微生物的营养与生长.ppt

第第 三三 章章微微 生生 物物 的的 营营 养养 与与 生生 长长5/13/20241.主要内容：微生物所需营养物质及其生理作用微生物的营养类型及特点微生物对营养物质的吸收方式、特点微生物生长的概念及其测定微生物的生长曲线及在食品工业中应用环境因子对微生物生长繁殖的影响微生物的培养基、培养方法与设备5/13/20242.第第 一一 节节微生物的营养5/13/20243.一、微生物细胞的化学成分 水：70-90%干物质：有机元素：C（50%）、H、O（30%）、N（10-13%）有机物：蛋白质、糖、脂类、核酸、维生素及其降解产物 无机元素：常量元素：P、K、Ca、Mg、Fe、l 痕量元素：Cu、Zn、B、Mol无机物：参与有机物组成 l 单 独 存 在 于 细 胞 质 内 以 无 机 盐 的 形 式存在。5/13/20244.二、微生物所需营养物质及其生理作用二、微生物所需营养物质及其生理作用 营养物质：为生物自身合成、产生能量 以及在代谢中起调节作用的物质。营养：机体吸收、利用营养物质的过程。根据营养成分，营养物质分为六种类型：C源、N源、能源、生长因素、无机盐、水分。5/13/20245.1、碳源：构成细胞物质及代谢产物中碳素来源的物质。作用：构成碳架来源与能源,约占细胞干物质的50%。种类：有机含碳化合物：糖、醇类、有机酸类。碳氢化合物：CH4、石油及其产物无机含碳化合物：CO2、碳酸盐类、CN5/13/20246.2、氮源：、氮源：作用：构成细胞物质及代谢产物中氮素来源的物质。主要用于组成菌体的含氮物质，少数可作为能量（硝化细菌）。种类：N2NH3固氮菌。有机氮源：蛋白质（迟效氮源）、氨基酸无机氮源：NO3、NH4等。（速效氮源）5/13/20247.氨基酸自养型微生物：利用非AA类的简单氮源（尿素、NH4+、NO3-）自行合成所需要的一切AA。氨基酸异养型微生物：须从外界吸收现成的AA作为氮源的微生物。不论哪种状态的氮化物，都要首先转化成NH3再与有机酸结合转化成氨基酸。5/13/20248.3、矿素种类：大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Fe.95%微量元素：Zn、Mo、功能：1、构成细胞的各种成分如：Mg：叶绿素的辅因子；Ca：蛋白酶、淀粉酶的辅因子；构成芽孢。2、调节细胞的渗透压、pH、氧化还原电位3、能源：Fe、S等作为自养微生物的能源。5/13/20249.4、生长因子；微生物生长必不可少的微量有机物。如维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶。、维生素：多为酶的组分如硫胺素（B1）、核黄素（B2，FMN的前体）；烟酸（NAD的前体）；吡哆醇（B6，转氨酶辅基）泛酸、生物素。、氨基酸：微生物合成氨基酸的能力随种类而不同。如大肠杆菌可合成全部；鼠伤寒沙门氏菌Tyr；肠膜明串珠菌合成氨基酸的能力弱，需补充19种氨基酸。、碱基：核酸和辅酶的成分。5/13/202410.5、水：占细胞鲜重的7090%功能：构成细胞组分生化反应的介质溶剂热导体维持细胞渗透压水分：自由水：能够被利用的水束缚水：与溶质结合构成细胞结构的水，不能被利用进行生命活动。5/13/202411.水分活度水分活度：在相同温度和压力下溶质的蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比：aw=P溶质/P0微生物需要的aw值为0.630.99。细菌、酵母菌霉菌盐细菌耐旱真菌5/13/202412.三、微生物的营养类型及特点划分依据：碳源、供氢体、能源根据碳源和供氢体的不同可分为有机营养型无机营养型；根据能源的不同可分为化能营养型光能营养型。5/13/202413.1、光能无机营养型能源：光。具光合色素；叶绿素（蓝细菌）或菌绿素（光合细菌），光合磷酸化产生ATP。供氢体：还原性无机化合物碳源：CO2。例1：蓝细菌：H2O+CO2（CH2O）+O2供氢体碳源产氧型光合作用5/13/202414.例2：绿硫细菌、紫硫细菌：H2S+CO2（CH2O）+H2O+SNaS2O3+CO2+H2O（CH2O）+Na2SO4+H2SO4碳源供氢体细胞内或外积累硫，非产氧型光合作用VanNiel通式：CO2+H2ACH2O+H2O+A5/13/202415.2、光能有机营养型、光能有机营养型能源：光碳源：二氧化碳或简单有机化合物供氢体：有机化合物例：红螺菌：CO2+异丙醇CH2O+丙酮+H2O可利用净化有机废水，生产SCP。5/13/202416.3、化能无机营养型、化能无机营养型氢细菌、铁细菌、硫化细菌、硝化细菌等能源：还原态无机物氧化：NH3、NO2、H2、H2S、S、S2O3-、Fe2+等。碳源：CO2、CO32+供氢体：无机化合物例1：氧化亚铁硫杆菌：Fe2+Fe3+e+E5/13/202417.例2：可用于细菌冶金：浸贫、尾矿，回收重金属如Cu原理：S+O2+FeSO4H2SO4+E氧化硫硫杆菌H2SO4+O2+FeSO4Fe2(SO4)3+H2O氧化铁硫杆菌CuS(辉铜矿)+Fe2(SO4)3CuSO4+FeSO4+SCuSO4+Fe(废铁)Cu+FeSO4例3：氢细菌：H2+1/2O2H2O+56.2kcal例4：铁细菌：2Fe+1/4O2+2H+2Fe+1/2H2O+10.6kcalpH=01kcalpH=75/13/202418.4、化能异养型：、化能异养型：碳源、能源、供氢体均为有机物必须以适宜的有机物为养料，大多数微生物为此类。分腐生、寄生、专性寄生、兼性寄生四种。上述四大类型划分不是绝对的，有许多中间类型：红螺菌：光能异养：有光，无氧时。化能异养：无光，无氧时。5/13/202419.生物型动物微生物植物异养自养营养类型化能异养型化能异养型光能异养型化能自养型光能自养型光能自养型碳源糖、脂、糖、醇、有机酸、蛋白质及降解产物有机碳化物CO2二 氧 化 碳、碳酸盐等二氧化碳、碳酸盐等氮源蛋白质及其降解产物蛋白质及降解物、有机无机氮化物无机氮化物无机氮化物能源与碳源同有机碳源或光能氧化无机物或利用光能光能生长因子维生素部分需要不需要不需要无机元素无机盐无机盐无机盐无机盐微生物和动物、植物营养物质的比较5/13/202420.5/13/202421.四、微生物对营养物质的吸收方式、特点四、微生物对营养物质的吸收方式、特点1、简单扩散简单扩散(simplediffusion)，一种物理扩散。动力：细胞膜两侧的浓度差。能量：不需。载体：不需。例：CO2、气体、水、小分子脂溶性、水溶性物质。大肠杆菌对Na+的吸收。5/13/202422.2、促进扩散（、促进扩散（facilitateddiffusion）特点：不耗能，浓度差为动力，顺浓度梯度。有特异性，需载体参与。例：真核微生物运送糖。分别有葡萄糖载体、亮氨酸载体、异亮氨酸载体。5/13/202423.3、主动运输（主动运输（activetransport）特点：需能，可逆浓度梯度运送物质需要载体运送前后底物无化学变化例：大肠杆菌运送乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、氨基酸、K+（使膜内K+=300膜外K+5/13/202424.4、基团转位（grouptranslocation）特点：需能、逆浓度梯度，需载体，被运输底物运送前后发生化学变化。例：磷酸转移酶系统（PTS）对营养的吸收。1、系统组成：E1,E3：非特异性，细胞质内E2：诱导酶，特异性。如E2GluHpr（heatstableprotein）2、过程：PEP+HprP-Hpr+丙酮酸（胞内，E1）糖+E2糖-E2（膜上）P-Hpr+糖-E2糖-P+Hpr+E2(膜内侧，糖-P进入质)磷酸化后，细胞膜对底物不再渗透，防止流出胞外。5/13/202425.5/13/202426.第第 二二 节节微微 生生 物物 的的 生生 长长5/13/202427.主要内容：微生物的个体生长微生物群体生长环境因素对微生物生长的影响及其原理5/13/202428.一、微生物生长的概念及其测定一、微生物生长的概念及其测定 1、生长生长 单细胞生物有机体细胞组分和结构在量的方面的增加。繁殖繁殖 单细胞生物细胞数目的增多；多细胞生物通过形成有性、无性孢子使个体数目增多.发育发育 从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、从量变到质变的发展过程，这一过程称为发育。个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖 5/13/202429.2、微生物计数法：、微生物计数法：、直接计数计数器计数：血球计数板 细菌计数板 比例计数：菌液+血液（血液细胞数恒定，男400万500万/mL,女350400万/mL。电子自动计数器：比浊法：浓度与吸光度成正比。细胞干重：菌丝过滤 测体积 5/13/202430.二、微生物生长的测定群体生长 直接计数:血球计数板法5/13/202431.、间接计数：平皿菌落计数5/13/202432.、测定物质含量 测定含氮量：蛋白质=N%6.25 测定含碳量：生理指标：磷、DNA、RNA、ATP和 N乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的测定。5/13/202433.3、微生物个体生长的测定：、微生物个体生长的测定：、电子显微镜观察、同步生长：培养基中的所有细菌处于细胞分裂的相同阶段。获取方法：、诱导法：控制温度、营养、或加抑制剂使细胞同时开始生长。、选择法：滤膜过滤，密度梯度离心，硝酸纤维素培养，等。意义；使群体中所有细胞尽可能处于同样的细胞生长和分裂周期中。从群体研究水平研究个体细胞的变化。5/13/202434.二二、微微生生物物的的生生长长曲曲线线及及在在食食品品工工业业中中应应用用微生物群体生长细菌纯培养群体生长规律将少量单细胞纯培养接种到恒定容积的液体培养基中培养，定时取样计数，以培养时间为横坐标，细菌数的对数为纵坐标所绘制出的曲线，叫群体生长曲线。实际上是繁殖曲线。从群体研究上反映个体的状况。5/13/202435.细菌纯培养群体生长规律1、延迟期（lag phase）2、对数生长期（log phase,expotential phase）3、稳定期（stationary phase）4、衰亡期（declined phase）5/13/202436.1、延迟期延迟期（lag phase）：特点：数目几乎不增加，或稍有减少，但细胞体积增长较快，代谢活跃，细胞内物质增加，对外界抗性下降。原因：调整代谢以适应新的环境条件，合成诱导酶，积累必要的中间产物等 影响延迟期长短的因素：菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期 培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延迟期比在合成培养基上生长时间短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延迟期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。缩短延迟期的措施：增加接种量 采用最适菌龄 加入某些成分 选育繁殖快的菌种5/13/202437.2、对数生长期（、对数生长期（log phase,expotential phase）：）：细菌特点：数以几何级数增加，A：增长速率常数R值最大，代时短；B：细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均衡；C；酶系活跃，代谢旺盛。代时：（generation time，G）单个细胞完成一次分裂 所需时间。设n=分裂的代数；t0时细胞数x;t1时细胞数y.则 G=（t1t0）/n Y=2nX G=（T1T0）/3.3(lgy-lgx)5/13/202438.意义：是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察的好材料。作为发酵种子接种，可以缩短延迟期。发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度。食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期。影响代时的因素：A：菌种；B：营养成分；C：营养物浓度（影响速率与总生长量）D：培养温度。5/13/202439.3、稳定期（、稳定期（stationary phase）：）：现象：积累代谢产物，生长维持，细胞总量最大。原因：A：营养尤其是生长因子消耗；B：营养物比例失调（如C/N比）；C：酸，醇、毒素等有害代谢产物积累；D：pH、氧化还原电位等物化条件越来越不适宜5/13/202440.特点：A：增长速率常数R值为0，即死亡细胞数=新生 的细胞数；B：细胞中开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等；C：开始形成芽孢，合成抗生素等次生代谢产物。工业应用：获取大量菌体或代谢产物。可以通过补 料或调节pH值延长此时期。5/13/202441.4、衰亡期（、衰亡期（declined phase）生长出现负增长，即新生细胞数死亡的细胞数，现象：形态多样，如菌体畸形等；有的微生物 出现自溶；有的微生物开始产生或放出对 人类有用的抗生素等次生代谢物。原因：生活环境越来越不利。研究的意义：预测达到的菌数，了解不同时期 的差别。上述曲线适合无分枝微生物。丝状微生物液体搅拌培养时的生长繁殖类似细菌。5/13/202442.三、连续培养连续培养（continuousculture)又叫开放培养，是相对分批培养（batchculture）或叫密闭培养而言的。所谓分批培养是指将微生物接种于恒定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。其生长类似于纯培养曲线。5/13/202443.连续培养（continuous culture）又叫开放培养，当微生物以单批培养的方式培养到指数期时，一方面以一定的速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌，利用溢流的方式，以同样的流速流出培养物，延长对数期。这样培养物就达到动态平衡。优点：取消时间间隙，缩短周期，便于自控，产品均一。缺点：易杂菌污染，菌种退化5/13/202444.实现连续培养的方法l恒浊法：其原理是根据培养容器内微生物的生长密度，用光电系统来检测培养液的浊度，并进行控制的培养方法。l恒化法：使培养液流速保持不变，微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的培养方法，主要用于实验室的科学研究中5/13/202445.四、环境因素对微生物生长的影响几个概念：消毒：用较温和的理化因素，部分杀灭物体表面或内部微生物细胞尤其是杀灭病原微生物而对被消毒的物体基本无害的措施。防腐：就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。一旦抑制因素解除则微生物可恢复生长。灭菌：用较剧烈的理化因素使任何物体内外的一切微生物不可逆的丧失其生长繁殖能力的措施商业无菌：指食品经杀菌处理后，按照规定的微生物学检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或仅能检验出极少的非病原微生物，且它们在食品保藏过程中不可能生长繁殖。5/13/202446.5/13/202447.1、物理因素：、温度：每种微生物细胞都有一定的生长温度范围。在此温度范围内温度越高生长速率越快。温度过低则原生质膜处于凝固状态，酶活被抑制，生命活动不能进行；过高则蛋白质、核酸、和其他成分不可逆变性失活，菌体死亡。5/13/202448.微生物的生长温度范围：最低 最适 最高 专性嗜冷微生物 0 15 20兼性嗜冷微生物 0 25-30 40嗜中温微生物 10 20-40 60嗜热性微生物 30 45-60 90嗜高温微生物 80-1005/13/202449.原理：嗜冷微生物：酶活对高温敏感，30-40酶活丧失，膜上不饱和脂肪酸含量高。嗜热微生物：酶抗热，含高浓度多胺 核酸GC含量高 膜含饱和直链脂肪酸 合成速度快，弥补大分子的破坏。5/13/202450.高温消毒与灭菌致死温度：单位时间（通常10min）内杀死微生物的最低温度 意义：决定灭菌温度方法：干热灭菌：灼烧；烘烤（160-170 2hr）湿热灭菌：巴斯德消毒法（小于100，15-30min）间隙灭菌：常压蒸汽反复灭菌。高压蒸汽灭菌：0.1Mpa(1.05kg/cm2)；121 15-30min。5/13/202451.低温冷藏冷冻：造就不利微生物生长的环境，保存菌种和食品等。如速冻食品：-18快速冷冻。采取速冻速融方法避免大的冰晶对食品细胞的伤害。*利用反复冻融法制备细胞裂解液。5/13/202452.、超声波：利用空化作用破坏细胞。.氧浓度：5/13/202453.、辐射:（nm)1364008001000宇宙射线xuv可见光红外线大于1000nm无害；红外800-1000nm:光合细菌的能源；5/13/202454.可见光：400-800nm藻类的能源；强、长时间的可见光照射可造成光氧化作用：光线被色素吸收在有氧时酶和其他敏感成分失活。胡萝卜素在膜上阻止光到达细胞内，可保护细胞。UV非电离辐射。136-400nm。尤其在250-280nm的杀菌能力最强。原理：形成胸腺嘧啶二聚体，干扰核酸复制。（可以光复活：二聚体被光复活酶结合的复合物在可见光下获光能解离成单体。）O2：O3（臭氧）O2+O 新生态氧，杀菌。光氧化作用：H2O+O2 H2O25/13/202455.电离辐射：x、射线，穿透力强，使环境和细胞中水分子吸收能量电离，产生自由基，与敏感分子反应使失活。低剂量引起生长和变异，高剂量引起死亡。H2O H2O+e-H+OH H2O H+OH-O2+e-O2 O22-H2O使SH氧化，酶变性。射线：强杀菌，强穿透力，可用于消毒。小剂量（500伦琴）可促进生长或诱发变异，大于10万伦琴杀伤力强5/13/202456.5/13/202457.2、化学因子、化学因子、pH值：一般生长范围在49间。少数种类在小于2，大于9生长。真菌pH范围广，如镰孢酶211。细菌：中性偏中性。例外：嗜酸性细菌如氧化硫硫杆菌15；嗜碱性细菌如巴氏芽孢杆菌11.211.9。通过控制H+进出细胞保持细胞的近中性环境。在培养基配制或发酵中通过调节酸、碱、加缓冲液使培养基保持恒定。5/13/202458.、水分水活度（aw）：细胞自由水与总水的比值aw=P/P0=自由水/（自由水+结合水）、渗透压、渗透压 盐0.85%左右，糖9%左右。过高、过低引起质壁分离或吸胀耐高渗微生物的筛选。5/13/202459.、化学药剂无选择性，多外用。重金属盐：a.与带阴电荷的菌体蛋白结合使变性；PrtSH +Hg2+Pro-S-Hg-S+2H+b.蛋白质沉淀剂；c.与代谢物相螯合如HgCl2,AgNO3,CuSO4,汞溴红有机化合物：醇、醛、酚：破坏细胞膜、细胞壁，使蛋白质变性。RNH2+HCHOR-NH2CH2O环氧乙烷+R-SH R-S-CH2CH2OH氧化剂；高锰酸钾、过氧化氢、使SH变成SS。卤素：放出新生态氧，氧化杀菌。HClO HCl+O5/13/202460.抗生素与化学治疗剂5/13/202461.培养基组分 营养物浓度5/13/202462.第第 三三 节节微微 生生 物物 的的 培培 养养 基基培培 养方法与设备养方法与设备5/13/202463.概念：由人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质。5/13/202464.一、培养基配制原则1.根据微生物的营养要求配制2.注意各营养元素的配比浓度过低不能满足所需，过高则抑制生长。各营养物间的浓度配比影响到产物的形成和积累。如C/N高：适合积累细胞；C/N低，适合积累代谢产物3.渗透压5/13/202465.4.pH值：不同类型微生物的最适pH范围不同。同一菌种最适生长pH和最适积累代谢产物pH可能不同。菌种代谢过程中产生代谢产物改变pH。通过加入缓冲剂、碳酸盐或直接添加酸碱调节。5/13/202466.5.Eh值（氧化还原电位）好氧性微生物：+0.1厌氧性微生物：0.1好氧呼吸+0.1发酵或厌氧呼吸提高氧分压的方法：通气，加入氧化剂降低氧分压的方法：隔氧，通氮气，CO2，加入还原剂5/13/202467.二、培养基的类型：1、按来源分：天然培养基：利用生物的组织、器官、细胞或抽提物为原料制成的培养基。合成培养基：由化学成分完全已知的物质配制成的培养基。半合成培养基：部分天然材料+部分化学试剂。5/13/202468.2、根据物理状态：有无凝固凝固剂及含量（1）液体培养基：成分基本溶于水、无明显固形物营养成分分布均匀。适合生理代谢及基本理论研究，及现代大规模发酵生产。（2）固体培养基：A、固体物料+营养、盐等：如麸皮、马铃薯培养基、传统酿造法酿酒、醋等B、液体培养基+凝固剂。在实验室广泛用于微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。（3）半固体培养基：少量凝固剂(0.2-1%)+液体培养基。用于观察微生物的动力或保藏菌种。5/13/202469.凝固剂的条件：不被大多数微生物利用在微生物生长温度范围内保持固态耐高温透明度好黏着力强方便价廉。5/13/202470.常用凝固剂:琼脂从红藻中提取的胶状物，由琼脂糖、琼脂凝胶组成。明胶动物蛋白。硅胶硅酸钠、硅酸钾盐酸、硫酸中和凝结成的胶体。不含有机物，适合分离培养自养微生物。其他：天然固体培养基。马铃薯、麸皮、米等5/13/202471.两种凝固剂比较：琼脂明胶常用浓度1.5-2%5-12%熔点9628凝固点4520pH微酸酸微生物利用大多数不能许多能5/13/202472.3、根据营养成分是否丰富和“完全”分：基本培养基：是含有最低营养成分的合成培养基，无生长因素只能满足某些菌株的野生型生长。完全培养基：在MM中加入富含生长因子的天然物质如蛋白胨、酵母膏满足各种营养缺陷型菌株的生长补充培养基：在MM上有针对性的加入某一种或某几种成分以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基。5/13/202473.4、按特殊用途：增殖培养基：在普通培养基中加入某微生物特殊喜好的营养物质，用以增加此微生物的繁殖速度，淘汰其他微生物。加富培养基：普通培养基中加入血清、组织液等培养营养要求苛刻的微生物如枝原体、病原微生物。选择培养基：利用微生物特殊营养要求或对某化合物的特殊敏感性设计的选择性促进某微生物生长的培养基。5/13/202474.鉴别培养基：普通培养基中加入某化学药剂对特定种群进行鉴定。有的培养基具有选择和鉴别双重作用，如乳糖胆盐培养基：胆盐抑制肠道菌以外的微生物（选择性），乳糖和指示剂区别肠道发酵菌和肠道致病菌。5/13/202475.三、微生物的培养方法：三、微生物的培养方法：1.微生物纯培养的分离方法纯培养（pureculture）：实验室条件下从一个细胞或群体繁殖得到的后代。分离方法：、稀释倒平皿法：、平皿划线分离：平板连续划线法：平行线划线法分区划线法：、单细胞挑取法：、利用选择性培养基：酚、染料、抗生素、加热、接种敏感动物（病原菌）5/13/202476.微生物纯培养的分离方法实验室条件下从一个细胞或群体繁殖得到的后代。l分离方法：、稀释倒平皿法：5/13/202477.5/13/202478.、平皿划线分离：平皿涂抹法：平板连续划线法：平行线划线法分区划线法：5/13/202479.、平皿划线分离：平板连续划线法：平行线划线法分区划线法：5/13/202480.、平皿划线分离：平板连续划线法：平行线划线法分区划线法：5/13/202481.、平皿划线分离：平板连续划线法：平行线划线法分区划线法：5/13/202482.2、单细胞挑取法：3、利用选择性培养基：酚、染料、抗生素、加热、接种敏感动物（病原菌）5/13/202483.