黄芪桂枝五物汤介导GLP-1R_Akt信号通路对大鼠脑缺血再灌注损伤和神经元凋亡的影响.pdf

中医中药 2023 年第 15 期 每周文摘养老周刊121黄芪桂枝五物汤介导 GLP-1R/Akt 信号通路对大鼠脑 缺血再灌注损伤和神经元凋亡的影响 马 霄 颜国华 王丽君（郑州工业应用技术学院 河南 郑州 451150）【摘要】目的:分析黄芪桂枝五物汤介导 GLP-1R/Akt 信号传导通路对大鼠 CIRI 与神经元凋亡的影响。方法:SD 大鼠 50 只随机划分 5 组、造模，干预一周，并依次对各组的大鼠给予神经功能缺损的评定；并用 ELISA 法测定其血清中的 IL-1、IL-6 的水平，HE 法测定脑组织的病理学情况，免疫组化法测定脑组织内的 Bcl-2、Bax 蛋白的表达情况，蛋白质印迹法测定脑组织的 Cyt-C、Caspase-9、p-Akt 蛋白的表达状况。结果:对比模型组，中药高剂量组、尼莫地平组的神经功能受损分数均明显下降（P0.05），血清的 IL-1、IL-6 的检测水平明显下降（P0.05），神经元细胞以及尼氏小体的受损改善，Bcl-2 的表达明显增高、Bax 的表达明显下降（P0.05），Cyt-C、Caspase-9 蛋白的表达明显降低、p-Akt蛋白的表达明显增高（P0.05）。结论:黄芪桂枝五物汤可改良大鼠的 CIRI，抑制神经元的进一步凋亡，其作用机制很可能和激活了 GLP-1R/Akt 信号传导通路有关。【关键词】黄芪桂枝五物汤；凋亡；损伤；脑缺血【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编码】2097-2644（2023）15-0121-03 近年来的研究提到，脑卒中不仅会严重地危害患者的生命和健康，也会明显抑制其的生活质量。在基础研究的持续深入下，对于脑缺血再灌注损伤（CIRI）的防治成为脑缺血疾病的救治中关键的环节1。近年以来，中医药以其多靶位点的独有优势占据首要地位2。研究可见黄芪桂枝五物汤用于心肌的缺血再灌注损伤中可以发挥上调SOD、Bcl-2 活性的效果，进而起到保护心肌细胞的缺血再灌注损伤效果3。另外，还有研究观察到黄芪多糖可以改善急性起病的 CIRI 的氧化应激、免疫功能异常程度4。由此可推测黄芪桂枝五物汤能够对 CIRI 的治疗起作用。然而，关于黄芪桂枝五物汤对于 CIRI 中的神经元凋亡影响以及有关信号机制的报道有限。为明确黄芪桂枝五物汤对于CIRI 中所起的神经保护效果，本次的研究构建起CIRI 的大鼠模型，分析黄芪桂枝五物汤对脑血管疾病的疗效及可能机制。1 实验材料与方法 1.1 动物 健康的雄性 SD 大鼠 50 只，8 到 10 周龄，体质量为（20020）g，由郑州大学动物实验中心所提供。1.2 试剂、药物与仪器 黄芪桂枝五物汤:黄芪、桂枝、芍药、大枣、生姜购自张仲景大药房。尼莫地平片（规格 20 mg/片）购自广东华南药业集团公司。大鼠 IL-1、IL-6 的 ELISA 试剂盒购于上海臻科生物技术公司；尼氏染色的试剂、免疫组化的试剂购于南京弗瑞思生物科技公司；HE 染色的试剂、ECL 发光液以及 PVDF 膜购于上海歌凡生物科技公司；兔抗 Bcl-2 单克隆抗体（ab32124）、兔抗 Bax 单克隆抗体（ab32503）、兔抗 Cyt-C 单克隆抗体（ab133504）、兔抗 p-Akt多克隆抗体（ab8933）、兔抗 Caspase-9 单克隆抗体（ab32539）购自上海三抒生物科技公司。Leica CM1520 切片机购自徕卡显微系统（上海）贸易公司，VHX-7000N 光学显微镜购自基恩士(中国)公司，HBS-1101 酶标分析仪购自南京德铁实验设备公司，Allegra V-15R 低温离心机购自贝登电子商务公司，电泳系统购自川布兰生物技术开发公司。2 实验方法 2.1 模型制备与分组 SD 大鼠 50 只随机划分假手术组、黄芪桂枝五物汤低（中药低剂量组）与高剂量组（中药高剂量组）、模型组以及尼莫地平片组，各组均有10 只大鼠。以 Himori 法构建出脑缺血再灌注损伤（CIRI）的大鼠模型。大鼠适应性喂养 7 d，以 Himori 法构建 CIRI模型，过程为：称重，4%的水合氯醛麻醉并固定，分离且裸露大鼠的颈总动脉（双侧），4 号的手术缝合线经过其双侧的颈总动脉作出一松结。随后在左右两侧以 4 号的手术缝合线在结内穿过一根的 1 号规格的手术缝合线，缝合。手术过程中，恒温（37.0）。手术后的 24 h 拉紧 4 号线能够实现短暂缺血再灌注，10 min 过后经过牵拉两侧的 1 号线可对 4 号线的线结实现松解，以恢复血供。将手术组的大鼠手术植入 1 号和 4 号线，无需体外的缺血再灌注干预。模型制备结束，黄芪桂枝五物汤低、高剂量组分别为 10、30 mgkg1剂量的黄芪桂枝五物汤，1 次/日，连续一周；尼莫地平片组同法给予 8.0 每周文摘养老周刊 2023 年第 15 期 中医中药 122mgkg1的尼莫地平，1 次/日，连续一周；假手术组、模型组予以等体积的生理盐水（同法）。2.2 神经功能受损的评定 于造模结束和给药结束，对各组予以神经功能受损的评定。2.3 ELISA 法测定血清的炎症指标 对各组大鼠进行心脏采血，4 离心机中 2 000 rmin1的速度离心 30 min 的时间，留取上层的清液，据试剂盒的说明书测定血清中 IL-1 与IL-6 的水平。2.4HE 染色测定大鼠的脑组织病理情况 分离大鼠脑组织，一部分的脑组织快速冷冻保存于80 液氮中备用，余下的经石蜡包埋，切片 4 m。按照说明书展开 HE 染色，于光镜下观察并收集图像。2.5 尼氏染色下对神经元形态的观察 大鼠的脑组织在 4%的多聚甲醛固定过后，石蜡包埋处理，尼氏染色，再以 1%的甲酚紫溶液予以特异性的染色，于光镜下进行观察。2.6 免疫组化测定大鼠的脑组织中 Bcl-2、Bax的表达情况 大鼠的脑组织脱蜡至水之后，予以高温修复，自然地降到室温，用 3%的过氧化氢于 37 C 温度下孵育半小时的时间，5%的山羊血清在室温下封闭 1 h 左右，添加稀释的兔抗 Bcl-2 单克隆抗体、兔抗 Bax 单克隆抗体，置于 4 的温度下孵育并过夜，次日以 PBS 洗涤，添加相应的稀释过的二抗，DAB 显色，复染、洗涤，封片、光镜下观察并拍照，Image J 软件测定图像且分析。2.7 测定脑组织有关蛋白的表达情况 将脑组织均匀剪碎后置于RIPA裂解液并提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白的浓度，取出 50 g的样品液进行电泳分离，以湿转法转到 PVDF 膜，将膜与稀释过的兔抗 Cyt-C 单克隆抗体、兔抗Caspase-9 单克隆抗体、兔抗 p-Akt 多克隆抗体，放置于 4的环境下孵育且过夜，次日以 TBST 清洗处理，添加稀释的且经过辣根过氧化物酶所标记的山羊抗兔，在室温环境孵育 2 h 的时间，TBST清洗处理，随后滴加 ECL 发光液并且曝光，Image J 软件对各蛋白条带的灰度值展开分析。2.8 统计学方法 数据以 SPSS 20.0 软件展开统计和处理，数据以（sx）的形式表示，多组间的比较以单因素的方差分析，组间的对比以 t 检验，P0.05 反映有统计学的意义。3 结果 3.1 大鼠的神经功能受损情况 造模结束，模型组、各给药组大鼠的神经功能受损分值对比假手术组明显增加（P0.05）。给药结束，对比模型组，中药高剂量组、尼莫地平组相应分数均显著地下降，对比假手术组，模型组、各给药组相应分数仍明显地增高（P0.05）；中药高剂量组、尼莫地平组相应分数无统计学意义（P0.05），见表 1。表 1 大鼠的神经功能受损情况（sx）神经功能受损（分）组别 剂量（mgkg1）造模之后 干预之后 假手术组 0 0 模型组 5.330.39 4.580.29 中药低剂量组 10 5.410.50 4.190.33 中药高剂量组 30 5.380.40 3.010.20 尼莫地平组 8.0 5.390.45 2.770.16 3.2 大鼠的血清炎性指标情况 模型组、各给药组的血清 IL-1 与 IL-6 的检测水平对比假手术组均明显地增高（P0.05）。对比模型组，中药高剂量组、尼莫地平组的血清IL-1 与 IL-6 测定水平均显著地下降（P0.05），而中药高剂量组、尼莫地平组的炎症指标无统计学的意义（P0.05），见表 2。表 2 大鼠的血清炎性指标情况（sx）组别 剂量（mgkg1）IL-1（ng/L-1）IL-6（ng/L-1）假手术组 9.691.19 20.452.35 模型组 15.001.22 51.885.07 中药低剂量组 10 14.511.39 50.495.78 中药高剂量组 30 12.201.30 35.013.20 尼莫地平组 8.0 10.931.01 35.333.17 3.3 大鼠的脑组织病理情况 假手术组大鼠的脑皮质细胞、神经的细胞形态正常。模型组中有较多的神经元细胞质发生萎缩，细胞核有受损现象。对比模型组，中药低、高剂量组、尼莫地平组有较少数量的神经元细胞发生变性，且中药高剂量组、尼莫地平组的呈现完整的神经元的数量多于低剂量组。3.4 大鼠的神经元细胞的凋亡情况 假手术组的脑组织神经元结构较为清晰，有丰富尼氏小体存在。对比假手术组，模型组的脑神经元皱缩，尼氏小体萎缩。对比模型组，中药高剂量组与尼莫地平组尼氏小体数量增多。中医中药 2023 年第 15 期 每周文摘养老周刊1233.5 大鼠脑组织中的 Bcl-2 与 Bax 蛋白情况 对比假手术组，模型组、各给药组的脑组织Bcl-2 的表达明显降低（P0.05），Bax 的表达明显增高（P0.05）。对比模型组，中药低、高剂量组、尼莫地平组的脑组织的 Bcl-2 表达均明显地增高（P0.05），Bax 的表达均明显地下降（P0.05）。见图 1 和图 2。假手术组 模型组 中药低剂量组 中药高剂量组 尼莫地平组 图 1 免疫组化下大鼠脑组织的 Bcl-2 表达情况（200）假手术组 模型组 中药低剂量组 中药高剂量组 尼莫地平组 图 2 免疫组化下大鼠脑组织的 Bax 表达情况（200）3.6 大鼠脑组织的 Caspase-9、Cyt-C 及 p-Akt蛋白的表达 模型组的脑组织中Cyt-C 和 Caspase-9 蛋白的表达较之假手术组的明显增高（P0.05），p-Akt蛋白的表达较之假手术组的明显降低（P0.05）。对比模型组，中药低、高剂量组、尼莫地平组的Cyt-C 蛋白的表达水平明显降低（P0.05），p-Akt蛋白的表达明显增高（P0.05），中药高剂量组、尼莫地平组的 Caspase-9 蛋白的表达明显降低（P0.05），见表 3。表 3 大鼠脑组织蛋白的表达（sx）组别 剂量（mgkg1）Cyt-C Caspase-9 p-Akt 假手术组 0.840.15 0.910.09 1.760.20 模型组 2.330.21 1.590.11 0.900.10 中药低剂量组 10 1.620.13 1.510.10 1.300.14 中药高剂量组 30 1.540.12 0.980.13 1.560.16 尼莫地平组 8.0 1.270.09 0.870.08 1.530.18 4 讨论 既往研究黄芪桂枝五物汤在心肌的缺血再灌注损伤中具有明显治疗效果，此外，GLP-1R/Akt信号传导通路经研究证明参与诸多疾病的炎性反应过程，IL-6 在 CIRI 的炎性反应中发挥作用的参与作用。由此可预见，黄芪桂枝五物汤在干预 CIRI方面以及和GLP-1R/Akt信号传导通路之间存在关联性。资料中显示5，Bcl-2 能够通过对线粒体膜的通透性的影响而调控细胞的凋亡过程。在线粒体的凋亡过程中，释放入胞浆的 Cyt-C 科与凋亡诱导因子之间发生作用从而激活 Caspase，其中的Caspase-9 为较多细胞凋亡途径的关键因子之一。本次的研究可见，CIRI 的大鼠在高剂量的黄芪桂枝五物汤治疗过后的神经功能受损程度减轻，尼氏小体的数量得到一部分恢复，还能减轻炎症反应程度，能够维护大脑的神经单元，修复神经功能。本次的研究测定了脑组织内的凋亡有关蛋白情况，结果可见，黄芪桂枝五物汤的 CIRI 大鼠的脑组织中的 Cyt-C、Bax 蛋白以及 Caspase-9 蛋白的表达显著下降。通过本研究得出，黄芪桂枝五物汤可改良大鼠的 CIRI，抑制神经元的进一步凋亡，其作用的机制很可能和激活了GLP-1R/Akt信号传导通路有关，然本研究还需要更多的深入研究的佐证支持。参考文献 1 张瑞华，张静文，刘玲，等黄芪及其有效组分药理作用与临床应用现状J.陕西中医,2021,42(8):1138-1141.2 谢明,朱俊德,周璐,等.依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注损伤后氧化应激及凋亡的影响J.神经解剖学杂志,2021,37(4):7.3 邢家玮，陈红，余占海，等.黄芪多糖对荷腹水瘤小鼠氧化应激功能的影响J.中国临床药理学杂志，2022,38(9):970-973.4 付劭静,周延华,卑红喆,等.升麻素苷对脑缺血/再灌注大鼠脑损伤的保护作用及其机制研究J.中国临床神经科学,2021,29(6):617-624.5 张云，刘咏梅，陈恒文，等.mi-210 参与心肌缺血损伤修复机制及中药调控靶点分析J.中国中西医结合杂志,2020,40(1):125-128.