeptidesScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXXScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXXScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXX49ICAT labeled peptideQuantifyMWIntensityMSMS/MSIdentifySequence3)Analyze ICAT Labeled Peptides8 DaT S V QScysSHNNHONHOOOXXXXNHOXXXX50Mix&DenatureMiniPrep CellMolecular WeightSeparationInto SDSBufferFractionproteolyzeAffinityPurificationFlow-throughICAT Reagent-Cys PeptidesFinger Printing:Protein IDQuantitation:Protein Expression1366.01465.81565.61665.41765.20501001566.01576.81587.6050100Finger Printing:Protein IDICAT-SDS Prep Gel Method51 ICAT方法操作步骤方法操作步骤 525354ICAT策略优点策略优点n应用应用ICAT策略对蛋白质进行鉴定和定量策略对蛋白质进行鉴定和定量n若一种蛋白质酶切产生至少有一个若一种蛋白质酶切产生至少有一个Cys残基的肽段残基的肽段的话，就可以对其鉴别和定量。含有的话，就可以对其鉴别和定量。含有Cys残基的肽残基的肽段越多，结果对照得出的结论越准确。段越多，结果对照得出的结论越准确。n鉴定的肽段中肯定都含有至少一个鉴定的肽段中肯定都含有至少一个Cys，因此在进，因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件。行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件。n肽段根据标记情况有选择性的得到了富集，从而减肽段根据标记情况有选择性的得到了富集，从而减少了下游质谱分析的复杂程度。例如少了下游质谱分析的复杂程度。例如Gygi等用等用ICAT处理酵母蛋白混合物时，从处理酵母蛋白混合物时，从344,855个肽段中富集了个肽段中富集了30,619个标记肽段，大大减少了后期的工作量。个标记肽段，大大减少了后期的工作量。n分离出来的标记多肽可直接与后面的分离出来的标记多肽可直接与后面的RP-LC-MS分分析系统在线偶联操作。析系统在线偶联操作。55ICAT方法的缺点方法的缺点n从相互比较的样品处理到最后的质谱定从相互比较的样品处理到最后的质谱定量分析经过的步骤较多；量分析经过的步骤较多；nICAT试剂修饰的得率等微小差异都可能试剂修饰的得率等微小差异都可能干扰两种差异表达蛋白质的精确定量；干扰两种差异表达蛋白质的精确定量；n只能分析含有只能分析含有Cys残基的多肽，对于那些残基的多肽，对于那些在功能上有重要作用的但不含在功能上有重要作用的但不含Cys残基的残基的蛋白质将会被遗漏。蛋白质将会被遗漏。56二、荧光差示双向凝胶电泳技术(F-2D-DIGE)Fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis57蛋白质染色要求蛋白质染色要求n对一个蛋白质混合物，首先用对一个蛋白质混合物，首先用2D进行分离，然后对蛋白进行分离，然后对蛋白质点进行染色，再通过比较单个蛋白质染色强度，对其进质点进行染色，再通过比较单个蛋白质染色强度，对其进行分析。行分析。n理想的染色方法满足：理想的染色方法满足：n良好的线性范围，染色强度和蛋白质浓度成正比良好的线性范围，染色强度和蛋白质浓度成正比n好的通用性，不同蛋白质具有相同的染色能力好的通用性，不同蛋白质具有相同的染色能力n高的灵敏度，检测出低拷贝蛋白质高的灵敏度，检测出低拷贝蛋白质n不影响后续鉴定过程不影响后续鉴定过程n考马斯亮蓝染色：灵敏度低考马斯亮蓝染色：灵敏度低n银染：影响后续鉴定，线性范围窄银染：影响后续鉴定，线性范围窄58F2DDIGE技术是在传统双向凝胶电泳基础上发展起技术是在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法。来的定量分析凝胶上蛋白质点的新方法。运用运用不同的荧光染料不同的荧光染料分别标记分别标记不同的蛋白质不同的蛋白质，然后将它，然后将它们等量混合，在们等量混合，在单一的单一的2D胶胶上进行分离和鉴定，按照它们所上进行分离和鉴定，按照它们所发出的荧光强度差异，来比较蛋白质量的变化。发出的荧光强度差异，来比较蛋白质量的变化。其优点是可以在其优点是可以在同一块凝胶上同一块凝胶上比较两种不同来源或不同比较两种不同来源或不同处理的蛋白质组表达谱，能比较处理的蛋白质组表达谱，能比较精确精确地在地在较宽的动态范围较宽的动态范围内对内对研究者感兴趣的蛋白质研究者感兴趣的蛋白质定量定量，因此成为一种有较好应用前景的，因此成为一种有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。定量蛋白质组学研究方法。59原理原理n将将待待比比较较的的两两种种样样品品提提取取的的总总蛋蛋白白质质分分别别与与两两种种不不同同的的荧荧光光标标记记试试剂剂（Cy3或或Cy2，Cy5）进行共价标记；进行共价标记；n然然后后将将不不同同荧荧光光染染料料标标记记的的两两种种待待比比较较的的蛋蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳；白质样品等量混合，上样进行双向电泳；n2D凝凝胶胶在在成成像像仪仪上上用用两两种种不不同同波波长长激激发发，并并将将两两种种样样品品的的荧荧光光图图谱谱显显示示成成像像，用用2D软软件件进行定量分析；进行定量分析；n将将定定量量显显示示有有明明显显差差异异的的蛋蛋白白质质点点切切下下后后进进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质。行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质。60Introduction of 2D-DIGECyDyeTM DIGE Fluorescence minimal dyesn3 dyesnLabel-amino group of lysine nCarry+1 chargen3%of lysines are labeled nMW matched(450Da)nThe same protein is labeled to the same extent with different dyes.nDetection Limit=125 pg proteinnDynamic range 104Cy2Cy3Cy561Flow chart of DIGE analysis of procured normal cells and cancer cells from the same tumor sample.62二维电泳荧光检测二维电泳荧光检测Red Cy3Green Cy563DIGE gel images of normal and cancer cells.A,Cy2 image of proteins from normal cells;B,Cy5 image of proteins from tumor cells64染料Cy2Cy3Cy5分子量Da550.60582.77580.75给蛋白质增加的质量Da434466464荧光颜色蓝绿红最大吸收波长（nm）491553645最大发射波长（nm）509569644三种荧光标记试剂（花青染料）的物理性质三种荧光标记试剂（花青染料）的物理性质65注意事项注意事项n蛋白质的被标记量控制在较低的标记率蛋白质的被标记量控制在较低的标记率以便每个蛋白质分子只含有一个标记荧以便每个蛋白质分子只含有一个标记荧光分子。光分子。n加入内标增加分析的可靠性。加入内标增加分析的可靠性。n胶点的蛋白质离开荧光成像扫描仪后不胶点的蛋白质离开荧光成像扫描仪后不可见，因此对胶点要进行定位。可见，因此对胶点要进行定位。66