积雪草酸联合亚胺培南对产KPC-2耐药肠杆菌的体外抗菌作用.pdf

94技 术 支 撑积雪草酸联合亚胺培南对产 KPC-2 耐药肠杆菌的体外抗菌作用张卫1，伍国强1，廖远军2，许竞文3，邹宜诺3，周永林3（1.浏阳市农业农村局动物疫病预防控制中心，湖南浏阳410300；2.零陵区畜牧水产事务中心，湖南永州425199；3.吉林大学动物医学学院，人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室，吉林长春130062）摘要：碳青霉烯类抗生素是目前临床上用于治疗肠杆菌严重感染的最后防线药物。然而随着肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPCs）等的出现和流行，碳青霉烯类药物治疗广泛耐药肠杆菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）感染面临巨大挑战。KPCs 家族中以 KPC-2 为主要流行类型，其可水解几乎所有-内酰胺类抗生素。因此针对 KPC-2 开展抑制剂筛选迫在眉睫。本研究通过酶活性抑制试验、抑菌试验、细菌细胞膜通透性测定和细胞毒性检测等开展了 KPC-2 抑制剂的筛选及其活性验证。结果显示：中药活性成分积雪草酸可显著抑制 KPC-2 水解-内酰胺类抗生素的生物学活性（P 0.05，IC50=4.38 g/mL），从而可有效增强亚胺培南等碳青霉烯类抗生素的体外抑菌作用和杀菌作用。同时，积雪草酸可增强亚胺培南对细菌细胞膜的损伤作用。此外，积雪草酸（32 g/mL）对不同来源细胞的细胞毒性较低，这有利于进一步开发其作为碳青霉烯类抗生素佐剂并投入临床使用。综上，本研究为 CRE 感染治疗提供了新的可行策略和先导化合物。关键词：积雪草酸；KPC-2；亚胺培南；协同抗菌中图分类号：S855.1文献标识码：A文章编号：1005-944X（2023）08-0094-09DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2023.08.018开放科学（资源服务）标识码（OSID）：In Vitro Antibacterial Effect of Asiatic Acid Combined with Imipenem on KPC-2-producing Drug-resistant EnterobacteriaceaeZhang Wei1，Wu Guoqiang1，Liao Yuanjun2，Xu Jingwen3，Zou Yinuo3，Zhou Yonglin3（1.Liuyang Center for Animal Disease Prevention and Control，Liuyang，Hunan410300，China；2.Lingling Animal Husbandry and Fisheries Affairs Center，Yongzhou，Hunan425199，China；3.National Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Diseases，College of Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun，Jilin130062，China）Abstract：Carbapenem antibiotics are the last line of defense drugs used for fighting against clinically severe Enterobacteriaceae infection.However，with the emergence and prevalence of Klebsiella pneumoniae carbapenemases（KPCs），it would be a huge challenge for carbapenem drugs to fight against carbapenem resistant Enterobacteriaceae（CRE）infection.KPC-2 is most popular in KPCs family，and could hydrolyze almost all-lactam antibiotics.Therefore，it is urgent to screen inhibitors against KPC-2.In this study，KPC-2 inhibitor was screened and verified for its activity by enzyme activity inhibition assay，bacterial inhibition test，bacterial cell membrane permeability measurement and cytotoxicity test.The results revealed that the active ingredient of traditional Chinese medicine，asiatic acid，could significantly inhibit the biological activity of KPC-2 hydrolyzing-lactam antibiotics收稿日期：2023-05-30修回日期：2020-07-15基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（32102723，32202856）；中国博士后科学基金面上项目（2023M731291）通信作者：周永林。E-mail：2023年第40卷第8期95技 术 支 撑肠杆菌科细菌是严重威胁人类健康和畜禽养殖业的人兽共患条件致病菌，是各地医院重点监控的革兰氏阴性菌1。常见的肠杆菌科细菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、沙门氏菌和产气肠杆菌等。肠杆菌科细菌感染后可引起不同细菌性疾病，严重时可导致菌血症甚至死亡。-内酰胺类抗生素一直以来都是临床和养殖业中治疗和预防细菌感染的最主要抗生素之一，包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类。其中碳青霉烯类是临床上治疗复杂耐药肠杆菌感染的最主要药物2。近年来，金属-内酰胺酶（如 New Delhi metallo-lactamases，NDMs）和碳青霉烯酶（如 Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPCs）的出现和广泛传播，导致临床上出现了耐碳青霉烯肠杆菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE）感染人和动物的情况。携带NDMs或KPCs的细菌耐药呈广谱性，NDMs 和 KPCs 通常可与多种不同类型耐药酶共存于同一细菌造成多药耐药3-5。因此，解决由碳青霉烯酶介导的肠杆菌耐药性问题迫在眉睫。碳青霉烯酶主要包括 Ambler 分子分类的 A类（如 KPCs）、B 类（如 NDMs）和 D 类（如OXAs）6。目前发现 KPCs 有超过 31 个突变体，其中 KPC-2 是世界范围内分布最广的丝氨酸碳青霉烯酶之一7。KPC-2 可导致肠杆菌对绝大多数-内酰胺类抗生素耐药，呈现广谱性，因此产KPC-2 细菌对目前所有可用的-内酰胺类抗生素及酶抑制剂复方抗生素都具有不同程度的耐药性。KPC-2 编码基因通常位于质粒上，可在不同肠杆菌科细菌之间快速水平转移和垂直传播，也可整合至携带其他耐药基因或毒力基因的质粒上，从而形成高致病性多重耐药菌8。携带 KPC-2 的肠杆菌主要包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。有研究9报道，从人类血液样本中分离出的多重耐药大肠杆菌，同时携带了 3 种碳青霉烯酶，包括 KPC-2、NDM-5和 CTX-M-3/65。2017 年我国首次从病猪肺脏样品中分离出同时携带 KPC-2 和 FosA3 的肺炎克雷伯菌分离株 ST1110。KPC-2 由两个亚结构域组成，包括两个疏水性网络结构（-网络和-网络）和-内酰胺酶11。KPC-2 的晶体结构以及 KPC-2 水解碳青霉烯类抗生素的活性中心等都已明确，这为筛选具有靶向性的 KPC-2 抑制剂及其作用机制分析奠定了基础12。近年来，抗生素耐药性问题已经成为全世界所面临的严重威胁。基于绿色养殖和“One Health”理念，我国大力支持开发中药作为治疗和预防畜禽疾病的药物13-14。中药活性成分具有结构新颖、种类繁多和药理学活性多样等优势，是新药研发的重要宝库。目前国内已经有多个研究团队和机构开展中药活性成分抗耐药细菌感染研究，如吉林大学研究团队报道了和厚朴酚作为 MCR-1 酶抑制剂，可增强多黏菌素对 MCR-1 阳性菌的体内外抗菌活性15。因此从天然化合物中筛选 KPC-2 的抑制剂，以恢复碳青霉烯类抗生素对肠杆菌的抗菌活性是当前最有效的策略之一。目前临床上使用的碳青霉烯类抗生素主要有亚胺培南（imipenem）、美罗培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南和多尼培南。本试验以最早开发和用于临床的碳青霉烯类抗生素亚胺培南作为目标抗生素进行深入研究。中药活性成分积雪草酸（asiatica acid）是中草药积雪草中含量较高的五环三萜类化合物，具有抗抑郁、抗肿瘤、治疗阿尔茨海默症和保护心血管的药理学作用16。积雪草酸（P 0.05，IC50=4.38 g/mL），and thus increase in vitro bacteriostasis and bactericidal action of imipenem and other carbapenem antibiotics.Meanwhile，asiatic acid could enhance the damage of imipenem to bacterial cell membrane.In addition，asiatic acid（32 g/mL）was with low cytotoxicity to cells from different sources，contributing to further development of its clinical use as an adjuvant for carbapenem antibiotics.In conclusion，a new feasible strategy and leading compound was provided for the treatment of CRE infection.Key word：asiatic acid；KPC-2；imipenem；synergistic antibacterial activity96技 术 支 撑作为耐药酶抑制剂的研究报道较少，因此本团队开展了积雪草酸抑制 KPC-2 活性作用研究，以期为解决耐碳青霉烯肠杆菌感染提供新的策略和有效抑制剂。1材料与方法1.1菌株、细胞与药品KPC-2 工程菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a-KPC-2），由本实验室构建并验证；本研究涉及的KPC-2 阳性肺炎克雷伯菌临床分离株（包括K.peneumoniae C1 和 K.peneumoniae C30），由吉林大学动物医学学院动物药学实验室提供。使用菌株时，取甘油菌在琼脂培养基上划线培养后挑取单菌落。所有甘油菌均保存于-80。人肺癌上皮细胞 A549、小鼠单核巨噬细胞J774 和宫颈癌细胞 HeLa，保存于吉林大学动物药学实验室；小鼠腹腔巨噬细胞（mouse peritoneal macrophages），通过 3%巯基乙酸盐肉汤诱导法提取自 C57 小鼠腹腔。积雪草酸、硫酸多黏菌素 E和头孢硝噻吩（CAS#41906-86-9），购自上海源叶生物技术有限公司；亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、四环素和环丙沙星等抗生素，购自中国兽医药品监察所。积雪草酸溶解于 DMSO 中配置成母液备用；各种抗生素根据其特性溶解于蒸馏水和甲醇中制备母液，现用现配。1.2头孢硝噻吩水解试验构建 KPC-2 原核表达工程菌株 pET28a-KPC-2并纯化 KPC-2 蛋白，随后进行活性检测17。将纯化的 KPC-2 按照 1:300 稀释后加至 96 孔板中，加入不同质量浓度的积雪草酸（0、2、4、8、16、32 g/mL）37 共孵育 30 min；各孔中加入底物头孢硝噻吩反应 1015 min，通过测定不同样品OD486 nm值，确定积雪草酸抑制 KPC-2 活性的情况，随后计算积雪草酸对 KPC-2 的半数抑制浓度（IC50）。此外，将不同质量浓度的积雪草酸与pET28a-KPC-2 菌株共培养 6 h，或将不同质量浓度的积雪草酸与 pET28a-KPC-2 菌株培养物上清共孵育后，进行头孢硝噻吩水解试验。抑制率计算公式：抑制率=（1-测试组 OD/对照组 OD）100%。使用 Graphpad Prism 5 软件计算 IC50。1.3最小抑菌浓度（MIC）检测及分级抑菌浓度（FIC）指数测定将过夜培养的菌液（包括 KPC-2 工程菌、肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30 和K.pneumoniae C1）转接至无菌 LB 培养基中继续扩大培养至对数生长期，然后将菌液分别调至吸光值 OD600 nm=0.1，备用；在 96 孔板中用米勒-海顿肉汤（MHB）培养基将积雪草酸和亚胺培南连续进行 2 倍倍比稀释，使积雪草酸和亚胺培南的终质量浓度分别为 0、2127 g/mL 和 0、2-327 g/mL；将受试菌按稀释比例 1:200 加入各孔，使其终浓度为 5105 CFUs/mL，然后置于 37 恒温培养箱中培养 1624 h。通过肉眼观察各孔培养基的浑浊程度进行结果判定，以肉眼观察未浑浊孔的最低浓度为 MIC 值。本研究同时检测了不同抗生素与积雪草酸的协同作用，具体操作方法同上。联合抑菌效果通过 FIC 指数判定：FIC 0.5定义为协同作用，0.5FIC1.0定义为相加作用，1.0 FIC 2.0 定义为无关作用，FIC 2.0 定义为拮抗作用。1.4生长曲线挑取琼脂培养基上的单个菌落（包括 KPC-2工程菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30）于 LB 液体培养基中过夜培养，然后将菌液分别调至吸光值 OD600 nm=0.3；将菌液分装至 5 个无菌锥形瓶中，加入不同质量浓度的积雪草酸（0、2、4、8、16 和 32 g/mL）后在 37 恒温摇床中振荡培养；每隔 30 min 吸取各瓶中菌液 1 mL 检测OD600 nm值，对 KPC-2 工程菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30 分别连续检测 7 h 和 9 h，记录各时间点吸光值并绘制生长曲线。1.5时间-杀菌曲线挑取琼脂培养基上的单个菌落（包括 KPC-2工程菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30）于 LB 液体培养基中过夜培养，将菌液调2023年第40卷第8期97技 术 支 撑至吸光值 OD600 nm=0.1，备用；在 96 孔板中使用MHB 培养基配置不同质量浓度药物，分别设置对照组、亚胺培南组（工程菌 1 g/mL、临床分离株2 g/mL）、积雪草酸组（32 g/mL）以及积雪草酸联合亚胺培南组（工程菌 32 g/mL 1 g/mL、临床分离株 32 g/mL 2 g/mL），每组 1 列；每孔加入 1 L 备用菌液，使每孔细菌为 5105 CFUs/mL；将 96 孔板置于 37 恒温培养箱中连续培养，分别于培养后 0、3、6、9、12 和 24 h 吸取各组孔中菌液进行 10 倍倍比稀释，再分别取20 L 涂布于琼脂培养基过夜培养；统计各组不同时间点的菌落数并绘制时间-杀菌曲线。1.6活死细菌染色挑取琼脂培养基上的单个菌落（KPC-2工程菌）于 LB 液体培养基中过夜培养，将菌液调至吸光值OD600 nm=0.1；分别加入积雪草酸（32 g/mL）、亚胺培南（1 g/mL）以及积雪草酸联合亚胺培南（32 g/mL 1 g/mL），阴性对照不做任何处理；置于 37 恒温摇床培养 6 h，离心收集细菌并调整为 OD600 nm=0.5；使用 LIVE/DEAD BacLight bacteria Viability 试剂盒对活/死细菌进行染色，避光反应 30 min，使用荧光显微镜观察不同处理后细菌的存活情况18。1.7扫描电镜观察挑取琼脂培养基上的单个菌落（KPC-2 工程菌）于 LB 液体培养基中过夜培养，将菌液调至吸光值 OD600 nm=0.1；分别设置积雪草酸组（32 g/mL）、亚胺培南组（1 g/mL）以及积雪草酸联合亚胺培南组（32 g/mL 1 g/mL），阴性对照组不做任何处理；37 静置培养 3 h，4 离心收集菌体，经戊二醛固定、PBS 缓冲液洗涤、1%锇酸再次固定、PBS 缓冲液再次洗涤后，用乙醇进行梯度脱水；最后将制备的样品在扫描电镜下观察细菌的形态结构。1.8细菌细胞膜通透性测定挑取琼脂培养基上的单个菌落（KPC-2 工程菌）于 LB 液体培养基中过夜培养，将菌液调至吸光值 OD600 nm=0.1；分别加入积雪草酸（32 g/mL）和不同浓度的亚胺培南（0、1、2、4 g/mL），阴性对照组不做任何处理；37 静置培养 3 h，离心收集菌体后加入 PBS 重悬菌液，然后加入碘化丙啶（PI，终浓度为 10 nmol/L）染料，避光孵育30 min；最后通过全波长酶标测定仪（激发波长535 nm、发射波长 615 nm）检测不同处理样品的荧光强度，分析积雪草酸和亚胺培南对细菌细胞膜通透性的改变19。1.9细胞毒性检测将人肺癌上皮细胞 A549、小鼠单核巨噬细胞J774、宫颈癌细胞 HeLa 和小鼠腹腔巨噬细胞分别铺于 96 孔细胞培养板中，于 5%CO2恒温培养箱中过夜培养；弃去细胞培养物上清，加入含不同质量浓度积雪草酸（0、1、2、4、8、16、32 g/mL）的 DMEM 培养基，继续培养 6 h；离心取上清，应用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测不同处理后细胞培养物上清中 LDH 含量，分析不同质量浓度积雪草酸处理后不同细胞的存活率。2.0统计学分析本研究所有试验均重复 3 次，所产生的试验数据使用非配对样本 T 检验进行分析。P 0.05，表示两组之间差异显著；P 0.01，表示两组之间差异极显著；P 0.05，表示两组之间无显著性差异。所有图表使用Graphpad Prism 5软件制作。2结果与分析2.1积雪草酸显著抑制 KPC-2 的水解酶活性本研究成功表达了具有生物学活性的 KPC-2。为确定筛选抑制剂的最佳反应质量浓度，首先进行 KPC-2 质量浓度与其活性之间的关系分析，质量浓度-酶活性检测曲线见图 1-A，确定 KPC-2的最佳反应质量浓度为 30 g/mL。头孢硝噻吩水解试验发现，中药活性成分积雪草酸可显著抑制KPC-2 活性（图 1-B、C，P 0.05）。积雪草酸对 KPC-2 的 IC50为 4.38 g/mL。本研究进一步检98技 术 支 撑测了积雪草酸与 pET28a-KPC-2 菌株共培养，或与培养物上清共孵育的抑制作用。结果（图 1-D）显示，积雪草酸（4.0 g/mL）无论在共孵育还是共培养条件下均可极显著抑制 KPC-2 的活性（P 0.01）。2.2积雪草酸显著提高亚胺培南对 KPC-2 阳性菌的抑制作用为验证积雪草酸与亚胺培南的协同抑菌作用，采用棋盘法 MIC 试验进行确证。通过与未携带 blaKPC-2基因的大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）（pET28a）相比较，发现积雪草酸可增强亚胺培南对 KPC-2 阳性大肠杆菌 pET28a-KPC-2 的抑菌作用（图 2-A）。这一协同作用进一步在 KPC-2 阳性肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30（图2-B）和K.pneumoniae C1（图2-C）上得到验证。此外，本研究发现积雪草酸与其他非-内酰胺类抗生素的协同效果不及碳青霉烯类（图 2-D），积雪草酸仅与庆大霉素的 FIC 指数小于 0.5，即具有协同作用，而与其他 4 种非-内酰胺类抗生素的FIC 指数均大于 0.5，即没有协同作用。2.3积雪草酸显著提高亚胺培南对 KPC-2 阳性菌的杀菌作用本研究首先通过生长曲线试验确定了积雪草酸（32 g/mL）对大肠杆菌 pET28a-KPC-2 和肺炎克雷伯菌临床分离株 K.pneumoniae C30 的生长无显著影响（图 3-A、B）。与空白对照组相比，积雪草酸或亚胺培南均不能在检测时间内杀灭培养基中的细菌，但当积雪草酸联合亚胺培南处理 6 h 后可将培养基中的大肠杆菌 pET28a-KPC-2 或肺炎克雷伯菌临床分离株K.pneumoniae C30完全杀灭（图3-C、D）。进一步通过活死细菌染色和扫描电镜观察对上述协同杀菌作用进行验证。结果（图 4）显示：与空白对照、单独添加积雪草酸（32 g/mL）或亚胺培南（1 g/mL）相比，添加积雪草酸联合亚胺培南（32 g/mL 1 g/mL）后着色红色的细菌数量增多（图 4-A），即死亡的细菌数量增多；积雪草酸联合亚胺培南可导致细菌发生形态变化，出现皱缩、聚集、破损甚至死亡（图 4-B）。A.质量浓度-酶活性曲线，反应时间为 15 min；B.积雪草酸抑制 KPC-2 活性眼观颜色变化；C.不同质量浓度积雪草酸抑制 KPC-2 活性结果（积雪草酸化学结构式见右上角）；D.积雪草酸与 pET28a-KPC-2 菌株共培养或与菌液培养物上清共孵育抑制 KPC-2 活性检测结果；*.P 0.05；*.P 0.01。图 1积雪草酸抑制 KPC-2 活性作用检测结果2023年第40卷第8期99技 术 支 撑A.积雪草酸联合亚胺培南对菌株 pET28a-KPC-2 和 pET28a 协同抑菌作用折线图；B、C.K.pneumoniae C30、K.pneumoniae C1 棋盘法 MIC 试验结果示意图；D.不同抗生素与积雪草酸的协同作用。图 2积雪草酸协同碳青霉烯类抗生素的抑菌作用检测结果A、B.分别为 pET28a-KPC-2、K.pneumoniae C30 的生长曲线；C、D.分别为 pET28a-KPC-2、K.pneumoniae C30 的杀菌曲线。图 3生长曲线和时间-杀菌曲线检测结果100技 术 支 撑2.4积雪草酸增强亚胺培南对细菌细胞膜的损伤作用细菌细胞膜的通透性可以反映细菌的受损程度。如图 5 所示，随着亚胺培南质量浓度的增加（2 g/mL），大肠杆菌 pET28a-KPC-2 细胞膜的通透性极显著增加（P 0.01）。与上述体系相比，加入 32 g/mL 积雪草酸后，细菌细胞膜的通透性在亚胺培南质量浓度 2 g/mL 后极显著增加（P 0.01）。结果提示，积雪草酸可增强亚胺培南对细菌细胞膜的损伤作用，从而导致细菌死亡。2.5积雪草酸对不同来源细胞的毒性检测本研究初步分析了积雪草酸是否对 4 种来源的细胞存在潜在的细胞毒性。结果（图 6）显示，积雪草酸质量浓度 32 g/mL 时对 A549 细胞、J774 细胞、HeLa 细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的毒性作用较小，LDH 释放百分比均未超过 20%。积雪草酸是否具有其他潜在的毒性作用需要进一步试验验证，包括急性毒性和亚慢性毒性等。3讨论革兰氏阴性菌（尤其肠杆菌）主要通过产生各种耐药酶从而对不同抗生素产生耐药性，因此针对耐药酶开展抑制剂筛选及其机制研究是当前解决肠杆菌耐药性问题的重要策略之一20。国内外许多科研团队针对新型碳青霉烯酶开展了抑制剂筛选和机制研究，如发现曲霉明 A（aspergillomarasmine A，AMA）可显著抑制碳青霉烯酶 NDM-1 的活性，从而恢复美罗培南等碳青霉烯类抗生素的体内外抗A.大肠杆菌 pET28a-KPC-2 活死细菌染色，活菌着色为绿色，死菌着色为红色；B.扫描电镜观察大肠杆菌 pET28a-KPC-2 的形态变化，放大倍数和标尺等信息见图底部。图 4阳性工程菌 pET28a-KPC-2 的活死细菌染色及扫描镜检结果*.表示 P 0.01。图 5积雪草酸协同亚胺培南对大肠杆菌 pET28a-KPC-2细胞膜通透性的影响结果2023年第40卷第8期101技 术 支 撑菌作用，其有望在未来被开发为碳青霉烯类抗生素的佐剂以应对肠杆菌的临床感染问题21。我国临床分离的 CRE 中碳青霉烯酶总体以 KPCs 为主，其中KPC-2是分布最广的丝氨酸碳青霉烯酶之一。但 KPC-2 抑制剂的报道相对较少，目前还没有可以投入临床使用的 KPC-2 抑制剂22。因此，本研究从中药活性成分中筛选有效的 KPC-2 抑制剂是一种可行的思路。积雪草具有清热解毒、利湿通淋和散瘀消肿的功效，用药历史悠久，存在于多种中药处方中23，其有效成分积雪草酸对革兰氏阳性菌具有不同程度的抑菌作用，而对革兰氏阴性菌抑菌作用差。因此将积雪草酸与亚胺培南联合使用，可有效防治临床上出现的复杂混合耐药菌感染24-25。革兰氏阴性菌携带的 KCPs 家族成员同源性较高，主要由 KPC-2 和 KPC-3 突变而成，如 KPC-14 是由KPC-2 缺失 2 个氨基酸获得。因此，推测积雪草酸可能抑制大部分 KCPs 的水解酶活性，但积雪草酸与碳青霉烯类抗生素在携带 KCPs 家族其他成员的菌株上是否具有协同作用有待进一步验证。综上，本研究为开发中药活性成分抗耐药革兰氏阴性菌感染研究奠定了前期研究基础并提供了先导化合物。参考文献：1 舒文，谢凤，汤荣，等.肠杆菌科细菌耐药性与抗生素使用量的相关性J.热带医学杂志，2020，20（11）：1420-1424.2 江心怡，张露蓉，宋如珺.-内酰胺类抗生素及其复合制剂使用的因素分析J.抗感染药学，2011，8（1）：48-51.3 JONAS O，TEAM W B G，MARQUEZ P V，et al.Drug-resistant infections：a threat to our economic future（Vol.2）：final reportN.World Bank Group，2017-05-30.4 GAO H，LIU Y，WANG R，et al.The transferability and evolution of NDM-1 and KPC-2 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