动物细胞培养的应用.ppt

动物细胞培养的应用.表表1 动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等.表2 微生物和动物细胞培养方法的比较微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时几天几天3、4周对水纯度的要求较低很高与与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。.5、动物细胞大规模培养工艺、动物细胞大规模培养工艺大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养的的工工艺艺流流程程如如图图11-15所所示示。工工艺艺过过程程中中，先先将将组组织织切切成成碎碎片片，然然后后用用溶溶解解蛋蛋白白质质的的酶酶处处理理而而得得到到单单个个细细胞胞，再再用用离离心心法法收收集集细细胞胞。将将细细胞胞植植入入营营养养培培养养基基，使使细细胞胞在在培培养养基基中中增增殖殖到到覆覆盖盖瓶瓶壁壁表表面面，用用酶酶把把细细胞胞从从瓶瓶壁壁上上消消化化下下来来，再再接接种种到到若若干干培培养养瓶瓶中中进进行行扩扩大大培培养养，将将培培养养所所得得的的细细胞胞“种种子子”冷冷藏藏于于液液氮氮中中，从从液液氮氮中中取取出出一一部部分分细细胞胞“种种子子”进进行行解解冻冻、复复活活培培养养，进进行行扩扩大大培培养养以以获获得得足足够够的的细细胞胞量量，将将细细胞胞接接种种于于大大规规模模生生物物反反应应器器中中进进行行大大规规模模培培养养，按按照照产产物物的的不不同同形形式式进进行行产产物物分分离离纯纯化化。对对于于积积累累在在细细胞胞内内的的产产物物，可可通通过过收收集集细细胞胞后后进进行行破破胞胞，再再经经过过分分离离纯纯化化获获得得产产物物；对对于于由由细细胞胞分分泌泌到到培培养养液液中中产产物物，可可以以通通过过浓浓缩缩、纯纯化化培培养养液液来来获获得得产产品品；而而对对于于那那些些必必须须加加入入诱诱导导剂剂进进行行培培养养或或病病毒毒感感染染培培养养才才能能得得到到的的产产物物的的细细胞胞，可可加加入入上上述述诱诱导导剂剂诱诱导导或或病病毒毒感感染染后后，收收集集细胞，再经分离纯化得到产物。细胞，再经分离纯化得到产物。.图图11-15 大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养工工艺艺流流程程图图细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品（肿瘤抗原）产品（肿瘤抗原）纯化纯化产品（干扰素）产品（干扰素）纯化纯化提取提取产品（单克隆抗体）产品（单克隆抗体）浓缩纯化浓缩纯化79865432110.内容（一）内容（一）单克隆抗体单克隆抗体哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。.抗体抗体由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。抗原抗原指诱导产生抗体的物质。如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入，即抗原侵入抗体2抗体1.于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。多克隆抗体多克隆抗体在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。单克隆抗体单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。.补充 要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜的细胞系。的细胞系。.细胞系细胞系FucGal唾液酸唾液酸1,61,3Fuc1,3GalSO4-GalNAc2,32,6糖糖 基基化化等等分分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+0鼠杂交瘤鼠杂交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴细胞人淋巴细胞+000+0+人垂体人垂体+00+0+Namalwa+000+-人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤+000+0.动物细胞制药的表达系统与特征动物细胞制药的表达系统与特征昆昆虫虫系系统统、哺哺乳乳动动物物细细胞胞系系统统，最最成成功功、重重要要表表达达活活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。一、哺乳动物细胞表达系统与特征一、哺乳动物细胞表达系统与特征1.动物细胞的特征动物细胞的特征细胞膜、细胞膜、细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。内容（二）内容（二）.2哺乳动物细胞株系哺乳动物细胞株系CHO细细胞胞：中中国国仓仓鼠鼠卵卵巢巢中中分分离离的的上上皮皮样样细细胞胞系系，贴贴壁壁型型生生长长，是是目目前前使使用用最最为为普普遍遍和和成成熟熟的的表表达达糖糖基基化化蛋蛋白白药药物物的的宿宿主主细细胞胞。核核型型为为亚亚二二倍倍体体，分分泌泌表表达达外外源源蛋蛋白白，而而内内源源蛋蛋白白分分泌泌很很少少。贴贴壁壁型型生生长长细细胞胞，但但可可进进行行悬悬浮浮培培养养，对对剪剪切切力力和和渗渗透透压压有有较较高高的的忍忍受受能能力力。蛋蛋白白质质翻翻译译后后的的修修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。有有多多种种衍衍生生突突变变株株应应用用于于药药物物的的生生产产，培培养养时时需需要要添添加加脯脯氨氨酸酸。二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶缺缺陷陷株株表表达达的的药药物物有有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子、凝血因子、DNA酶酶，已上市。，已上市。使使用用氨氨甲甲酰酰喋喋呤呤，增增加加外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数，提提高高蛋蛋白白质质表表达水平。达水平。.BHK21：幼幼仓仓鼠鼠肾肾脏脏中中分分离离的的成成纤纤维维样样细细胞胞，非非整整倍倍体体。用用于于增增殖殖病病毒毒、制制备备疫疫苗苗和和重重组组蛋蛋白白。BHK-21表表达达的的重重组凝血因子组凝血因子已被获准上市。已被获准上市。C127：从从小小鼠鼠乳乳腺腺肿肿瘤瘤中中分分离离获获得得的的上上皮皮样样细细胞胞，贴贴壁壁型型生生长长。C127细细胞胞系系已已表表达达多多种种外外源源基基因因，其其中中EPO的的水水平达平达10mg/L，生产，生产rhGH已被批准上市。已被批准上市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞：J558LJ558L是是小小鼠鼠BALB/cBALB/c骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞，分分泌泌IgAIgA，用用于于转转染染研研究究。NSONSO和和SP2/OSP2/OAg14Ag14不不分分泌泌IgIg，与与淋淋巴巴细细胞胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。.杂杂交交瘤瘤细细胞胞：从从小小鼠鼠脾脾细细胞胞与与骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞的的融融合合细细胞胞中中分分离离获获得得杂杂交交瘤瘤细细胞胞系系，能能在在无无血血清清培培养养基基中中高高密密度度悬悬浮浮生生长长，容容易易转转染染和和生生长长，能能进进行行糖糖基基化化等等加加工工修修饰饰，大大量量分分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。VeroVero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6Vero E6增殖多种病毒，增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。COSCOS：是是从从SV40 SV40 DNADNA转转化化的的非非洲洲绿绿猴猴肾肾细细胞胞CV1CV1中中分分离离得得到到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。GH3GH3用于生长激素研究，用于生长激素研究，293293细胞系用于基因治疗的研究。细胞系用于基因治疗的研究。.3昆虫细胞株系昆虫细胞株系Sf21：从从秋秋粘粘虫虫卵卵巢巢细细胞胞中中分分离离得得到到，细细胞胞较较大大，容容易易放大，高效表达外源基因。放大，高效表达外源基因。Sf9：从从秋秋粘粘虫虫的的卵卵巢巢细细胞胞（SF21）中中分分离离得得到到，是是最最常常用用的的昆昆虫虫表表达达细细胞胞。对对杆杆状状病病毒毒高高度度敏敏感感，生生长长快快，能能高高效效表表达达外外源源基基因因。抗抗机机械械剪剪切切，能能在在无无血血清清培培养养基基的的搅拌反应器中生长。搅拌反应器中生长。TN-5B1-4：从从粉粉纹纹夜夜蛾蛾卵卵细细胞胞匀匀浆浆中中分分离离得得到到，无无血血清清培培养养，快快速速倍倍增增。分分泌泌表表达达重重组组蛋蛋白白的的能能力力比比Sf9细细胞胞系系高高20多倍，能适应悬浮培养。多倍，能适应悬浮培养。.三、细胞转染三、细胞转染转转染染（是是将将外外源源基基因因导导入入哺哺乳乳动动物物细细胞胞的的技技术术通通用用名名称称。基基因因导导入入真真核核细细胞胞的的方方法法很很多多，主主要要有有化化学学转转染染、物物理理转转染和病毒介导的转化。染和病毒介导的转化。方法方法表表 达达 类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点基因枪基因枪瞬瞬 时时，稳定稳定无无多多种种细细胞胞组组织，器官织，器官有有效效，仪仪器器操作操作显微注射显微注射瞬瞬 时时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有有效效，技技术术难度大难度大电穿孔电穿孔瞬瞬 时时，稳定稳定无无多种细胞多种细胞有有效效，仪仪器器操作操作冲击波冲击波瞬瞬 时时，稳定稳定无无多多种种细细胞胞，局部组织局部组织简简单单有有效效，仪器操作仪器操作.方法方法表表达达类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点逆逆 转转 录录 病病毒毒瞬瞬时时，稳定稳定无无对对应应的的宿宿主主细胞细胞有效有效原原 生生 质质 体体融合融合瞬瞬时时，稳定稳定无无悬浮细胞悬浮细胞技术复杂技术复杂生物转染特点生物转染特点.化学转染是最常用的转染方法。化学转染是最常用的转染方法。其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖）葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。磷酸钙与磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡聚葡聚糖与带负电荷的糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。形成脂质体。渗透性休克和渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进等化学试剂能促进DNA进入细胞。转进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。影响因素：细胞培养物的密度、影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用量、的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。.方法方法表表达达类类型型毒性毒性细胞类型细胞类型特点特点磷酸钙磷酸钙瞬瞬 时时、稳定稳定无无贴贴壁壁细细胞胞，悬浮细胞悬浮细胞简单简单DEAE-葡葡聚聚糖糖瞬时瞬时有有CV1，COS简单简单阳离子树脂阳离子树脂瞬瞬 时时、稳定稳定有有或或无无贴贴壁壁、原原代代悬浮细胞悬浮细胞简单，有效简单，有效化学转染的特点化学转染的特点.四、转染体筛选与分离四、转染体筛选与分离转转染染后后16天天收收获获细细胞胞，进进行行核核酸酸分分子子杂杂交交或或蛋蛋白白质质杂杂交，检测外源基因的瞬时表达。交，检测外源基因的瞬时表达。为为了了获获得得稳稳定定整整合合的的细细胞胞系系，先先在在非非选选择择性性培培养养基基上上培培养养2448小小时时，让让细细胞胞倍倍增增12代代，使使转转染染DNA表表达达。再再按按1：15比比例例转转移移到到选选择择性性培培养养基基上上，每每24天天更更换换培培养养基基，持持续续23周周，促促进进抗抗性性细细胞胞生生长长，清清除除死死细细胞胞残残骸，最后得到独立的克隆。骸，最后得到独立的克隆。在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。因此需要显性选择标记来分离转染细胞。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。.选择剂选择剂基因基因使用浓度使用浓度氨甲喋呤氨甲喋呤dhfr0.01300mol/L氨喋呤氨喋呤tk0.4mol/L5-溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷tk30g/mlG418,Zeocinneo100800g/ml潮霉素潮霉素Bhyg10400g/ml杀瘟稻菌素杀瘟稻菌素bsd210g/ml霉酚酸霉酚酸gpt25g/ml嘌呤霉素嘌呤霉素乙酰基转移酶乙酰基转移酶0.510g/mlXyl-Aada4mol/L.报告基因报告基因特点特点使用与分析方法使用与分析方法cat内内源源活活性性低低，蛋蛋白白稳稳定，线性范围窄，定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析体外，荧光或免疫分析lacZ有有内内源源活活性性，X-gal染染色，线性范围宽色，线性范围宽体体内内外外，染染色色，比比色色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析碱碱性性磷磷酸酸酶酶分分泌泌型型，线线性性范范围围宽宽，受到细胞类型限制受到细胞类型限制体体外外，比比色色、化化学学发发光光或荧光分析或荧光分析gus蛋蛋白白质质稳稳定定，线线性性范范围宽，围宽，X-Gluc染色染色体体内内外外，染染色色，比比色色、化学发光或荧光分析化学发光或荧光分析gfp无无内内源源活活性性，分分子子量量小小，稳稳定定，无无需需底底物物，紫紫外外线线激发激发体内外，荧光分析体内外，荧光分析.