黄韧带中成纤维细胞生长因子1、血管内皮生长因子表达与腰椎管狭窄患者腰椎减压术后再狭窄的关系.pdf

实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18黄韧带中成纤维细胞生长因子1、血管内皮生长因子表达与腰椎管狭窄患者腰椎减压术后再狭窄的关系陈耀鑫 黎松波 方冠军 叶国标 刘先银南方医科大学附属东莞医院骨科（广东东莞 523000）【摘要】目的探讨腰椎管狭窄（LSS）患者黄韧带中成纤维细胞生长因子1（FGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）表达与腰椎减压术后再狭窄的关系。方法选择138例行腰椎减压术治疗的LSS患者，分为轻度组 绝对跛行距离（ACD）200 m，41 例、中度组（ACD 201 400 m，67 例）和重度组（ACD 400 m，30例），另选择138例非LSS患者为对照组。检测黄韧带组织FGF-1、VEGF表达，术后随访统计再狭窄发生情况。结果LSS组黄韧带组织中FGF-1表达低于对照组（P 0.001），VEGF表达高于对照组（P 0.001）。重度组黄韧带组织中FGF-1表达低于中度组和低度组（P 0.05），VEGF表达高于中度组和低度组（P 0.05）。LSS椎管重度狭窄、减压不彻底、VEGF高表达是LSS患者腰椎减压术后再狭窄危险因素（P 0.05，P 0.001），FGF-1是保护因素（P 400 m，30 cases），and 138 nonLSS patients were selected as control group.The expressions of FGF1 and VEGF in ligamentum flavum were detected，and the restenosis was measured after the operation.Results The expression of FGF1 in LSS group was lower than that in control group（P 0.001），and the expression of VEGF was higher than that in control group（P 0.001）.The expression of FGF1 in severe group was lower than that in moderate and low degree groups（P 0.05），and the expression of VEGF was higher than that in moderate and low degree groups（P 0.05）.Severe spinal stenosis，incomplete decompression and high expression of VEGF were risk factors for restenosis after lumbar decompression in patients with LSS（P 0.05，P 0.001），and FGF1 was protective factor（P 400 m，30 例）8。另选择同期我院骨科收治的 138 例行腰椎手术治疗的非LSS患者为对照组，男89例，女49例，年龄50 65岁，平均（55.10 7.19）岁，手术部位：L3-4 28例，L4-5 93例，L5-S1 17例。两组性别、年龄、手术部位比较差异无统计学意义（P 0.05）。本研究已经获得南方医科大学附属东莞医院伦理委员会批准，患者及其家属均知情同意签署同意书。1.2黄韧带中FGF1、VEGF表达检测采用实时定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测黄韧带中FGF-1、VEGF表达：取手术切除的黄韧带，Trizol法（美国Thermo Fisher公司）提取组织总RNA，取1 mg总 RNA，使用 cDNA Synthesis kit（日本 TaKaRa 公司）将其反向转录成cDNA。取2 L cDNA样品加入 qRT-PCR 体系，MyiQ2 双色实时 PCR 检测系统（美国Bio-Rad公司）进行qPCR反应。以-actin为内参，2-Ct 计算FGF-1、VEGF相对表达量。1.3免疫组织化学法黄韧带中 FGF1、VEGF 蛋白表达检测取黄韧带组织石蜡包埋切片，经40 温水浸泡5 min，37 恒温箱烘干，无水乙醇梯度脱蜡。抗原修复和血清封闭后加入一抗，4 孵育过夜，加入二抗，37 温箱孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗 3 次，37 温箱孵育 30 min。光学显微镜下观察，以磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照，细胞质黄染或棕染为阳性。1.4术后随访所有患者出院后均定期接受电话随访和门诊复查腰椎 MRI，随访时间截止 2022年 12 月，统计术后再狭窄的发生情况，术后再狭窄指原发病灶再次发生狭窄。收集患者性别、年龄、体质量指数、吸烟史、饮酒史、基础疾病、LSS病程、临床症状、LSS 侧别、手术部位、手术时间、术后第 6 个月以及术后 1 年的 Oswestry 残疾指数（ODI）9和腰痛和下肢痛视觉模拟量表（VAS）评分10、减压不彻底（术后MRI复查提示腰椎存在突出物残留）、邻近节段病变、术后并发症。1.5统计学方法采用SPSS 25.00录入和分析数据，连续性变量均符合正态分布以（x s）表示，采用单因素方差分析（两两对比采用LSD-t检验）或独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，采用2检验。多因素logistic回归分析LSS患者腰椎减压术后再狭窄的危险因素。检验水准=0.05，P 0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1LSS组和对照组黄韧带组织中FGF1、VEGF表达比较免疫组化检测结果显示 LSS 组黄韧带组织中 FGF-1 蛋白阳性表达率为 20.29%（28/138），低于对照组的56.52%（78/138）（2=38.291，P 0.001），VEGF 蛋白阳性表达率为 68.12%（94/138），高于对照组的23.91%（33/138）（2=54.272，P 0.001）。qPCR检测结果显示LSS组黄韧带组织中FGF-1表达低于对照组（P 0.001），VEGF表2290实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18达高于对照组（P 0.001）。见表1。2.2不同椎管狭窄程度 LSS 患者黄韧带组织中FGF1、VEGF 表达比较重度组黄韧带组织中FGF-1表达低于中度组和低度组（P 0.05），且中度组低于低度组（P 0.05），重度组黄韧带组织中VEGF 表达高于中度组和低度组（P 0.05），且中度组高于低度组（P 0.05）。见表2。2.3LSS患者腰椎减压术后再狭窄的因素分析中位随访 23 个月，失访 2 例，发生再狭窄 48 例。再狭窄组年龄大于无再狭窄组（P 0.001），男性、吸烟史、糖尿病、LSS椎管重度狭窄、减压不彻底、邻近节段病变比例高于无再狭窄组（P 0.05，P 0.001），LSS病程长于无再狭窄组（P 0.001），术后6个月ODI评分、术后1年ODI评分、术后6个月腰痛VAS 评分、术后1年腰痛VAS 评分、VEGF表达高于无再狭窄组（P 0.001），FGF-1表达低于无再狭窄组（P 0.05）。见表3。2.4影响LSS患者腰椎减压术后再狭窄的logistic回归分析多因素 logistic 回归方程，向后逐步法排除无关变量，最终LSS椎管重度狭窄、减压不彻底、高表达VEGF是LSS患者腰椎减压术后再狭窄危险因素（P 0.05，P 0.001），FGF-1是保护因素（P 0.05）。见表4。3讨论本研究首次证实LSS黄韧带组织中FGF-1表达下调，FGF-1蛋白阳性表达率降低，VEGF表达明显上调，VEGF蛋白阳性表达率升高，随着椎管狭窄程度增加FGF-1表达降低，VEGF表达升高，回归分析结果证实高表达VEGF是LSS患者腰椎减压术后再狭窄危险因素，FGF-1是保护因素，提示FGF-1表达缺失、VEGF过表达可能促使黄韧带肥厚，与LSS腰椎椎管狭窄程度加重以及术后再狭窄有关。椎管减压术后因减压不足、术前腰椎不稳定、邻近节段腰椎退变等因素导致再狭窄和 LSS 复发11。研究显示12LSS患者椎管减压融合术后病灶复发率达48.8%。再次手术率为（11.22 4.25）%13。若LSS复发再次接受手术治疗术后疼痛和腰椎功能改善程度明显差于首次手术14。黄韧带细胞及其周围组织分泌的多种细胞因子和生长因子在黄韧带纤维化激活中发挥不可替代的作用15。FGF-1具有抗炎和抗纤维化作用，通过促进TGF-受体1降解，减弱 TGF-1 下游 Smad 信号通路，抑制肌成纤维细胞分化，减弱肝脏16和肺7的纤维化。FGF-1还可抑制核因子-B和c-Jun N端激酶信号通路抑制炎症反应，降低炎性损伤17。本研究发现FGF-1表达缺失与LSS腰椎椎管狭窄程度加重以及术后再狭窄有关，推测可能的机制为：机械拉伸作用下黄韧带组织中白细胞介素（IL）-6表达促使黄韧带组织炎症，诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变，导致黄韧带纤维化和肥大18，而FGF-1 可下调 IL-6、IL-8、环氧化酶 2/前列腺素 E2的表达，限制机械力诱导的炎症反应，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变19，缓解纤维化进程。本研究发现VEGF过表达可能促使黄韧带肥厚，VEGF可能是腰椎管狭窄症的发病机制之一。HUR等20报道也显示LSS患者外周血VEGF水平较非 LSS 对照组显著增高，且与黄韧带厚度呈正相关，LAKEMEIER等21研究也显示黄韧带组织中VEGF表达增高与MRI测量的椎间盘黄韧带横截断面积增大有关。分析原因为机械应激和炎症反应刺激下，VEGF表达上调，介导血管新生增加和黄韧带肥大和纤维化，进而导致腰椎椎管狭窄20。VEGF及其受体VEGFR-1和VEGFR-2在椎间盘细胞产生的IL-1、肿瘤坏死因子-诱导下表达上调，有助于LSS机械应激引起的肥大黄韧带中血管生成22，进而加剧椎管狭窄程度。本研究局限性在于样本例数偏少，可能存在统计学偏倚，其次为单中心研究，可能样本不具有普遍性，难以直接证实 FGF-1、VEGF 与椎间管狭表1LSS组和对照组黄韧带组织中FGF-1、VEGF表达比较Tab.1Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control groupx s组别LSS组对照组t值P值例数138138FGF-12.03 0.425.39 1.57-24.287 0.001VEGF7.02 1.954.18 1.2714.336 0.001表2不同椎管狭窄程度LSS患者黄韧带组织中FGF-1、VEGF表达比较Tab.2Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosisx s组别轻度组中度组重度组F值P值例数416730FGF-12.20 0.212.05 0.36a1.75 0.13ab22.257 0.001VEGF6.22 0.167.02 1.21a8.11 0.36ab41.189 0.001注：与轻度组比较，aP 0.05；与中度组比较，bP 0.052291实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18表3影响LSS患者腰椎减压术后再狭窄的因素分析Tab.3Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patientsx s项目年龄（岁）性别 例（%）男 女体质量指数（kg/m2）吸烟史 例（%）饮酒史 例（%）基础疾病 例（%）高血压 糖尿病 高脂血症LSS病程（个月）临床症状 例（%）腰痛 下肢痛 间歇性跛行 下肢肌力减退LSS侧别 例（%）单侧 双侧LSS椎管狭窄程度分级 例（%）轻中度 重度手术部位 例（%）L3-4 L4-5 L5-S1术后6个月ODI评分（分）术后1年ODI评分（分）术后6个月腰痛VAS 评分（分）术后1年腰痛VAS 评分（分）术后6个月下肢痛VAS 评分（分）术后1年下肢痛VAS 评分（分）减压不彻底 例（%）邻近节段病变 例（%）术后并发症 例（%）切口感染 脑脊液漏FGF-1VEGF再狭窄组（n=48）58.32 6.0235（72.92）13（27.08）23.12 0.6930（62.50）21（43.75）23（47.92）30（62.50）19（39.58）10.21 2.0342（87.50）40（83.33）21（43.75）10（20.83）31（64.58）17（35.42）27（56.25）21（43.75）10（20.83）32（66.67）6（12.50）29.35 6.0917.21 2.023.02 0.952.05 0.472.11 0.691.67 0.4212（25.00）11（22.92）4（8.33）2（4.17）1.85 0.268.10 0.33无再狭窄组（n=88）53.02 5.0948（54.55）40（45.45）23.05 0.5136（40.91）30（34.09）32（36.36）29（32.95）26（29.55）7.12 1.6980（90.91）79（89.77）33（37.50）16（18.18）65（73.86）23（26.14）79（89.77）9（10.23）16（18.18）62（70.45）10（11.36）15.21 3.0211.32 2.652.11 0.691.25 0.322.05 0.431.60 0.419（10.23）8（9.09）6（6.82）1（1.14）2.17 0.366.59 0.37t/2值5.4334.4070.6735.7971.2361.72111.0381.4349.4800.3911.1780.5070.1411.28820.3010.21318.11213.4116.41211.7510.6240.9435.1914.9400.1500.291-5.43023.607P值 0.0010.0360.5020.0160.2660.1900.0010.235 0.0010.5320.2780.4770.7070.256 0.0010.899 0.001 0.001 0.001 0.0010.5340.3470.0230.0260.6990.590 0.001 0.0012292实用医学杂志 2023年第39卷第18期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.18窄程度的关系，仍需扩大样本例数，开展大样本、多中心临床研究以及基础研究加以证实。综上所述，检测黄韧带组织中 FGF-1、VEGF表达有助于了解黄韧带病变情况，评估术后再狭窄风险。FGF-1、VEGF 有望作为 LSS 治疗的潜在靶点。【Author contributions】CHEN Yaoxin：Design a research plan，implement the research process，and write a paper.LI Songbo，LIU Xianyin：Propose research ideas，analyze experimental data，and review papers；YE Guobiao，FANG Guanjun：Implementing the research process，collecting and organizing data，and revising papers；Conduct statistical analysis.参考文献1 BUSSIRES A，CANCELLIERE C，AMMENDOLIA C，A，et al.Non-Surgical Interventions for Lumbar Spinal Stenosis Leading To Neurogenic Claudication：A Clinical Practice Guideline J.J Pain，2021，22（9）：1015-1039.2 薛厚军，雷宇，黄杰彬，等.经皮内窥镜下二次椎间孔成形术在腰椎管狭窄症中的临床应用 J.实用医学杂志，2021，37（2）：138-143.3 SUZUKI A，NAKAMURA H.Microendoscopic Lumbar Posterior Decompression Surgery for Lumbar Spinal Stenosis：Literature Review J.Medicina（Kaunas），2022，58（3）：384.4 MELCHER C，PAULUS A C，ROBACH B P，et al.Lumbar spinal stenosis-surgical outcome and the odds of revision-surgery：Is it all due to the surgeon？J.Technol Health Care，2022，30（6）：1423-1434.5 SUN C，ZHANG H，WANG X，et al.Ligamentum flavum fibrosis and hypertrophy：Molecular pathways，cellular mechanisms，and future directions J.FASEB J.2020，34（8）：9854-9868.6 LIN Q，HUANG Z，CAI G，et al.Activating Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase Mediates Fibroblast Growth Factor 1 Protection From Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice J.Hepatology，2021，73（6）：2206-2222.7 ZHANG A，WANG G，JIA L，et al.Exosome-mediated microRNA-138 and vascular endothelial growth factor in endometriosis through 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