《蛋白质分析》.ppt

第三章 蛋白质分析1整理ppt 蛋蛋白白质质是是指指主主要要由由-氨氨基基酸酸组组成成的的一一类类高高分分子子化化合合物物，其其数数目目数数以以千千计计。有有时时需需要要对对蛋蛋白白质质的的总总量量进进行行测测定定，但但有有时时又又需需要要确确定定蛋蛋白白质质混混合合物物中中的的一一种种，因因而而测测定定其其总总量量的的方方法法便便不不适适用用。所所以以，蛋蛋白白质质测测定定方方法法或或者者是是针针对对所所有有蛋蛋白白质质的的，或或者者是是针针对对其其中中个个别别蛋蛋白白质质的的。特特异异性性的的方方法法或或者者是是依依赖赖于于分分析析样样品品的的制制备备步步骤骤，或或者者是是依依赖赖于于待待测测蛋蛋白白质质的的某些特殊的性质。某些特殊的性质。2整理ppt 对对于于具具有有生生物物功功能能的的蛋蛋白白质质的的定定量量(如如激激素素)，由由于于蛋蛋白白质质变变性性的的存存在在、总总量量的的测测定定有有时时并并不不能能真真正正地地反反映映其其生生物物活活性性。对对这这类类蛋蛋白白质质的的定定量量可可选选择择化化学学定定量量法法或或生生物物分分析析法法。对对于于酶酶，通通常常是是测测定定其其活性，而不是测定其蛋白质的含量。活性，而不是测定其蛋白质的含量。在在蛋蛋白白质质分分析析化化学学中中，除除了了定定量量分分析析之之外外，还还有有许许多多分分析析问问题题涉涉及及蛋蛋白白质质的的构构型型或或不不同同层层次次的的结结构研究，蛋白质氨基酸序列的测定等。构研究，蛋白质氨基酸序列的测定等。3整理ppt 由由于于蛋蛋白白质质种种类类繁繁多多、结结构构复复杂杂、生生物物活活性性各各异异，一一种种蛋蛋白白质质并并非非单单一一基基因因所所表表达达的的产产物物，并并且且同同一一蛋蛋白白质质还还存存在在多多种种翻翻译译后后的的修修饰饰，蛋蛋白白质质分分析析正正处处于发展阶段。于发展阶段。蛋白质分析必须满足以下基本要求蛋白质分析必须满足以下基本要求:()高效提取并分离所有蛋白质组分，高效提取并分离所有蛋白质组分，()准确鉴别和定量分析每一组分，准确鉴别和定量分析每一组分，()能能比比较较分分析析表表达达图图谱谱的的复复杂杂变变化化，其其中中蛋蛋白白质质所有组分的完全分离是蛋白质组研究的前提。所有组分的完全分离是蛋白质组研究的前提。4整理ppt3.1.蛋白质的分类及结构 蛋蛋白白质质的的基基本本组组成成单单位位氨氨基基酸酸的的结结构构 虽虽然然在在各各种种生生物物体体中中发发现现的的氨氨基基酸酸有有180180多多种种但但组组成成蛋蛋白白质质的的常常见见氨氨基基酸酸只只有有2020种种，且且除除了了脯脯氨氨酸酸和和羟羟基基脯脯氨氨酸酸为为-亚亚氨氨基基构构型型外外，其其余余均均为为-氨氨基基构构型型。非蛋白质氨基酸中的氨基均不在氨基的非蛋白质氨基酸中的氨基均不在氨基的 位。位。除除了了甘甘氨氨酸酸之之外外，其其余余氨氨基基酸酸的的-C-C原原子子都都连连接接有有四四个个不不同同的的取取代代基基，因因而而-C-C是是具具有有手手性性的的，即即每每种种氨氨基基酸酸都都存存在在两两种种互互为为影影像像的的对对映映异异构构体体，分分别别用用D D或或L L来来标标识识。尽尽管管在在自自然然界界中中也也存存在在R R构构型型的的氨氨基基酸酸，但但组组成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸却却都都是是L-L-构型的。构型的。5整理ppt组成蛋白质的氨基酸的简写及等电点pI氨基酸简写等电点丙氨酸(alanine)Ala6.0精氨酸(arginine)Arg10.8天冬酰氨(Asparagine)Asn5.4天冬氨酸(aspartic acid)Asp2.9半胱氨酸(cysteine)Cys5.0谷酰氨(glutamine)Gln5.7谷氨酸(glutamic acid)Glu6.2甘氨酸(glycine)Gly6.0组氨酸(histidine)His7.0异亮氨酸(isoleucine)Ile6.06整理ppt氨基酸简写等电点亮氨酸(leucine)Leu6.0赖氨酸(lysine)Lys9.7甲硫氨酸(methionine)Met5.8苯丙氨酸(phenylalanine)Phe6.0脯氨酸(proline)Pro6.1丝氨酸(serine)Ser5.7苏氨酸(threonine)Thr6.5色氨酸(tryptophan)Trp5.9酪氨酸(tyrosine)Tyr5.7羟脯氨酸(hydroxproline)Hyp5.8缬氨酸(valine)Val6.07整理ppt3.2.多肽的结构 氨氨基基酸酸之之间间通通过过各各自自的的氨氨基基或或羧羧基基缩缩合合，以以酰酰胺胺键键(即即肽肽键键)形形成成的的氨氨基基酸酸聚聚合合物物片片段段称称之之为为多多肽肽(Polypeptide)。多多肽肽键键的的形形成成使使氨氨基基酸酸失失去去了了氨氨基基和和羧羧基基，分分子子的的保保留留部部分分(残残基基)是是蛋蛋白白质质结结构构中中的的主主要要组组分分。但但氨氨基基酸酸在在多多肽肽链链的的每每一一端端或或者者保保留留一一个个氨氨基基(N-末末端端残残基基)。或或者者保保留留一一个个羧羧基基(C-末末端端残残基基)。在在蛋蛋白白质质或或多多肽肽序序列列中中规规定定N-末端残基的编号为末端残基的编号为1。8整理ppt 由由6-30个个氨氨基基酸酸通通过过肽肽键键形形成成的的寡寡聚聚物物称称之之为为多多肽肽，但但氨氨基基酸酸残残基基数数达达到到40或或更更多多(分分子子量量5000以以上上)时时，这这种种肽肽便便具具有有蛋蛋白白质质的的性性质质。当当然然，在在分分子子量量方方面面，多多肽肽和和蛋蛋白白质质并并没没有有严严格格的的界界线线。一一般般认认为为，多多肽肽与与蛋蛋白白质质的的根根本本区区别别在在于于蛋蛋白白质质一一般般含含有有 螺螺旋旋结结构构以以稳稳定定蛋蛋白白质质的的总总构构型型；而而多多肽肽一一般般却却没没有有这这种种结结构构，其其构构型型有有很很大大的的可可变变性和可塑性。性和可塑性。9整理ppt3.3.蛋白质的分类 蛋蛋白白质质由由一一条条或或多多条条多多肽肽链链组组成成，它它在在空空间间具具有有特特定定的的走走向向与与排排布布。生生物物界界的的蛋蛋白白质质数数目目估估计计在在10101012数数量量级级。如如此此众众多多的的种种类类是是由由于于20种种氨氨基基酸酸在在肽肽链链中中的的不不同同序序列列决决定定的的这这种种序序列列异异构构现现象象是是蛋蛋白白质质生生物物功功能能的的多多样样性性及及种种属属特特异异性性的基础。的基础。按按蛋蛋白白质质化化学学组组成成的的不不同同，将将其其分分为为简简单单蛋蛋白白和结合蛋白两大类。和结合蛋白两大类。10整理ppt简单蛋白完全由肽链组成，它又可分为7类。(1)白白蛋蛋白白(Albumins)；又又称称清清蛋蛋白白，易易溶溶于于水水、稀稀酸酸和和稀碱溶液中，分布于血液、肌肉、蛋清及植物种子中。稀碱溶液中，分布于血液、肌肉、蛋清及植物种子中。(2)球球蛋蛋白白(Globulins)：又又分分为为优优球球蛋蛋白白和和拟拟球球蛋蛋白白，前前者不浴于水，后者溶于水。球蛋白存在于各种生物体中。者不浴于水，后者溶于水。球蛋白存在于各种生物体中。(3)组组蛋蛋白白(Histones)：溶溶于于水水及及稀稀酸酸。分分子子中中含含精精氨氨酸酸和和赖氨酸较多，如小牛胸腺蛋白等。赖氨酸较多，如小牛胸腺蛋白等。(4)精精蛋蛋白白(Protamines)：溶溶于于水水及及稀稀酸酸，多多存存在在于于精精子子之之中，如鱼精蛋白等。中，如鱼精蛋白等。(5)谷谷蛋蛋白白(Glutelins)：不不溶溶于于水水及及稀稀盐盐溶溶液液，存存在在于于植植物物种子中如米谷蛋白，麦谷蛋白等。种子中如米谷蛋白，麦谷蛋白等。(6)醇醇溶溶谷谷蛋蛋白白(Prolamincs)：不不溶溶于于水水及及乙乙醇醇溶溶于于70一一80的的乙乙醇醇溶溶液液中中，存存在在于于禾禾本本科科植植物物种种子子中中，如如小小麦麦醇溶蛋白，玉米酵溶蛋白等。醇溶蛋白，玉米酵溶蛋白等。(7)硬硬蛋蛋白白(Scleroproteins)：又又分分为为角角蛋蛋白白、胶胶原原蛋蛋白白及及丝心蛋白、均不溶于水、稀酸和稀碱中。丝心蛋白、均不溶于水、稀酸和稀碱中。11整理ppt 结合蛋白由简单蛋白质和非蛋白质成分组成。按照非蛋白质的不同又可分为下述7类。(1)糖糖蛋蛋白白(Glycoproteins)：与与糖糖类类共共价价结结合合的的蛋蛋白白质质，种种类类繁多，如血型糖蛋白，粘液糖蛋白和激素糖蛋白等。繁多，如血型糖蛋白，粘液糖蛋白和激素糖蛋白等。(2)核核蛋蛋白白(Nucleoproteins)：与与核核酸酸结结合合的的蛋蛋白白质质。如如DNA核蛋白、核糖体等，核蛋白、核糖体等，(3)脂脂蛋蛋白白(Lipoproteins)：与与脂脂类类以以次次级级键键结结合合的的蛋蛋白白质质。脂脂类成分包括磷脂、胆固醇、中性脂等。类成分包括磷脂、胆固醇、中性脂等。(4)磷磷蛋蛋白白(Phosphoproteins)：与与磷磷酸酸共共价价结结合合的的蛋蛋白白质质，主主要存在于蛋黄和乳中。要存在于蛋黄和乳中。(5)金金属属蛋蛋白白(Metalloproteins)：与与金金属属离离子子直直接接结结合合的的蛋蛋白白质质，如铁蛋白，含铜和锌的超氧化物歧化酶等。如铁蛋白，含铜和锌的超氧化物歧化酶等。(6)血血红红素素蛋蛋白白(Hemoproteins)：与与血血红红素素结结合合的的蛋蛋白白质质，如如血红蛋白，肌红蛋白。血红蛋白，肌红蛋白。(7)黄黄素素蛋蛋白白(Flavoproteins)：与与黄黄素素核核苷苷酸酸结结合合的的蛋蛋白白质质，如黄素氧化蛋白。如黄素氧化蛋白。12整理ppt 蛋白质的分子量范围变化较大，大约在蛋白质的分子量范围变化较大，大约在61031106之间。对于不含辅基的简单蛋白质分子，每个之间。对于不含辅基的简单蛋白质分子，每个分子中所含氨基酸残基的数目可通过用分子中所含氨基酸残基的数目可通过用110除以分子除以分子量进行粗略的估计。组成蛋白质的量进行粗略的估计。组成蛋白质的20种氨基酸的平种氨基酸的平均分子量为均分子量为138，但在大多数蛋白质中较小的氨基酸，但在大多数蛋白质中较小的氨基酸占优势。因此，其平均分子量接近占优势。因此，其平均分子量接近128。又因每形成。又因每形成一个肽键要失去一分子的水，一般蛋白质中氨基酸一个肽键要失去一分子的水，一般蛋白质中氨基酸残基的平均分子量约为残基的平均分子量约为110。13整理ppt 蛋蛋白白质质的的性性质质及及功功能能取取决决于于其其结结构构。深深入入了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构对对于于生生物物化化学学及及分分析析化化学学家家来来说说都都是是非非常常重重要要的的。蛋蛋白白质质的的结结构构具具有有不不同同的的层层次次，一一般般分分为为一一级级、二二级级、三三级级和和四四级级结结构构一一些些蛋蛋白白质质不不具具有有四四级级结结构构，如如肌肌红红蛋蛋白白、溶溶菌菌酶酶、细细胞胞色色素素c和和羧羧肽肽酶酶A等等，有有些些较较大大的的蛋蛋白白质质具具有有四四级结构，如血红蛋白和乳酸脱氢酶等。级结构，如血红蛋白和乳酸脱氢酶等。3.4.蛋白质的结构14整理ppt蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指肽链中氨基酸的序列以及二硫桥的位置。是指肽链中氨基酸的序列以及二硫桥的位置。人胰岛素的一级结构人胰岛素的一级结构15整理ppt蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 一条多肽链或链的一部分依靠氢键维持的局部有规则的一条多肽链或链的一部分依靠氢键维持的局部有规则的构型称之为二级结构。构型称之为二级结构。蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构定义为它的总体结构。蛋白质的三级结构定义为它的总体结构。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白质中不同种类和数目的蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白质中不同种类和数目的亚基在空间的排布及亚基之间的相互作用。亚基在空间的排布及亚基之间的相互作用。16整理ppt球蛋白的三级结构球蛋白的三级结构(a)(a)和胶原蛋白的三级结构和胶原蛋白的三级结构(b)(b)17整理ppt蛋白质的四级结构示意图蛋白质的四级结构示意图18整理ppt 蛋蛋白白质质的的变变性性可可以以描描述述为为：天天然然蛋蛋白白质质分分子子在在外外界界因因素素的的作作用用下下，由由紧紧密密有有序序的的结结构构变变成成松松散散无无序序的的结结构构，并并使使得得蛋蛋白白质质的的物物理理、化化学学性性质质及及生生物物活活性性发发生生变变化化的的现现象象。变变性性只只涉涉及及次次级级键键，二二硫硫键键的的断断裂裂一一般般不不涉涉及及一一级级结结构构的变化。的变化。蛋蛋白白质质变变性性之之后后，其其物物理理性性质质(如如溶溶解解度度，旋旋光光性性，吸吸收收光光谱谱)，化化学学性性质质(如如水水解解速速度度，化化学学反反应应能能力力)以以及及生生物物功功能能(如如酶酶的的催催化化活活性性，激激素素的的生生理理调调节节功功能能，抗抗原原抗抗体体反反应应的的专专一一性性等等等等)都都会会发发生生变变化化。因因此此，蛋蛋白白质质变变性性对对蛋蛋白白质分析来说是一个非常重要的、经常要考虑到的问题。质分析来说是一个非常重要的、经常要考虑到的问题。19整理ppt能使蛋白质变性的因素很多，其中比较重要的包括以能使蛋白质变性的因素很多，其中比较重要的包括以下几种：下几种：热热变变性性 由由于于加加热热而而引引起起的的蛋蛋白白质质变变性性称称之之为为热热变变性性。一般的蛋白质在一般的蛋白质在5060以上便会发生热变性。以上便会发生热变性。酸酸和和碱碱变变性性 蛋蛋白白质质一一般般在在pH 410范范围围内内稳稳定定，超超过这个范围就会发生变性。过这个范围就会发生变性。尿尿素素和和盐盐酸酸胍胍变变性性 这这两两种种试试剂剂是是常常用用的的蛋蛋白白质质变变性性剂。剂。表表面面活活性性剂剂变变性性 表表面面活活性性剂剂SDS很很容容易易与与蛋蛋白白质质结结合合，并并使使蛋蛋白白质质发发生生变变性性，与与脲脲和和胍胍不不同同的的是是，浓浓度度很很低低的的SDS就可以使蛋白质变性。就可以使蛋白质变性。20整理ppt3.5.蛋白质分析的意义 一、基础科学研究一、基础科学研究 这这主主要要是是生生命命科科学学研研究究向向分分析析学学家家提提出出的的课课题题。在在生生命命科科学学研研究究中中，人人们们需需要要了了解解各各种种蛋蛋白白质质的的组组成成、结结构构与与功功能能的的关关系系，蛋蛋白白质质的的存存在在形形态态及及与与小小分分子子，甚甚至至金金属属离离子子的的相相互互作作用用等等等等。而而对对分分析析化化学学家家来来说说，蛋蛋白白质质分分析析是是一一个个难难题题，因因为为蛋蛋白白质质分分子子量量大大(分分子子量量一一般般为为60001000000)，结结构构复复杂杂(有有四四级级结结构构)和和种种类类繁繁多多(约约有有10101012种种)等等特特点点。这这些些持持点点决决定定了了蛋蛋白白质质分分析析与与小小分分子子为为对对象象的的分分析析区区别别甚甚大大。因因此此，分分析析化化学学家家要要不不断断地地针针对对蛋蛋白白质质的的特特点点去去发发展展新新的的理理论论，创造新的实验手段和分析方法。创造新的实验手段和分析方法。21整理ppt 二、食品的鉴定与评价二、食品的鉴定与评价 蛋蛋白白质质是是生生物物体体的的重重要要营营养养物物质质，也也是是食食品品的的重重要要营营养养指指标标。人人及及动动物物只只能能从从食食品品中中得得到到蛋蛋白白质质及及其其分分解解产产物物来来合合成成自自身身的的蛋蛋白白质质。蛋蛋白白质质可可以以被被酶酶、酸酸或或碱碱水水解解，水水解解的的最最终终产产物物是是氨氨基基酸酸。氨氨基基酸酸可可以以进进入入蛋蛋白白质质的的代代谢谢库库重重新新被被利利用用。氨氨基基酸酸是是构构成成蛋蛋白白质质的的基基本本物物质质。在在构构成成蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸中中，亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、赖赖氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸、蛋蛋氨氨酸酸、苏苏氨氨酸酸、色色氨氨酸酸及及缬缬氨氨酸酸这这8种种称称为为必必需需氨氨基基酸酸，它它们们在在人人体体中中不不能能合合成成，必必须须依依靠靠食食物物供供给给，它它们们对对人人体体有有着着非非常常重重要要的的作作用用。各各种种食食品品中中的的蛋蛋白白质质含含量量差差异异甚甚大大。如如牛牛肉肉中中蛋蛋白白质质的的含含量量为为20%左左右右，猪猪肉肉为为9.5%，牛牛乳乳为为3.5%，大大豆豆为为48%，大大米米为为8.5%，菠菠菜菜为为2.4%，黄黄瓜瓜为为1.0%，桃桃为为0.8%，苹苹果果为为0.4%。因因此此，测测定定食食品品中中蛋蛋白白质质的的含含量量对对指指导导食食品品的的加加工工工工艺艺的的改改革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。22整理ppt 三、评价健康状况、诊断疾病三、评价健康状况、诊断疾病 人人体体内内的的酸酸碱碱平平衡衡，电电解解质质平平衡衡，遗遗传传信信息息的的传传递递，物物质质的的代代谢谢和和运运转转都都与与蛋蛋白白质质有有关关。蛋蛋白白质质不不仅仅是是血血浆浆的的主主要要成成分分，而而且且也也分分布布于于各各种种细细胞胞的的外外液液，关关节节滑滑液液，脑脊液等等。脑脊液等等。23整理ppt 血血浆浆蛋蛋白白质质的的成成分分复复杂杂，多多达达三三百百余余种种，许许多多种种蛋蛋白白质质的的含含量量随随疾疾病病的的不不同同有有所所增增减减，在在临临床床诊诊断断上上具具有有重重要要意义。意义。24整理ppt总总蛋蛋白白升升高高，可可考考虑虑各各种种失失水水导导致致血血液液浓浓缩缩的的疾疾病病，多多发发性性骨髓瘤，巨球蛋白血症等等。骨髓瘤，巨球蛋白血症等等。血血清清总总蛋蛋白白降降低低，可可能能是是体体内内水水分分过过多多，多多渠渠道道血血清清蛋蛋白白丢丢失，如肾病综合症，营养不良，蛋白质合成障碍等。失，如肾病综合症，营养不良，蛋白质合成障碍等。球球蛋蛋白白升升高高：多多见见于于多多发发性性骨骨髓髓瘤瘤及及某某些些淋淋巴巴瘤瘤、肝肝硬硬化化、血吸虫病、疟疾等等。血吸虫病、疟疾等等。球球蛋蛋白白降降低低：可可考考虑虑低低丙丙球球蛋蛋白白血血症症和和肾肾上上腺腺皮皮质质功功能能亢亢进进等。等。25整理ppt3.6.3.6.蛋白质定量分析方法蛋白质定量分析方法 在在生生物物研研究究、以以及及医医药药和和食食品品等等行行业业和和临临床床诊诊断断领领域域中中，蛋蛋白白质质的的定定量量分分析析是是常常检检项项目目和和重重要要指标。指标。26整理ppt 蛋蛋白白质质的的测测定定方方法法很很多多，常常用用的的方方法法可可以以分分为为三三大类：大类：一一是是基基于于蛋蛋白白质质与与一一些些物物质质的的化化学学反反应应所所建建立立的的化化学法；学法；二二是是根根据据蛋蛋白白质质的的生生化化性性质质所所建建立立的的生生物物检检定定法法和和免疫法；免疫法；三三是是依依据据蛋蛋白白质质与与不不同同试试剂剂的的反反应应和和仪仪器器测测试试技技术术所建立的仪器法。所建立的仪器法。化化学学法法操操作作较较为为简简单单，常常用用于于微微量量蛋蛋白白质质日日常常的的快快速速分分析析；后后两两者者通通常常配配合合高高灵灵敏敏度度的的精精密密仪仪器器，一般用于痕量或超痕量蛋白质的分析。一般用于痕量或超痕量蛋白质的分析。27整理ppt 蛋白质分析方法可分为两大类，蛋白质分析方法可分为两大类，一一类类是是利利用用蛋蛋白白质质的的共共性性，如如含含氮氮，含含肽肽键键和和折折射射率率等性质测量蛋白质的含量；等性质测量蛋白质的含量；二二是是利利用用蛋蛋白白质质中中某某些些特特定定的的氨氨基基酸酸残残基基、芳芳香香基基团团、酸酸性性和和碱碱性性基基团团等等测测量量蛋蛋白白质质的的含含量量。迄迄今今，测测定定蛋蛋白白质质的的分分析析方方法法有有多多种种多多样样，如如克克氏氏定定氮氮法法，金金属属络络合合物物，染染料料做做探探针针的的各各种种分分光光光光度度法法，荧荧光光染染料料做做探探针针的的荧荧光光分分析析法法，化化学学发发光光分分析析法法，气气相相色色谱谱分分析析法法，液相色谱法甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。液相色谱法甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。28整理ppt迄今，测定蛋白质的分析方法有多种多样迄今，测定蛋白质的分析方法有多种多样:克氏克氏(凯氏凯氏)定氮法，定氮法，金属络合物，染料做探针的各种分光光度法，金属络合物，染料做探针的各种分光光度法，荧光染料做探针的荧光分析法，荧光染料做探针的荧光分析法，化学发光分析法，化学发光分析法，气相色谱分析法，液相色谱法气相色谱分析法，液相色谱法甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。29整理ppt1 光谱法光谱法 根根据据蛋蛋白白质质自自身身的的光光谱谱性性质质，可可以以对对蛋蛋白白质质定定性性和和定定量量分分析析的的光光谱谱方方法法有有紫紫外外光光谱谱法法、荧荧光光光光谱谱法法、圆圆二二色色光光谱谱法法、激激光光拉拉曼曼光光谱谱法法、NMR及及X射射线线衍衍射射分分析析法法等等。其其中中大大多多数数方方法法主主要要用用在在蛋蛋白白质质结结构构研研究究方方面面，下下面面只只对对前前两两种种可可用用于于蛋蛋白白质质定定量量分分析析的光谱方法进行简单的介绍。的光谱方法进行简单的介绍。30整理ppt紫外光谱法紫外光谱法 由由于于蛋蛋白白质质中中存存在在芳芳香香族族氨氨基基酸酸，一一般般的的蛋蛋白白质质在在280 nm附附近近有有一一个个最最大大吸吸收收。根根据据此此吸吸收收可可以以对对蛋蛋白白质质进进行行定定量量分分析析。这这种种方方法法不不是是一一 种种绝绝对对方方法法，因因为为不不同同蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸组组成成会不同，因而不同蛋白质的摩尔吸光系数不同。会不同，因而不同蛋白质的摩尔吸光系数不同。31整理ppt三种芳香族氨基酸及蛋白质的紫外吸收光谱三种芳香族氨基酸及蛋白质的紫外吸收光谱(a)Trp,Tyr and Phe;(b)protein32整理ppt 蛋蛋白白质质易易受受核核酸酸的的污污染染，核核酸酸在在260nm260nm附附近近有有强强的的吸吸收收。为为了了消消除除核核酸酸对对蛋蛋白白质质测测定定的的干干扰扰，可可分分别别测测定定样样品品在在260260和和280 280 nmnm处处的的吸吸光光度度值值，然然后后利利用用两两波波长长下下的的吸吸光光度度差差计计算算蛋蛋白白质质的的浓浓度度。蛋蛋白白质质的的浓浓度度一一般般依依据据下下列列两两个个经经验验公公式计算：式计算：优点：操作简单优点：操作简单缺点：干扰多缺点：干扰多Lowry-Kalekar 公式：公式：蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260Warburg-Chritian公式：公式：蛋白质浓度蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A280-0.76A260式中式中 A260和和A280分别代表样品在分别代表样品在260，280 nm处的吸光度处的吸光度33整理ppt与吸收光谱法相关的研究主要包括以下两方面：与吸收光谱法相关的研究主要包括以下两方面：(1)(1)导数法用于蛋白质的定性和定量分析，如蛋白质导数法用于蛋白质的定性和定量分析，如蛋白质及天然芳香氨基酸的鉴别；及天然芳香氨基酸的鉴别；(2)(2)蛋白质结构及构型的研究。当蛋白质的构型发生蛋白质结构及构型的研究。当蛋白质的构型发生变化时，蛋白质生色基团所处的微环境发生变化，其变化时，蛋白质生色基团所处的微环境发生变化，其吸收光谱随之发生变化，吸收峰将发生红移或蓝移。吸收光谱随之发生变化，吸收峰将发生红移或蓝移。利用利用UVUV差谱可以获得蛋白质构型变化的信息，如利差谱可以获得蛋白质构型变化的信息，如利用溶剂微扰差谱可以探测蛋白质分子中生色基团的暴用溶剂微扰差谱可以探测蛋白质分子中生色基团的暴露程度。露程度。34整理ppt荧光光谱法荧光光谱法 蛋蛋白白质质的的荧荧光光来来自自于于具具有有紫紫外外吸吸收收的的三三种种氨氨基基酸酸，即即酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸。这这三三种种氨氨基基酸酸的的最最大大荧荧光光发发射射波波长长分分别别是是303、348和和282nm。当当这这三三种种氨氨基基酸酸的的浓浓度度相相同同时时，色色氨氨酸酸的的荧荧光光强强度度最最大大，苯苯丙丙氨氨酸酸的的荧荧光光强强度度非非常常弱弱。因因此此，蛋蛋白白质质的的内内源源性性荧荧光光主主要要是是酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基基的的综综合合贡贡献献。值值得得指指出出的的是是：核核酸酸相相对对于于蛋蛋白白质质其其内内源源性性荧荧光光极极弱弱，所所以以对对于于蛋蛋白白质质的的定定量量一一般般无无影影响响。用用荧荧光光法法对对蛋蛋白白质质进进行行定定量量比比紫紫外外分分光光光光度度法法灵灵敏敏，且且没没有有核核酸酸的的干干扰扰，来来自自其其它它小小分分子子化化合合物物的的干干扰扰也也相相对对较较小小。所所以以，常常常常在在中中性性水水溶溶液液中中于于280 nm处处激激发发，在在340-350 nm附附近近检检测测荧荧光光强强度度以以便便对对蛋蛋白质进行定量、半定量或定性分析。白质进行定量、半定量或定性分析。35整理ppt 虽虽然然荧荧光光法法具具有有灵灵敏敏度度高高的的特特点点，但但其其缺缺陷陷也也是是显显而而易易见见的的，不不同同蛋蛋白白质质中中荧荧光光氨氨基基酸酸残残基基的的含含量量可可能能会会有有很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标难。很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标难。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在中性水溶液中的荧光发射光谱酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在中性水溶液中的荧光发射光谱36整理ppt2 化学方法化学方法 蛋蛋白白质质在在可可见见区区无无吸吸收收，故故在在可可见见区区无无法法利利用用蛋蛋白白质质自自身身的的光光谱谱性性质质进进行行分分析析。但但在在紫紫外外区区有有吸吸收收的的干干扰扰物物质质很很多多，为为此此，人人们们努努力力寻寻找找一一些些方方法法，以以便便避避开开紫紫外外区区的的干干扰扰。例例如如，人人们们发发现现蛋蛋白白质质可可以以与与许许多多化化学学试试剂剂(如如染染料料，金金属属离离子子，又又称称之之为为“光光谱谱探探针针”)”)发发生生相相互互作作用用，引引起起探探针针分分子子光光谱谱性性质质(吸吸收收光光谱谱，荧荧光光光光谱谱)的的变变化化。借借助助于于这这些些蛋蛋白白质质光光谱谱探探针针，目目前前已已经经发发展展了了一一系系列列分分析析方方法法，可可以以测测定定微微量量蛋蛋白白质质的的含含量量，甚甚至至用用于于研究蛋白质的结构与功能之间的关系。研究蛋白质的结构与功能之间的关系。37整理ppt凯氏凯氏(Kieldahl)定氮法定氮法 凯凯氏氏定定氮氮法法是是用用于于化化合合物物含含氮氮量量测测定定而而对对蛋蛋白白质质分分析析的的一一种种通通用用方方法法。当当一一种种蛋蛋白白质质的的含含氮氮量量为为已已知知时时该该法法也也可可用用于于蛋蛋白白质质的的定定量量分分析析。但但由由于于非非蛋蛋白白含含氮氮污污染染物物的的存存征征，这这使使得得该该方方法法用用于于蛋蛋白白质质的的定定量量分分析析复复杂杂化化。消消除除干干扰扰的的一一种种比比较较有有效效的的方方法法是是将将蛋蛋白白质质沉沉淀淀，然然后后测测定定沉沉淀淀蛋蛋白白质质中中氮氮的的含含量量，据据此此确确定定蛋蛋白质的含量。白质的含量。38整理ppt 蛋蛋白白质质中中氮氮的的含含量量一一般般取取1515。该该值值对对蛋蛋白白质质的的混混合合物物来来说说比比较较接接近近但但对对于于单单一一的的蛋蛋白白质质，该该值值会会有有一一定定的的差差异异，特特别别是是当当蛋蛋白白质质中中含含有有较较多多的的碱碱性性氨氨基酸残基或者是一种结合蛋白时更是如此。基酸残基或者是一种结合蛋白时更是如此。不同来源蛋白质中氮的含量来源 氮含量/%转换因子*肉类 16.0 6.25血浆 15.3 6.54牛奶 15.6 6.38面粉 17.5 5.70蛋类 14.9 6.68*样品中氮的含量乘以转换因子即得样品中的蛋白质的含量39整理ppt 凯氏定氯法的原理凯氏定氯法的原理 所所有有的的含含氮氮化化合合物物在在浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂(通通常常为为铜铜离离子子)的的存存在在下下加加热热转转化化为为氨氨，氨氨与与硫硫酸酸作作用用生生成成硫硫酸酸铵铵而而稳稳定定存存在在于于溶溶液液中中。这这一一消消化化过过程程非非常常重重要要，一一般般需需要要几几个个小小时时，反反应应开开始始时时溶溶液液逐逐渐渐变变成成棕棕色色或或黑黑色色，并并且且放放出出二二氧氧化化硫硫气气体体，溶溶液液最最终终变变成成无无色色透透明明，之之后后还还需需反反应应两两小小时时。反反应应完完的的溶溶液液冷冷却却、碱碱化化，用用蒸蒸汽汽蒸蒸馏馏法法蒸蒸出出氨氨，并并用用含含指指示示剂剂的的标标准准的的硼硼酸酸水水溶溶液液吸吸收收，然然后后用用标标准准氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液滴滴定定硼硼酸酸溶溶液液中中铵铵离离子子，使使之之恢恢复复到到指指示示剂剂原原来来的的颜颜色色，这这样样便便可可以以测测定定出出样样品品中中氮氮的的量量，最后根据蛋白质氮的含量计算蛋白质的浓度。最后根据蛋白质氮的含量计算蛋白质的浓度。40整理ppt 凯凯氏氏定定氮氮法法测测定定的的是是总总氮氮的的含含量量，采采用用蛋蛋白白质质换换算算系系数数，得得到到的的是是“粗粗”蛋蛋白白质质含含量量。因因为为样样品品中中常常含含的的核核酸酸、生生物物碱碱、含含氮氮脂脂类类、卟卟啉啉等等非非蛋蛋白白质质的的含含氮氮化化合合物物，所所以以这这些些杂杂质质如如果果存存在在的的话话也也都都会会被被同同时时测测定定，因因而而带带来来误误差差。该该法法常常用用于于动动、植植物物食食品品中中蛋蛋白白质质含含量量的的测测定定。由由于于方方法法较较复复杂杂，费费时时，临临床床常常规规分分析析很很难难应应用用。经经改改进进，已已发发展展了了一一种种“自自动动凯凯氏氏定定氮氮法法”。自自动动凯凯氏氏定定氮氮仪仪具具有有自自动动加加碱碱蒸蒸馏馏装装置置，自自动动吸吸收收和和自自动动滴滴定定装装置置及及自自动动数数字字显显示示装装置置等等。大大约约在在两两小小时时内内可可完完成成8 8个个样样品品的的测测定定，具具有有灵灵敏敏、快快速速、样样品用量少等优点。品用量少等优点。41整理ppt三聚氰胺(Melamine)42整理ppt双缩脲法双缩脲法(Biuret Assay)它它是是根根据据双双缩缩脲脲在在碱碱性性硫硫酸酸铜铜溶溶液液中中，铜铜离离子子与与四四个个分分子子双双缩缩脲脲中中的的亲亲核核氮氮原原子子配配位位，而而形形成成紫色络合物的现象发展起来的。紫色络合物的现象发展起来的。双缩脲反应中铜离子与蛋白质络双缩脲反应中铜离子与蛋白质络合物的吸收光谱合物的吸收光谱双缩脲反应所形成络合物的结构双缩脲反应所形成络合物的结构43整理ppt 该该方方法法的的最最大大优优点点是是非非常常可可靠靠，比比较较抗抗干干扰扰，操操作作简简单单快快速速，反反应应使使用用单单一一稳稳定定的的试试剂剂液液，因因而而适适用用于于自自动动分分析析仪仪。双双缩缩脲脲试试剂剂有有几几种种配配方方，其其中中之之一一是是Doumas配配方方，由由硫硫酸酸铜铜，酒酒石石酸酸钾钾钠钠和和氢氢氧氧化化钠钠组组成成。该该显显色色反反应应在在15min内内达达到到平平衡衡，并并可可稳稳定定几几小小时时。所所有有的的蛋蛋白白质质以以相相同同的的方方式式反反应应，蛋蛋白白质质种种类类之之间间的的差差别别极极小小，因因而而是是目目前前较较通通用用的的测测定定蛋蛋白白质质总总量量的的方方法法。但但该该方方法法的的灵灵敏敏度度低低(约约1mg/ml)，测测定定范范围围为为110mg/m1，这这使使得得其其应应用用受受到到了了一一定定的的限限制制。可可用用于于血血清清总总蛋蛋白白的的测测定定。也也适适用用于于豆类、油料、谷类及肉类等样品中蛋白质的测定。豆类、油料、谷类及肉类等样品中蛋白质的测定。44整理pptLowry法法 Lowry法法是是Lowry等等人人于于1951年年建建立立的的，这这是是蛋蛋白白质质测测定定应应用用最最广广，且且灵灵敏敏度度最最高高的的方方法法之之一一，其其灵灵敏敏度度可可达达5 g/ml。该该方方法法利利用用了了一一种种用用来来检检测测酚酚基基的的Folin(磷磷钼钼酸酸盐盐-磷磷钨钨酸酸盐盐)试试剂剂。当当使使用用该该单单一一试试剂剂时时可可检检测测蛋蛋白白质质中中的的酪酪氨氨酸酸残残基基，因因为为该该残残基基中中存存在在酚酚基基。但但当当该该试试剂剂与与铜铜离离子子结结合合使使用用时时其其灵灵敏敏度度可可大大大大改改善善。低低浓浓度度的的双双缩缩脲脲试试剂剂与与蛋蛋白白形形成成的的Cu2+蛋蛋白白质质络络合合物物可可以以还还原原Folin试试剂剂主主要要成成分分磷磷钼钼酸酸盐盐磷磷钨钨酸酸盐盐到到钨钨蓝蓝和和钼钼蓝蓝。反反应应产产物物的的详详细细情情况况目目前前尚尚不不清清楚楚，但但产产物物在在600800 nm范范围围内内有有一一个个宽宽的的吸吸收收峰峰。大大约约75的的还还原原是是由由Cu2+-蛋蛋白白质质络络合合物物贡贡献献的的，而而其其余余主主要要是是由由酪酪氨氨酸酸残残基基贡贡献献的的。色色氨氨酸酸也也有有一一定的贡献。测定一般在定的贡献。测定一般在750 nm处进行。处进行。45整理ppt Lowry法法的的优优点点是是灵灵敏敏度度高高，比比双双缩缩脲脲法法高高100倍倍。不不足足之之处处是是费费时时费费力力，干干扰扰物物质质的的影影响响大大，可可测测定定蛋蛋白白质质样样品品中中所所含含的的酚酚类类和和柠柠檬檬酸酸等等均均干干扰扰测测定定。另另外外，不不同同的的蛋蛋白白质质，其其中中的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基基的的含含量量不不同同，在在显显色色灵灵敏敏度度方方面面存存在在差差异异。为为此此，人人们们还还在在不不断断地地研研究究，特特别别是是不不同同蛋蛋白白质质间间显显色色灵灵敏敏度度差差异异的的消消除除问问题题，这这使使得该方法在不断地完善。得该方法在不断地完善。在在实实验验测测定定时时要要注注意意，Folin试试剂剂仅仅在在酸酸性性条条件件下下稳稳定定，但但还还原原反反应应是是在在pH10的的溶溶液液中中进进行行的的。因因此此，当当Fo1in试试剂剂加加入入到到碱碱性性的的铜铜蛋蛋白白质质溶溶液液中中时时，必必须须立立即即混混合合，以以便便使使还还原原反反应应在在磷磷钼钼酸酸磷磷钨钨酸酸试试剂剂分分解解之之前前已已经经完完成。成。46整理ppt 1985年年，Smith等等对对Lowry法法进进行行了了改改进进，提提出出用用4甲甲酸酸喹喹啉啉代代替替Folin试试剂剂，在在碱碱性性条条件件下下，蛋蛋白白质质与与Cu2+反反应应形形成成的的Cu+与与4甲甲酸酸喹喹啉啉反反应应生生成成紫紫色色络络合合物物，可可在在562nm处处进进行行测测定定。该该试试剂剂比比Lowry法法的的试试剂剂稳稳定定，干干扰扰大大大大减减小小，而而灵灵敏度相近。敏度相近。蛋白质存在下蛋白质存在下Ca2+与与4-甲酸喹啉的络合显色反应甲酸喹啉的络合显色反应47整理ppt3 染料结合法 染染料料结结合合法法在在蛋蛋白白质质分分析析中中应应用用最最为为广广泛泛，它它基基于于人人们们在在2020世世纪纪初初观观察察到到蛋蛋白白质质使使一一些些酸酸碱碱滴滴定定指指示示剂剂颜颜色色改改变变的的现现象象。早早期期的的研研究究兴兴趣趣主主要要在在于于pHpH的的测测定定及及酸酸碱碱指指示示剂剂的的胶胶体体误误差差问问题题。到到2020世世纪纪4040年年代代，KlotzKlotz等等人人经经过过系系统统研研究究才才认认识识到到蛋蛋白白质质对对有有机机染染料料吸吸收收光光谱谱的的影影响响可可以以用用于于研研究究蛋蛋白白质质与与小小分分子