基于ITS序列和FTIR技术鉴定人参及其混伪品的研究.pdf

人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参(Panax ginseng C.A.Mey)为多年生草本植物袁生长环境多为阴冷潮湿遥 2020 版叶中国药典曳规定人参药材为五加科植物人参的干燥根和根茎袁是公认的道地药材袁药用价值极高袁是我们国家的重要保护性药材之一1遥 DNA 条形码是一种长度较短的DNA片段袁 该片段在不同的物种之间有着显著的差异遥DNA 条形码技术已经运用到了中药材鉴别的研究中袁该方法可有效进行物种的辨别袁为准确鉴定中药材及临床用药安全提供新的技术手段遥红外光谱已成为中药鉴别的有效方法袁为中药化学成分和结构的研究提供了一种重要方法遥如何快速地鉴定人参的混伪品是当前比较重要的研究课题2遥本文采用DNA 条形码鉴别人参真伪袁 同时结合FTIR 技术对不同生长年限人参进行鉴别袁为人参的快速分析鉴定提供可能遥1 材料与方法1.1 实验材料PCR 仪渊Applied Biosystems 美国冤曰研磨仪渊SPEXSamplePrep 公司冤曰高压灭菌锅渊ALP 日本冤曰电泳仪渊DYY-8C 北京冤曰凝胶成像系统渊G-Box EF2 UVP 美国冤曰IR 渊Affinity-1 日本岛津冤曰 电热干燥箱渊DHG-9015A 长沙仪器仪表厂冤曰中药粉碎机渊JY92-IIDN 上海净信冤遥人参根及根茎样品采自吉林省清河尧集安尧抚松尧黑龙江省尚志袁经通化师范学院医药学院张立秋副教授鉴定为五加科植物人参的干燥根及根茎袁 编号为1耀10 号遥 西洋参根及根茎样品采自吉林省集安尧抚松尧黑龙江尚志袁编号为I耀X 号遥 沙参尧桔梗样品购置药材市场袁编号为XI尧XII遥1.2 DNA 条形码鉴定用植物基因组DNA 提取试剂盒提取样品的总DNA3遥用75%的乙醇将药材表面进行擦拭消毒袁 称取40mg 左右袁 加入含有2 枚钢珠的2ml 的EP 管中袁放入球磨仪中研磨袁粉碎遥向粉碎的样品中加入裂解液袁使样品粉末中的细胞进行裂解袁让糖分尧脂肪及DNA 暴露出来遥 PCR 反应体系及反应程序如表1尧表2 所示遥56益静置8耀12 h袁用天根试剂盒提取袁然后以体积比氯仿颐异戊醇=24颐1 加入EP 管中袁混合袁12000rpm离心5min袁 使EP 管中的蛋白质和糖类进行分层袁吸出上清液袁加入氯仿颐异戊醇=1颐1袁混匀袁放入冰箱中15耀20 min遥将DNA 沉淀液加入吸附柱中袁12000rpm 离心1min袁多次离心袁使DNA 富集在柱内膜上袁将上清液加入离心管中袁用无水乙醇进行DNA 纯化袁挥干无水乙醇袁 加入缓冲液GD袁12000rpm 离心30s袁 再加入PW 冲洗袁12000rpm 离心30s袁弃去废液袁挥干无水乙醇遥重复操作步骤遥向EP 管中悬空加入ddH2O渊37益冤袁静置2min袁溶解袁空管离心2 min遥利用人参基因组中的高保守序列ITS 进行引物设计袁 引物序列的上游引物P1院5忆CGAAATCGGTAGACGCTACG袁引物序列的下游引物P2院5忆ATTTGAACTGGTGACACGAG袁采用该对引物序列对人参药材的样品DNA 进行PCR 检测遥经1.0%的琼脂糖凝胶EB 电泳检测PCR4产物袁如果条带单一且明亮说明PCR 成功将PCR 产物测序袁利用DNA(LynnonCorp.美国)软件对所得的测序结果进行正反向拼接和校对袁 将质量差的序列去除袁得到ITS 序列遥对实验所得序列和GenBank 下载的序列进行序列比对袁分析序列的保守区和特异区袁进而找到特异位点袁其中特异位点可以作为人参尧西洋参尧沙参和桔梗的鉴定位点遥 采用DNA 软件进行比对得到的比对序列袁导入MEGA5.0 软件进行建树袁选择K2P基于ITS 序列和FTIR 技术鉴定人参及其混伪品的研究孙仁爽1袁赵敏婧2袁谷伟强3渊1.通化师范学院医药学院袁通化 134001曰2.梅河口市食品药品检验检测中心袁梅河口 135000曰3.辽宁参中堂健康产业股份有限公司袁桓仁 117100冤摘要院为建立人参的快速鉴定体系袁确定常用的植物DNA 条形码是否适用于人参鉴定袁并探讨ITS 序列与FTIR 技术联用的可行性遥通过分析吉林产20 种植物的ITS 序列袁对人参尧西洋参等植物提取基因组DNA尧PCR 扩增并进行双向测序袁对其进行聚类分析袁并结合FTIR 技术袁基于峰形尧峰高尧峰强等不同年限人参进行分析遥 ITS 序列不仅能够将同种人参分类成簇袁同时也可形成不同分支且支持率均在70%以上遥 人参皂苷的特征吸收峰为1740 cm-1尧1518 cm-1尧1450 cm-1袁人参及其近缘种红外光谱的野指纹区冶能够反映该药材化学成分的专有特征遥 因此基于ITS 序列与FTIR 技术联用可以对人参进行快速分析鉴定遥关键词院ITS曰红外光谱曰人参曰混伪品曰鉴定基金项目院吉林省教育厅野十三五冶科学技术项目渊JJKH20170439KJ冤遥作者简介院孙仁爽袁男袁博士袁副教授袁研究方向院中药质量控制与评价遥DOI院10.19403/ki.1671-1521.2023.园缘.00圆8人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期参数遗传距离distance袁用NJ 法构建系统树袁系统树各分支的置信度用bootstrap test 检验遥表 1 PCR 反应体系渊25滋l冤表 2PCR 反应程序1.3 傅里叶红外光谱测定1.3.1 不同生长年限人参的红外光谱测定利用KBr 压片法袁将不同生长年限的人参5根及根茎研磨成细粉袁过200 目筛袁取2 mg 左右袁置于陶瓷研钵中与100 mg 的KBr 粉末混匀袁 采用抽真空的方法袁将粉末压制成片袁对人参进行扫描分析袁光谱扫描范围为400耀4000cm-1袁仪器分辨率4cm-1袁扫描速度10 kHz袁扫描次数为20 次袁得到相关红外光谱图遥1.3.2 红外光谱数据处理使用OMNIC 8.0 软件对原始光谱进行自动基线校正尧平滑尧纵坐标归一化以及二阶导数处理遥 使用Origin 9.0 软件作图袁SPSS 20.0 软件进行系统聚类遥2 结果2.1 人参与近缘种和混伪品的DNA 序列分析本实验从吉林清河尧集安和黑龙江尚志等主产地提取了22 份人参和西洋参以及混伪品的基因组DNA袁利用特异性的ITS 引物进行PCR6扩增袁得到22 条ITS 序列遥利用DNA 软件对22 份ITS 序列进行分析袁大多数序列长度在1000 bp 左右袁其中高覆盖区域的序列长度为800 bp 左右遥 将序列进行拼接和去除低质量区域序列之后袁 通过DNA 软件对拼接后的序列进行多序列分析和比对袁如图1耀5 所示袁发现人参与西洋参具有较高的同源性袁 长度均为600 bp左右袁 在BLAST 的结果与DNA 软件的多序列分析中袁均可发现其相似度高达99%袁根据亲缘度的不同袁可以将人参与人参聚集成簇袁西洋参与西洋参聚集成簇7遥 因此袁以ITS 序列进行鉴定测序袁建树之后可以将西洋参与人参区分开遥 通过西洋参和人参的ITS 序列进行碱基位点的比对袁发现有4 个位点具有一定的特异性袁根据这4 个特异性位点袁同样可以将人参与西洋参区分开遥2.2 进化树分析利用NJ 建树法袁 人参药材及其混伪品和近缘种编号试剂体积12伊Taq PCR Master Mix12.5 滋L2正向引物ITS2F渊2.5滋M冤1 滋L3反向引物ITS3R渊2.5滋M冤1 滋L4DNA 模板渊基因DNA 0.1滋g冤2 滋L5ddH2O8.5滋L孙仁爽等院基于ITS序列和FTIR技术鉴定人参及其混伪品的研究编号温度时间I94益5minII94益30sIII56益30sIV72益45sV72益10min图 1 种内种间变异图 2 人参 DNA 条形码序列9人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期样本共20 条序列袁 比对后平均长度为516 bp袁 平均GC 含量为60.0%袁 种内无变异位点袁 种内最大K2P距离为0遥 人参10 条序列袁比对后长度为619 bp袁平均GC 含量为60.2%曰西洋参10 条序列袁比对后长度为296 bp袁平均GC 含量为63.1%曰桔梗1 条序列袁比对后长度为604 bp袁 GC 含量为57.4%曰 沙参1 条序列袁比对后长度为635 bp袁GC 含量为64.1%遥 人参药材与各混伪品的ITS 序列种间最小K2P 距离为0.05袁种间平均K2P 距离为0.3遥从图6 可以看出袁人参聚类成为一簇袁西洋参聚类成为一簇袁之后人参与西洋参聚类成一大支袁虽然人参与西洋参在进化分支的亲缘距离很近袁但是从进化树上可知袁所有的人参会形成一簇袁与西洋参区别开来遥 同时袁我们发现沙参和桔梗同样也是各自成簇后与人参和西洋参形成距离较为接近的一支遥2.3 基于FTIR 鉴定不同生长年限人参图7 是不同生长年限人参的二阶导数红外光谱遥图 3 西洋参 DNA 条形码序列图 4 沙参 DNA 条形码序列图 5 桔梗 DNA 条形码序列图 6 人参尧西洋参尧桔梗尧沙参的进化树10人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期由图中可以看出袁1 年生人参在1742cm-1尧1643cm-1尧1408cm-1尧1150cm-1尧1059cm-1尧996cm-1处有强吸收峰袁5 年生人参在1659cm-1尧1150cm-1尧1059cm-1尧921cm-1处有强吸收峰袁10 年生人参在1749cm-1尧1627cm-1尧1529cm-1尧1318cm-1尧1248cm-1处有强吸收峰袁15 年人参在1848cm-1尧1749cm-1尧1637cm-1尧1525cm-1处有强吸收峰袁25 年人参在1745cm-1尧1623cm-1尧1449cm-1尧1373cm-1尧1318cm-1处有强吸收峰遥通过比较不同生长年限人参的SD-IR袁随着生长年限的增长袁在900cm-1耀1200cm-1位置处的强吸收峰逐渐变化到1700cm-1耀1400cm-1处袁 表明随着生长年限的增长袁糖类和糖苷类物质含量在不断积累遥 吸收峰峰值会随着年限的变化而改变袁随着生长年限的增长袁人参在生长代谢中代谢产物增多袁物质基础累积明显袁尤其是5 年以上人参袁物质基础明显多于5 年以下人参袁有效成分含量随着生长年限的增长逐渐增多遥 另外袁生长时间越长袁微量元素的累积越多遥图8 为不同生长年限人参的三阶导数光谱遥我们可以看出袁 不同年限人参的共有峰为院1742cm-1尧1160cm-1尧1078cm-1尧1661cm-1遥 3400cm-1耀3300cm-1为O-H 伸缩振动吸收峰曰2927cm-1耀2931cm-1为亚甲基C-H 反对称伸缩振动吸收峰曰1605cm-1及附近可能包含O-H 弯曲振动吸收峰和共轭羰基的伸缩振动吸收峰袁 以及芳香化合物骨架振动吸收峰曰1375cm-1和1450cm-1附近同时出现两个吸收峰分别对应甲基的对称弯曲振动吸收峰和反对称弯曲吸收峰曰950cm-1耀1300cm-1主要为各类C-O 伸缩振动吸收峰袁 不同产地人参的红外光谱主要差别就在这个区域遥 10 年生人参其吸收峰峰值一直处于较高位置袁较低年限的吸收峰峰值较低袁 有可能是物质的积累尚未达到峰值袁超过10 年的人参其峰值较低的原因可能是因为物质的衰减和降解造成的遥 1 年和5 年的人参在845cm-1无显著峰形袁15 年人参趴货和25 年野山参在845cm-1处有共有峰袁远 年和员园 年人参在825cm-1处有共有峰袁此处明显区别于1 年和5 年人参遥在实验测定中发现某样品在3821cm-1尧3851cm-1处有吸收峰袁 详见图9遥 两者红外光谱相似袁 但在1600cm-1耀1400cm-1处峰形不一致袁 因此须进一步分析遥通过文献可知袁农药残留多为含磷基团袁主要反映含氢基因(C-H尧O-H尧N-H尧P-H尧S-H 等键)的特征信息袁可以把4500cm-1耀3750 cm-1之间出现的吸收均视为含磷基团的吸收遥 为了区分更细微的差异袁因此对不同品质的人参进行三阶导数的计算遥图10 为人参的红外光谱图遥 发现人参在3733cm-1尧3611cm-1尧3581cm-1尧3505cm-1尧3433cm-1尧3348cm-1尧3260cm-1尧3065cm-1处有吸收峰遥 而此人参样品在3851cm-1尧3821cm-1尧3736cm-1尧3668cm-1尧3608cm-1尧3578cm-1尧3502cm-1尧3436cm-1尧3258cm-1尧3068cm-1处有吸收峰遥通过比较发现两者的共有峰在3733cm-1尧3611cm-1尧3505cm-1尧3065cm-1尧3348cm-1尧3433cm-1处袁 此样品在3733cm-1尧3608cm-1处的峰强度要高于其他样品人参袁在3668cm-1处有一尖峰袁而其他人参样品在此处没有吸收峰遥 此样品在3821cm-1尧3851cm-1处有吸收峰袁其他样品在此处无吸收峰袁初步判定此样品含有农药残留袁因此采用红外光谱法可以对农残进行初步检测遥图 7 不同年限人参的二阶导数红外光谱A院1 年 B院5 年 C院10 年 D院15 年 E院25 年11人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期图 8 不同年限人参的三阶导数红外光谱叠加图A院1 年 B院5 年 C院10 年 D院15 年 E院25 年图 9 含有农药残留人参的红外光谱A院含农残样品曰B院人参样品图 10 农残人参阶导数红外光谱A院含农残样品 B院人参样品12人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 缘 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期人参研究GINSENG RESEARCH2023 年第 5 期3 讨论本文采用ITS8序列对人参及其常见近缘药用植物尧 混伪品的PCR 扩增成功率和测序成功率均达100%袁通过K2P 遗传距离和NJ 树ITS 均可准确将人参与其他几种常见五加科药用植物相区分袁但也存在分子样品采集要求高尧检测时间较长的缺陷遥 FTIR 用样少尧操作简单尧快速袁可表征人参化学成分的综合信息袁人参红外光谱图具有较明显的野指纹冶特征9袁人参皂苷的特征吸收峰为1740cm-1尧1518cm-1尧1450cm-1袁人参及其近缘种红外光谱的野指纹区冶能够反映该药材化学成分的专有特征袁15 年人参趴货和25 年野山参在845cm-1处有共有峰袁远 年和员园 年人参在825cm-1处有共有峰袁 体现出不同年限人参的整体质量及差异遥 在实验中袁发现样品在3733cm-1尧3608cm-1处的峰强度要高于其他样品人参袁进行查阅比较后袁初步判定此样品含有农药残留袁因此采用红外光谱法可以对农残进行初步检测遥虽然不同人参的化学组成较为相近袁但因其相同物质的数量差异以及其他组成成分差异化都会导致红外光谱图中峰形和峰值的差异袁凭借这些红外光谱的野指纹冶特征可直接快速鉴别人参遥ITS 序列和FTIR 相结合袁 从分子水平和化学成分对人参及其近缘植物进行精确鉴定遥 以ITS 序列条形码为主要手段袁FTIR 为补充和修正袁两者的鉴定结果相互验证袁最终结果更为准确遥 为人参药材以及所有中药材质量监控提供了强有力的理论依据和技术支持袁在保证中药来源的准确性同时袁成功区分混伪品遥参 考 文 献1黄再强,朱琳,马小双袁等.人参属花类中药材三七花尧人参花尧西洋参花鉴别研究J.药物分析杂志,2020,40(12):2116-2125.2陈镜安,杨璐,李荣钊袁等.基于 ITS2 的竹节参及其近缘物种和混伪品鉴定评估J.中草药,2018,49(15):3672-3680.3林凤越,曹辉,任欢欢袁等.基于 ITS2 序列的人参及同属易混品西洋参种子的分子鉴定 J.中草药,2019,50(09):2188-2193.4孙涛,周林,滕少袁等.双重实时荧光 PCR 快速鉴别人参和西洋参 J.世界科学技术-中医药现代化,2022,24(08):2986-2994.5范帅帅,高晗,田伟袁等.人参尧红参尧西洋参 3 种配方颗粒的傅里叶变换红外光谱快速鉴别方法J.药物评价研究,2018,41(12):2242-2247.6蒋超,罗宇琴,袁媛袁等.多重位点特异性 PCR 鉴别人参尧三七尧西洋参掺杂J.中国中药杂志,2017,42(07):1319-1323.7刘丽,肖炳燚,罗晖明袁等.多重 PCR 方法同时鉴别人参尧西洋参尧三七J.药物分析杂志,2016,36(04):668-677.8张亚光,陈丹青,朱国琴袁等.ITS2 和 psbA-trnH序列对人参属常见药用植物的 DNA 分子鉴定研究J.沈阳药科大学学报,2021,38(05):523-529.9王灵灵,黄亚伟,戚淑叶袁等.基于主根横断面近红外光谱的西洋参和人参鉴别研究J.光谱学与光谱分析,2012,32(04):925-929.13