基于AFLP分子标记的鸭绿江茴鱼遗传多样性分析.pdf

doi:10.16446/j.fsti.20220900227 收稿日期:2022-09-27 作者简介:闫春梅(1981),高级工程师,研究方向为水产养殖学及预防兽医学。E-mail:410977247 通信作者:金香琴(1980),工程师,研究方向为渔业资源与鱼类生态学。E-mail:kaori0401 项目资助:农业农村部财政专项“东北地区重点水域渔业资源与环境调查”;国家淡水水产种质资源库(FGRC:18537)。基于 AFLP 分子标记的鸭绿江茴鱼遗传多样性分析闫春梅 高春山 郑伟 王秀兰 刘长有 金香琴(吉林省水产科学研究院,吉林长春 130033)摘 要:为探讨鸭绿江茴鱼群体遗传结构及分化水平,为其种质资源保护提供遗传学依据,利用扩增片段长度多态性(AFLP)方法,对分别采自吉林省内鸭绿江上游、松花江上游和临江金鲨养殖场 3 个群体的总计 90 尾鸭绿江茴鱼的遗传多样性进行了比较研究。结果显示,鸭绿江上游、松花江上游和临江金鲨养殖场 3 个群体的观测等位基因数(Na)分别为 1.340 9、1.251 7 和 1.269 1,有效等位基因数(Ne)分别为1.153 8、1.130 0 和 1.144 1,Neis 遗传多样性指数分别为 0.093 2、0.078 2 和 0.086 3,Shannons 信息指数分别为 0.144 7、0.119 8 和 0.131 9,遗传分化系数(Gst)为 0.176 70.254 7,平均值为 0.219 4,遗传相似性为 0.820 60.936 3。UPGMA 聚类分析结果显示,松花江上游群体单独聚为一支,鸭绿江上游群体和临江金鲨养殖场群体出现了聚群情况。结果表明,采样的 3 个鸭绿江茴鱼群体均具有较高的遗传多样性水平,3 个群体发生了显著的遗传分化。关键词:鸭绿江茴鱼;遗传多样性;AFLP 鸭绿江茴鱼(Thymallus arcticus yaluensis)隶属于鲑形目、茴鱼科,主要分布于吉林省鸭绿江流域,分布区域狭小,群体间不存在地理隔离1。该鱼肉质细嫩,营养丰富,经济价值极高,是优质名贵珍稀鱼类。受诸多因素影响,近年来鸭绿江茴鱼资源严重衰退,已被列为国家级保护动物2。自 2013 年开始,孙锴等3、王秀兰等4、曹永芬等5分别在鸭绿江茴鱼人工繁殖及成鱼养殖方面进行了科学研究,突破了鸭绿江茴鱼人工养殖的技术瓶颈。马波等6、刘云国等7和Sun 等8相继应用线粒体 D-loop 基因序列分析法和微卫星标记法对茴鱼群体结构进行了系统分析,更加精确地分析了茴鱼的群体遗传结构,为茴鱼种质资源分析及保护夯实了基础,也为茴鱼人工增殖放流提供了科学依据。但关于鸭绿江茴鱼群体遗传多样性及遗传结构研究至今鲜有报道。本研究将扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)方法应用于鸭绿江茴鱼群体遗传多样性研究中,利用 AFLP标记高度的灵敏性、较好的重复性和丰富的信息量等优势,分析并探讨鸭绿江茴鱼群体遗传结构及群体种质资源现状,以支持鸭绿江茴鱼资源可持续利用研究的稳步开展,为资源的长期开发利用提供重要的数据资料。1 材料和方法1.1 试验材料试验用鸭绿江茴鱼采捕自吉林省内各江段,其中鸭绿江上游采捕 48 尾,松花江上游采捕 24尾;临江金鲨养殖场采集 18 尾,共计 90 尾。PCR 相 关 试 剂 购 自 TaKaRa 公 司;引 物、AFLP 试剂盒、DNA 提取试剂盒及其他试剂均购482水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(5)自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。1.2 DNA 提取DNA 提取按照离心柱型动物组织基因组DNA 提取试剂盒的方法进行。提取的 DNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度后,于 4 保存备用。1.3 AFLP 分析参照 AFLP 试剂盒的说明方法进行 AFLP 反应,并适当优化反应条件。1.3.1 酶切连接采用一步法进行酶切连接反应,接头引物序列详见表 1。具体反应体系(20 L)如下:10Reaction buffer 2.5 L,10 mmol/L ATP 2.5 L,Adapter 1 L,EcoR I/Mse I 2 L,T4 Ligase 1 L,模板 DNA 4 L(50 ng/L),AFLP-Water 7 L。混匀后瞬时离心,37 5 h,8 4 h,4 保存过夜。表 1 AFLP 接头及预扩增引物序列名称序列EcoR I 接头 1CTC GTA GAC TGC GTA CCEcoR I 接头 2AAT TGG TAC GCA GTC TACMse I 接头 1GAC GAT GAG TCC TGA GMse I 接头 2TAC TCA GGA CTC ATEcoR I 预扩增引物序列GAC TGC GTA CCA ATT CAMse I 预扩增引物序列GAT GAG TCC TGA GTA A C1.3.2 预扩增预扩增采用 25 L 反应体系,具体配比如下:10 PCR buffer 2.5 L,预扩增引物(EcoR I/Mse I 50 ng/L 等比混合)1 L,dNTPs 1 L,Taq DNA polymerase(2 U/L)0.5 L,模板 DNA 2 L,ddH2O 18 L。混合均匀后瞬时离心,94 预变性 2 min;94 变性 30 s,56 退火 30 s,72 延伸 80 s,30 个循环;72 延伸 5 min。1.3.3 选择性扩增以预扩增产物 1 20 稀释后作为选扩模板。选择性扩增为 25 L 反应体系,具体配比如下:10 PCR buffer 2.5 L,EcoR I 引物(共 8 种)1 L,Mse I 引物(共8 种)1 L,dNTPs 0.5 L,Taq DNA polymerase 0.5 L,模板 DNA 2 L,ddH2O 17.5 L。混匀后瞬时离心。94 变性 30 s,65 退火30 s,72 延伸80 s,以后每轮循环温度递减 0.7,扩增 12 轮。接着按 94 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 80 s 扩增 23 轮。选择性扩增引物序列见表 2。表 2 选择性扩增引物序列EcoR I 引物(5 ng/L)序列(5-3)Mse I 引物(30 ng/L)序列(5-3)EcoR I-1GAC TGC GTA CCA ATT CAACFAM 标记Mse I-1GAT GAG TCC TGA GTA ACA AEcoR I-2GAC TGC GTA CCA ATT CAAGFAM 标记Mse I-2GAT GAG TCC TGA GTA ACA CEcoR I-3GAC TGC GTA CCA ATT CACAFAM 标记Mse I-3GAT GAG TCC TGA GTA ACA GEcoR I-4GAC TGC GTA CCA ATT CACTFAM 标记Mse I-4GAT GAG TCC TGA GTA ACA TEcoR I-5GAC TGC GTA CCA ATT CACCFAM 标记Mse I-5GAT GAG TCC TGA GTA ACT AEcoR I-6GAC TGC GTA CCA ATT CACGFAM 标记Mse I-6GAT GAG TCC TGA GTA ACT CEcoR I-7GAC TGC GTA CCA ATT CAGCFAM 标记Mse I-7GAT GAG TCC TGA GTA ACT GEcoR I-8GAC TGC GTA CCA ATT CAGGFAM 标记Mse I-8GAT GAG TCC TGA GTA ACT T1.3.4 AFLP 图谱分析AFLP 多态性分析采用 ABI 377 测序仪进行。1.4 数据分析利 用 GENESCAN 3.1 提 取 数 据,利 用Binthere 软件提取样品片段大小。利用 Excel 软件进行数据统计 01 矩阵处理,将不为 0 的数值转换为 1,数值 0 不变,生成由 0 和 1 组成的原始矩阵。利用 Popgen 32 软件分析位点总数、多态性位点、多态性位点频率、观测等位基因数、有效等位基因数、Neis 多样性指数、Shannons 信息指数等遗传学数据。利用 NTSYSpc-2.11F 软件对原始矩阵求 DICE 相似系数矩阵。用 SHAN 程序中的 UPGMA 方法进行聚类分析,并通过 Tree plot模块生成聚类图。2 结果2.1 AFLP 选择性扩增结果筛选多态性好且条带清晰的 EcoR I 和 Mse I引物组合 8 对,对 90 尾茴鱼进行了 AFLP 分析,结果见表 3。8 组引物共扩增出 2 670 个位点,其中多态性位点 2 466 个,多态性位点比例为92.4%。其中,引物组合 E10M6 多态性位点比例最高,达到 99.4%;引物组合 E3M7 多态性比例最低,为 84.0%。5822023,50(5)水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)表 3 8 组引物的多态性分析引物组合总位点数/个多态性位点数/个多态性位点比例/%E3M231227989.4E3M730025284.0E6M530026488.0E6M634831891.4E7M536634594.3E9M730929495.1E10M527325593.4E10M646245999.4合计2 6702 46692.42.2 遗传多样性分析利用 Popgen 32 软件分析3 个群体90 尾鸭绿江茴鱼的遗传多样性,结果见表 4。其中 E10M6引物组合的各项参数值均最高,观测等位基因数(Na)为 1.708 3,有效等位基因数(Ne)为1.257 0,Nei s 多 样 性 指 数(H)为 0.160 4,Shannons 信息指数(I)为 0.256 2。3 个群体比较,鸭绿江上游群体的各项参数值均最高,Na为 1.340 9,Ne为 1.153 8;H 为 0.093 2,I 为0.144 7;临江群体次之,松花江上游群体各项参数值均最低。表 4 3 个鸭绿江茴鱼群体遗传参数比较引物组合观测等位基因数(Na)有效等位基因数(Ne)Neis多样性指数(H)Shannons信息指数(I)E3M21.430 61.176 90.109 40.171 2E3M71.388 91.142 80.088 50.140 9E6M51.407 41.123 50.081 00.132 7E6M61.490 71.156 60.101 40.165 5E7M51.532 41.200 10.122 90.194 6E9M71.453 71.185 80.113 30.177 1E10M51.393 51.184 00.112 10.173 1E10M61.708 31.257 00.160 40.256 2鸭绿江上游群体1.340 91.153 80.093 20.144 7松花江上游群体1.251 71.130 00.078 20.119 8临江群体1.269 11.144 10.086 30.131 9 利用 Popgen 32 软件分析 3 个茴鱼群体的遗传分化情况,结果见表 5。8 对引物组合的遗传分化系数(Gst)为 0.176 70.254 7,其中 E10M6 值最大,E6M5 值最小,表明 8 对引物组合在 3 个群体间的遗传分化占总群体杂合度的 17.67%25.47%。3 个群体的平均 Gst值为 0.219 4,表明3 个群体间发生了一定程度的分化。其中,松花江上游群体与临江群体间平均 Gst值为 0.232 2,松花江上游群体与鸭绿江上游群体间平均 Gst值为 0.186 6,鸭绿江上游群体与临江群体间平均Gst值为 0.094 3,可见任意两个群体间均发生了中等程度以上的遗传分化。表 5 3 个鸭绿江茴鱼群体间的遗传分化系数引物组合总群体杂合度(Ht)亚群体杂合度(Hs)遗传分化系数(Gst)E3M20.108 80.085 30.215 9E3M70.093 80.071 60.237 4E6M50.078 90.065 00.176 7E6M60.094 50.071 90.238 9E7M50.125 40.099 80.204 1E9M70.107 90.087 20.191 6E10M50.106 60.081 50.236 0E10M60.167 90.125 10.254 7平均值0.110 50.085 90.219 4 通过分析 DICE 相似系数矩阵,90 尾茴鱼的遗传相似性为 0.820 60.936 3。其中,3 个群体内遗传相似性分别为:鸭绿江上游群体 0.832 20.936 3,平均 0.895 9;松花江上游群体 0.879 60.931 7,平 均 0.900 9;临 江 群 体 0.855 3 0.910 3,平均 0.881 6。利用 8 对引物对 3 个鸭绿江茴鱼群体进行 UPGMA 聚类分析,结果显示,3个茴鱼群体中,松花江上游群体单独聚为一支,鸭绿江上游群体和临江群体出现聚群情况。图 1 3 个鸭绿江茴鱼群体系统进化树3 讨论遗传多样性(genetic diversity)又称基因多样性,是指种内基因的变化,包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传变异。AFLP 是一种基于 PCR 反应选择性地扩增限制片段的方法,根据特异片段或多态位点的频率或遗传相似性可进行遗传多样性及遗传分化等研究。本研究主要是对吉林省鸭绿江茴鱼群体进行种群内的遗传变异分析。从多肽位点比例(PPL)、观测等位基因数682水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(5)(Na)、有效等位基因数(Ne)、Neis 多样性指数(H)、Shannon s 信息指数(I)、总群体杂合度(Ht)、亚群体杂合度(Hs)、遗传分化系数(Gst)和群体遗传相似性等几个遗传多样性分析常用指标,对分别采捕(采集)自鸭绿江上游、松花江上游以及临江金鲨养殖场的共计 90 尾鸭绿江茴鱼的鳍条样本进行了 AFLP 遗传多样性分析。3.1 鸭绿江茴鱼遗传多样性水平分析鸭绿江茴鱼分布于鸭绿江上游及其支流水系中,其分类学地位一直存有争议1。2011 年,孙家贤等9对黑龙江茴鱼、下游黑龙江茴鱼及黑龙江上游呼玛河流域北极茴鱼等 3 种茴鱼的遗传多样性进行了微卫星比较分析,确定 3 种茴鱼遗传多样性水平很高,种间产生了显著的遗传分化,并支持 3 种茴鱼在属内各为独立种的分类学地位。Koskinen 等10、Stamford 等11利用微卫星分子标记和 mtDNA-RFLP 标记分别研究了欧洲和美洲不同茴鱼群体的地理遗传结构及亲缘关系。Froufe 等12、Weiss 等13和马波等6利用线粒体D-loop 区 DNA 序列分析了不同茴鱼群体的分子进化关系。但关于鸭绿江茴鱼遗传多样性水平的分析研究国内尚未见相关报道。大规模的群体遗传分析是更好地保护茴鱼群体资源的重要手段和方法。本研究利用 AFLP 方法,对吉林省内鸭绿江茴鱼 3 个群体进行了遗传多样性水平分析,共筛选出 8 组多态性好且条带清晰的引物,对 90 尾茴鱼 DNA 样本进行 PCR 扩增,总计扩增出 2 670个位点,其中多态性位点 2 466 个,多态性位点的比例高达 92.4%,显著高于福建近海竹荚鱼闽东和闽南群体(63.28%、61.89%)14及广东省吉富罗非鱼群体(87.17%)15,可见本研究中 90 尾鸭绿江茴鱼遗传多态性较高。究其原因,可能是本研究采集的鸭绿江茴鱼大多数来自野生环境,且采自不同地域,这也表明吉林省内茴鱼种质资源质量较好。本研究对 3 个鸭绿江茴鱼群体进行了遗传结构及遗传变异分析,Na、Ne、H、I 这 4 个指标的结果显示,鸭绿江上游群体各项值均最高,分别为1.340 9、1.153 8、0.093 2、0.144 7;临江群体次之,松花江上游群体各项值最低。筛选出 8 组引物对3 个群体的90 尾鸭绿江茴鱼进行 PCR 扩增,计算结果,Na为 1.251 7 1.340 9,Ne为 1.130 0 1.153 8,H 为 0.078 2 0.093 2,I 为 0.119 8 0.144 7,这与吉林省杂色杜父鱼野生群体的测量值相当(Na为 1.203 71.316 6,Ne为 1.111 91.151 7,H 为 0.067 0 0.091 2,I 为 0.102 0 0.141 0)16,而略低于翘嘴红鲌太湖野生群体(Na为 1.579 9,Ne为 1.385 9,I 为 0.322 1)17,可见本研究采集的 90 尾鸭绿江茴鱼个体间存在一定的遗传变异,对环境的适应性为中等。3.2 鸭绿江茴鱼遗传结构分析遗传分化系数度量的是群体间的基因多样性。Wright18认为,当群体之间的遗传分化处于中等程度时,遗传分化系数通常在 0.05 0.15。本研究利用 Ht、Ns及 Gst指标值对 3 个鸭绿江茴鱼群体的遗传分化情况进行分析,Gst平均值为0.219 4,这与条斑星鲽引进群体的 Gst值相近(0.219)19,而高于福建近海竹荚鱼闽东和闽南群体(0.044 3)14。表明本研究 3 个鸭绿江茴鱼群体之间的遗传分化程度很高。遗传相似性及 UPGMA 聚类分析结果显示,3个群体 90 尾鸭绿江茴鱼个体的遗传相似性较高,为 0.820 60.936 3,遗传距离较小。通过系统进化树明显看出,松花江上游群体单独聚为一支,鸭绿江上游群体和临江群体聚为一支,表明 3 个群体间出现了较高程度的分化,这与遗传分化系数显示的结果相一致。参考文献1张艳珍,付龙威,李梦瑶,等.茴鱼属鱼类分类地位和分子系统发育研究现状J.水产学杂志,2020,33(3):19-23.2MA B,JIANG H Y,SUN P,et al.Phylogeny and dating of diver-gences within the genus Thymallus(Salmonidae:Thymallinae)using complete mitochondrial genomesJ.Mitochondrial DNA Part 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0.093 2,0.078 2 and 0.086 3,respectively;the Shannon s information index were 0.144 7,0.119 8 and 0.131 9,respectively.The genetic differentiation coefficient(Gst)was 0.176 7-0.254 7 with the mean value of 0.219 4,and the genetic similarity was 0.820 6-0.936 3.UPGMA clustering revealed that the Songhua River population was clustered into a single group,but the populations of Yalu River and Jinsha Farm of Linjiang were clustered into another aggregation.This research indicated that three populations of T.arcticus yaluensis in Jilin Province had high levels of genetic diversity and a significant genetic differentiation.Key words:Thymallus arcticus yaluensis;genetic diversity;amplified fragment length polymorphism(AFLP)882水产科技情报(Fisheries Science&Technology Information)2023,50(5)