环境DNA技术在水域环境中的应用进展.pdf

研究与综述doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2023.11.003水产养殖2 0 2 3年第11期环境DNA技术在水域环境中的应用进展刘科均1,赖锡勋1,向劲,桂雨婷3,葛玲瑞1*（1.湖南生物机电职业技术学院，湖南长沙410 12 6;2.湖南省水产科学研究所，湖南长沙410 153；3.湖南应用技术学院，湖南常德4150 0 0）摘要：简述了环境DNA发展进程，介绍了环境DNA应用领域，包括物种及物种多样性研究、生物量评估、珍稀物种和入侵物种监测。归纳了环境DNA研究方法，样品的采集与保存、eDNA捕获、提取、分析。指出了eDNA技术的优势和存在的问题。提出，在今后的环境DNA研究中，一方面要大力发展并推广eDNA技术；另一方面应尽快制定一个统一的eDNA监测方法标准化框架，将eDNA技术和传统调查方法相结合，才能更好地对水生生物进行监测，在水生生态文明建设中发挥更为重要的作用。关键词：环境DNA；水生生态系统；渔业资源；物种监测中图分类号：S932文献标志码：A文章编号：10 0 4-2 0 91(2 0 2 3)11-0 0 16-0 6生物多样性是人类赖以生存的物质基础。近年来，由于石油钻井开采、水环境被破坏、生物资源过度开发及外来物种人侵等原因，许多水生生态系统的生物多样性正受到严重威胁，如内陆淡水生态系统湖泊、湿地等出现退化，海洋及沿岸地带的渔业资源急剧减少，非国家重点保护野生动物种群下降趋势明显，遗传资源也在不断丧失和流失，部分珍贵和特有的渔业种质资源流失问题严重叫。传统的水生生物资源调查方法，耗时长、成本高、操作方法烦琐，难以在流域开展大规模渔业资源调查。因此，迫切需要更加便捷、精准且有效的生物资源调查方法。环境 DNA(environmental DNA,eDNA)是指从环境（水体、土壤、沉积物、冰、空气等）中提取DNA片段，包括皮肤表皮细胞、粪便、体液等胞内DNA,以及动物机体出现损伤所释放到环境的胞外DNA2-4。环境DNA技术则是将提取到的DNA片段通过DNA测序技术，对目标生物进行定性和定量分析，从而获得目标生物在生态系统中的分布情况等 5。该技术能够快速检测出水域环境中的稀有种、濒危种及人侵种等，是一种新型的生物资源调查方法。现简述环境DNA技术的发展进程，及其在物种多样性监测、生物量评估、人侵物种和珍稀物种监测等方面的应用，以期为水生生态系统生物多样性研究工作提供一定参考。1环境DNA发展进程1987年0 gram等 成功从海洋沉积物中分离出微生物DNA，首次提出环境DNA的概念。2 0 世纪90年代末,科学家利用鲸鱼粪便来区分不同鲸鱼种类,为eDNA技术在水生生态系统中的应用提供了灵感。直到2 0 0 8 年，Ficetola等 7 利用eDNA技术，对美国牛蛙人侵进行监测，首次证明了eDNA技术适用于水生生态系统的可行性，推动了eDNA技术在水生生物监测中的推广与应用8。2 0 12 年,科学家们逐渐将研究重心转移到利用eDNA技术对水域中资助项目：长沙市自然科学基金（kq2202316;kq2202354);2021年度湖南生物机电职业技术学院院级科研项目（2 1YB05）作者简介：刘科均（1995一），男，硕士，研究方向为渔业资源与保护.E-mail：50 193992 3 q q.c o m*通信作者：葛玲瑞（198 4一），男，副教授，硕士，研究方向为水产动物遗传育种.E-mail:16水产养殖2 0 2 3年第11期研究与综述某一特定物种进行实时监测，意味着eDNA技术在水域环境中的应用由定性转变为相对定量,由单一物种监测发展到同时监测多种物种以及对特定物种的监测9。应用范围从最初的池塘、湖泊、河流、水库第一代测序技术希格测序1990年，首次报道DNA宏条形码研究等淡水水域拓展至海水水域。调查物种从低等过渡到高等，包括细菌和古菌、真菌、浮游生物、植物、软体动物、节肢动物、鱼类、两栖爬行类、哺乳类等几乎所有生物类群 10。环境DNA研究发展概略见图1。2008年，首次证明环境DNA2016年，环境DNA技术成应用于水生生物监测的可行性第二代测序技术高通量测序为生态环境领域研究热点1987年，首次提出环境DNA概念2000一2 0 0 5年,基于环境DNA的微生物研究大量增加图1环境DNA研究发展概略2环境DNA应用领域2.1物种及物种多样性目前，国内关于eDNA技术的运用主要包含常见物种监测,珍稀及濒危物种监测和人侵物种监测。通过利用eDNA技术,对我国淡水水域中的常见鱼种开展检测，以掌握其资源现状，从而促进中国鱼类资源的保护与发展，对我国各地有效实施渔业增殖放流的管理工作有着重要意义。不同于国外，我国的eDNA技术起步较晚。王晓辉等 12 从海洋底泥中的提取并纯化eDNA的研究，为之后eDNA技术在水生生态系统中进行物种监测的成功应用奠定了基础。卢珊 13研究萼花臂尾轮虫、鲤、泥鳅和日本沼虾与其eDNA的定性与定量关系，证实通过对水体中eDNA的定性、定量测定可以实现对水体中的水生生物种类及生物丰度的监测。刘军等 44分别对线粒D-loop区、16 SRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增，通过与千岛湖48 种鱼类基因组DNA进行比较后,发现线粒体16 S RNA基因具有更好的通用性和适用性,更适合作为鱼类结构分析eDNA研究的通用引物。徐念等115在长江宜昌至南京江段进行调查,将eDNA2010一2 0 15年,基于环境DNA的大型生物研究大量增加技术与传统调查方法所得结果对比发现，eDNA技术检测出的物种种类为15种，比传统调查方法少2种，但其中含有传统方法未检测到的鱼类。罗加山16 通过eDNA结合高通量条形码技术，对滇中高原湖泊鱼类多样性进行研究，整理了抚仙湖、阳宗湖、滇池、星云湖4个湖泊的鱼类分布图及其鱼类物种组成。王桂营 17 应用eDNA技术,对鸭绿江口底栖生物多样性及评价生态质量状况进行初步研究，并与形态学鉴定结果比较，显示两者所得评价指数间的相关性十分接近。上述研究表明,eDNA技术发展前景广阔，可作为形态学鉴定方法的一种重要补充工具。2.2生物量评估生物量评估是水生生物资源监控中的一项重要任务，通过对原始生态中的eDNA浓度进行测定和比对，可以实现对监测区域内目标生物量水平高低的监测。近年来,越来越多的科学家通过研究将eDNA浓度与生物量联系起来，认为eDNA浓度与生物密度之间存在某种线性关系,即通过检测该环境中的eDNA浓度，可以估算出物种的生物量118。文献 19-2 0 均在实验室中通过试验得出,eDNA浓研究与综述水产养殖2 0 2 3年第11期度随着水温的升高呈指数衰减，且eDNA的浓度与鲤生物量有着明显的正相关关系。Klymus 等 2 进行的试验同样发现，eDNA的浓度与生物量之间呈正相关，但不同的是,影响eDNA浓度变化的因素是摄食量而非水温。文献 2 2-2 3研究表明,影响eDNA浓度的因素还包括生物个体的生成速率、生物密度、环境条件（高pH值、强光、盐度）等。Evans 等 2 4对9种生物的线粒体基因片段序列进行测定研究，发现其序列拷贝数与生物丰度间，存在正相关关系，进一步说明eDNA具有用于生物量评估的潜力。国内对于eDNA技术进行生物量评估的研究也在增多。李苗等 2 5通过对eDNA 技术的不断研究，总结出一套适用于中国对虾生物量评估的eDNA技术操作流程，为我国对虾养殖的从业者提供了一种新的方法。闫卉果等 2 6 同样建立并优化了适用于岩原鲤生物量评估的eDNA技术，具有快速、灵敏、特异性强等特点，使其在实际应用中成为一个重要的附加工具。秦传新等 2 7 报道了国外有关eDNA应用于生物量评估方面的研究进展，指出，与传统方法相比，eDNA技术具有高效、经济、安全等优势，但也存在着无法直接观察生物群落和个体情况等缺陷，因此，只有将二者融合起来、取长补短，才能更好地为生物量评估工作提供技术支持。2.3珍稀物种和入侵物种监测许多珍稀或濒危鱼类作为其生态系统中不可或缺的一部分，近年来，受人为或自然等因素影响，其种群数量正处在灭绝的边缘。珍稀及濒危鱼类难以捕获且数量稀少，传统方法如水声监测法及刺网监测法等，在监测过程中易对生物造成一定伤害。eDNA技术具备采样简单、环境友好等特点,在物种数量较少的情况下，对其监测具有重要意义。吴昀晟等 2 8 利用eDNA技术,对长江江豚种群进行监测，证明了环境DNA技术用于监测长江中低密度濒危水生动物的可行性。物种人侵不仅对本地鱼类会产生一定的威胁，同时对生态系统也会产生巨大危害。在物种人侵前期，其生物量较少，尚未形成种群，及时发现并处理可以有效避免物种人侵所产生的危害。因此，通过eDNA技术对入侵物种进行监测，是做好生物人侵预防工作的重要保障。在国外,Jerde等 2 9用eDNA技术,对芝加哥运河中的2 种亚洲鲤进行早期入侵监测,并将其与传统渔业调查方法比较，结果显示，eDNA监测敏感度更高。在国内，马竹欣 30 利用eDNA技术调查元阳梯田中克氏原螯虾分布情况，通过与虾笼诱捕法对比，结果表明，其检出率显著高于传统方法，证明eDNA技术可以高效监测人侵物种的分布现状及扩散动态等。3环境DNA研究方法eDNA技术操作，大致分为3大部分，即样品的采集与保存、eDNA捕获与提取、eDNA分析等。近年来,国内外相继出现有关eDNA监测技术标准化的报道。针对不同生态系统中,在应用eDNA监测技术时，存在诸多差异，从而导致试验结果各不相同。因此,eDNA监测技术标准化系统性框架的建立，具有重大意义。3.1样品的采集与保存在我国，eDNA技术的应用范围十分广泛，无论是对特定物种监测还是对某区域进行生物量评估，选择合适的方法采集和保存样品，是保证试验数据准确的重要因素。张丽娟等 31通过对云南滇池和抚仙湖中2 个湖泊中的水样品进行测序，整理出适用于2 个湖泊中藻类监测的测序深度。为减少使用的误差，在取样时从每个点位各采集水样1L，并进行3次重复采样。王汝贤等 32 利用eDNA技术，对长江口水域鱼类生物多样性进行调查，同样是18个采样站点，均使用10 0 0 mL的采样瓶，重复采集3瓶表层水样品，该方法与传统底拖网调查方法获得的结果对比，eDNA检出率明显提高。为减少对水样的污染，工作人员在采样时，一定要佩戴口罩和手套，同时在采样前，需将采样瓶和采水器润洗，并使用10%漂白剂浸泡10 min，采样时，用纯净水做阴性对照。样品保存，主要指样品从采集到eDNA提取这段时间的保存。eDNA存在于许多样品中,如土壤、沉积物、固体混合物等样品，无须预处理，可以选择在-8 0、-2 0 温度下，干燥冷冻或干冰浴冷冻保18水产养殖2 0 2 3年第11期研究与综述存 33。水样保存,则可以选择冰浴保存,可有效降低eDNA的降解速率 34。3.2eDNA捕获过滤法、沉淀法和离心法，是目前主要使用的捕获eDNA的3种方法。其中以过滤法最为常用，且效果要比另外2 种方法好。过滤法是指对水样进行过滤，在水样通过滤膜后，将eNDA截留在滤膜上。沉淀法原理是利用一定比例的乙酸钠(CHCOONa)和无水乙醇(C,H,OH)与水样反应，使其中的eDNA聚集并沉淀，从而获得富集eDNA的沉积物。离心法则是利用离心机，对水样进行离心处理来富集eDNA35。3.3eDNA 提取水样中eDNA含量少，且成分复杂，如重金属离子、腐殖酸以及来自不同生物组织的DNA片段等，都会导致试验结果出现误差。近年来，越来越多的研究者,将传统方法与 DNA 提取试剂盒相结合，提出了多种方法，从样品中提取高质量的水样DNA。eDNA提取方法可分为3大类，分别为传统提取法（过滤法、沉淀法以及物理破碎法等）DNA试剂盒提取法，以及两者结合的方法。目前常用的水样 eDNA 提取试剂盒有:DNeasy Tissue and BloodDNA extraction kit QIAamp DNA Micro extractionkit、M o Bi o Po w e r Wa t e r D NA e x t r a c t i o n k i t 和 Quick-gDNA spin-columnkit等4种试剂盒 30。水样eDNA提取试剂盒又可分为普通DNA提取试剂盒与专有eDNA 提取试剂盒。DNeasy Tissue and Blood DNAextractionkit属于普通DNA提取试剂盒，MoBioPowerWater DNAextractionkit则属于专有DNA提取试剂盒。目前尚无文献报道将普通eDNA试剂盒与专有eDNA提取试剂盒进行对比试验，但专有eDNA提取试剂盒的价格相较普通eDNA试剂盒要更贵。选择eDNA提取方法时,要根据不同试验对象选择不同的方法,以获得高质量的水样DNA。D e i n e r等 37 通过比较3种不同的环境DNA提取方法发现，对于真核生物,应该提取细胞色素C氧化酶I基因(CO I基因),采用过滤与 Qiagens DNeasy Blood&Tissue Kit 相结合的方法,而对于水环境中的真菌，则应该采用沉淀与MoBioPowerWaterDNAextraction kit相结合的方法。eDNA提取完成后，一般于4或-2 0 冰箱保存。3.4 eDNA 分析根据eDNA监测对象及目的,可将扩增引物分为特异性引物和metabarcoding通用引物。特异性引物通常应用于对特定物种进行监测，包括珍稀物种监测、人侵物种检测及病原监测等，metabarcoding通用引物则更适用于进行生物多样性或生物量评估等 38。设计引物时,可参考NCBI等大型开放数据库中的序列或通过测序技术，来获得目标物种的DNA序列,通用引物扩增片段一般控制在90 12 0 bp为宜 39。目前主要使用的引物设计软件有:PrimerPremier,NCBI Primer-Blast,Primer3 Plus 等。不同的生物类群所使用的通用引物各不相同，如真菌通常使用18 SrRNA基因作为通用引物，细菌、古菌则采用16 S rRNA基因。在鱼类研究中,主要以12 S rRNA基因或COI基因作为通用引物。两者各有优势，12S rRNA基因具有更高的检出率,COI基因的数据库则更加全面。水样本的扩增方式有常规PCR扩增和实时荧光定量PCRqPCR）。常规PCR可利用通用引物扩增多种生物的目的片段;qPCR可利用特异性引物，定性扩增特定物种的目的片段，同时能定量分析该目的片段的含量(40。PCR扩增结果以阴性、阳性记录。采用凝胶电泳法对PCR扩增结果进行检测,从而推测采样点是否存在目标种的活动迹象，阴性表明环境样品中不存在目标种的DNA,阳性则表明环境样品中存在目标种的DNA41。通常研究者会选择采用10 40 L的PCR反应体系、设置3 10 个平行样本的方法，确保结果的准确性，通过设置阴阳性对照,排除假阳性与假阴性扩增以及交叉污染。4优势和存在问题4.1eDNA技术的优势eDNA技术发展至今已有约30 年，eDNA技术的研究领域，从微生物生态学拓展到了生态系统生态学、古生态学及生物多样性监测等；检测对象涵19研究与综述水产养殖2 0 2 3年第11期盖了微生物、植物、鱼类、哺乳类等生物。从物种多样性研究、生物量评估、人侵物种监测甚至到重建古生态系统、古植物史,eDNA的应用范围也在不断扩大。eDNA技术作为一种全新的生物调查方法,同传统调查方法相比，具备灵敏度高、特异性强、操作便捷、受外界影响因素小等显著特点。在使用该种方法进行调查时，能节省人力、物力、财力以及时间，采样时，对生态系统的干扰较小。4.2eDNA技术存在的问题eDNA技术虽在以上方面优于传统调查方法，但在目前的诸多研究试验中，仍存在一系列的问题与不足。在采集和保存样品、eDNA提取及分析等方面，各研究者所采取的方法不尽相同，导致最后与得出的结果之间,均存在一定差异,缺乏对比性。因此建立eDNA监测方法标准化框架，对eDNA技术的应用推广十分重要。eDNA技术存在PCR通用引物设计繁锁的潜在局限性，目前的研究水平，尚无十分完美的通用引物。以鱼类多样性检测中常用的12 SrRNA序列为例,在进行PCR扩增后，得到的片段几乎9 0%均注释到鱼类中,但其分辨率较低，种属区分度不明显，仍需要加以改进 42。在样品采集、保存及运输过程中，极易出现交叉污染，且样品本身可能含有高盐、腐殖酸、重金属离子等PCR抑制剂，导致试验结果出现假阴性的情况。PCR扩增及高通量测序时，操作步骤烦琐，使用试剂繁杂，也增加了样品被污染的概率。目前常用的基因库有 NCBI、BLO D 和 Mito chon-drial Genome Database of Fish等大型开放数据库，针对一些特定生物类群构建的 DNA 数据库,也在不断出现，但在这些国际数据库中，有关中国生物类群的数据，仍存在很大欠缺。赵梦迪 43在中国东黄海鱼类资源调查时发现，eDNA技术能够检测到大部分的传统方法捕捞的鱼类，却仍有部分鱼类无法被检测到。5展望环境DNA技术作为一种快速、精准的生物调查方法，与第二代测序技术(NGS)相结合，极大提高了人类对生态系统中物种信息监测的能力。该方法目前在物种多样性监测、生物量评估、珍稀水生生物资源调查等诸多研究中，展现出了显著优势和巨大潜能。但国内eDNA技术起步较晚，因此仍有许多问题需进一步研究和解决。在今后的环境DNA研究中，一方面要大力发展并推广eDNA技术，完善国内数据库；另一方面应尽快制定一个统一的eDNA 监测方法标准化框架。eDNA技术与传统调查方法各有自已的优势，在实际应用过程中，eDNA技术不能完全取代传统调查方法，要将2 种方法相结合，才能更好地对水生生物进行监测，在水生生态文明建设中发挥更为重要的作用。参考文献：1沈强.给水生物一个可持续发展的环境两院院士及有关专家呼吁尽快制定水产生物资源保护国家行动计划 J.科学新闻,2 0 0 2,4(16):12.2张辉,线薇薇.环境DNA技术在生态保护和监测中的应用 J.海洋科学,2 0 2 0,44(7):96-10 2.3 OLDS B P,JERDE C L,RENSHAW M A,et al.Estimatingspecies richness using environmental DNAJ.EvolutionaryEcology,2016,6(12):4214-4226.4 SCHWENTER M,ZAHIRI R,YAMAMOTO S,et al.eDNAas a tool for noninvasive monitoring of the fauna of a turbid,well-mixed system,the Elbe estuary in GermanyJ.PloSOne,2021,16(4):e250452.5李晗溪，黄雪娜，李世国，等.基于环境DNA宏条形码技术的水生生态系统入侵生物的早期监测与预警 J.生物多样性,2 0 19,2 7(5):491-50 4.6 OGRAM A,SAYLER G S,BARKAY T.The extraction andpurification of microbial DNA from sedimentsJ.Journal ofMicrobiological Methods,1987,7(2/3):57-66.7 FICETOLA G F,MIAUD C,POMPANON F,et al.Speciesdetection using environmental DNA from water samples.Biology Letters,2008,4(4):423-425.8张爱菊,郝雅宾，郭爱环,等.基于高通量测序技术的鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证 J.浙江农业学报,2 0 19,31(10):16 15-16 2 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species using environmen-tal DNAJJ.Conservation Letters,2011,4(2):150-157.30马竹欣.利用环境DNA技术调查入侵种克氏原螯虾在元阳梯田的分布 D.云南：云南大学,2 0 16.31张丽娟，徐杉，赵，等.环境DNA宏条形码监测湖泊真核浮游植物的精准性 J.环境科学,2 0 2 1,42(2):7 9 6-807.32王汝贤，杨刚,耿智，等.环境DNA技术在长江口鱼类多样性分析中的应用 J.水生生物学报,2 0 2 3,47(3):11.33杨海乐,张辉,杜浩.eDNA监测方法标准化框架及未来图景 J。湖泊科学,2 0 2 3,35(1):2 0.34 SALES N G,WANGENSTEEN O S,CARVALHO D C,etal.Influence of preservation methods,sample medium andsampling time on eDNA recovery in a neotropical riverJ.Environmental DNA,2019,1(2):119-130.35 邢迎春,高婉茹,白洁,等.环境DNA在湖泊生物多样性研究中的应用 J.水生生物学报,2 0 2 2,46(1)：137-148.36姜维,赵虎,邓捷,等.环境DNA分析技术一一种水生生物调查新方法 J.水生态学杂志，2 0 16,37(5):1-7.37 DEINER K,WALSER J C,MACHLER E,et al.Choice ofcapture and extraction methods affect detection of fresh-water biodiversity from environmental DNAJ.BiologicalConser-vation,2015,183:53-63.38 BENG K C,CORLETT R T.Applications of environmentalDNA(eDNA)in ecology and conservation:Opportunities,challenges and prospectsJ.Biodiversity and Conservation,2020,29(7):2089-2121.39 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Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009,ChinalAbstract:The effects of Microcystin-LR(MC-LR)exposure on pathological damage and biochemical reac-tion of Odontobutis potamophila were studied.Three experimental groups(D3,D5,and D7)and one control group(CK)were set up,and there were three repetitive groups in each group.On the Oth,3rd,5th,and 7th days of theexperiment,the intestinal and liver tissues of 3 Odontobutis potamophila were randomly selected for biochemicalanalysis and histopathological observation.The results showed that MC-LR could lead to the vacuolization of themuscular layer of intestinal mucosa and the abnormal structure of crypt,which affected the absorption of intesti-nal nutrients.Severe liver injury occurred at the same time,including hepatolysis and hyperemia.With the in-crease of exposure time,the activity of total superoxide dismutase in intestinal tract was inhibited,and the con-centration of catalase and malondialdehyde decreased at first and then increased.The concentration of glu-tathione peroxidase and reduced glutathione showed the opposite trend.These findings imply that the increasedgeneration of reactive oxygen species may contribute to the intestinal damage brought on by MC-LR.Key words:Odontobutis potamophila;Microcystin-LR;Tissue damage;Enzyme activity;Intestine(上接第2 1 页）Progress in the Application of Environmental DNATechnology in Aquatic Environment StudyLIU Kejun,LAI Xixun,XIANG Jing,GUI Yuting,GE Lingrui1*(1.Hunan Biological Electromechanical Vocational and Technical College,Changsha,Hunan 410126,China;2.Hunan Provincial Aquatic Science Research Institute,Changsha,Hunan 410153,China;3.Hunan Institute of Applied Technology,Changde,Hunan 415000,China)Abstract:The development process of environmental DNA was briefly reviewed,and the application fieldsof environmental DNA were summarized,including species and species diversity research,biomass assessment,rare species and invasive species monitoring.The methods of environmental DNA research,sample collection andpreservation,eDNA capture,extraction and analysis are highlighted.The advantages and existing challenges ofeDNA technology are emphasized.In future environmental DNA research,it is essential to vigorously develop andpromote eDNA technology while simultaneously establishing a standardized framework for eDNA monitoringmethods as soon as possible.Furthermore,integrating eDNA technology with traditional survey methods can en-hance the monitoring of aquatic organisms significantly and contribute greatly to the establishment of an aquaticecological civilization.Key words:eDNA;Aquatic ecosystems;Fishery resources;Species monitoring