微生物实验课.ppt

微生物与免疫学实验（三）内内 容容血清学反应（二）：血清学反应（二）：l（三）免疫标记技术（录（三）免疫标记技术（录像）像）操作：操作：ELISA 示教：免疫荧光（示教：免疫荧光（C301）细菌学总论：细菌学总论：l细菌基本形态、特殊结构细菌基本形态、特殊结构l操作：革兰染色操作：革兰染色（三）免疫标记技术三）免疫标记技术 将已知抗体标记上显示性物质，通过检测标记物，将已知抗体标记上显示性物质，通过检测标记物，反映反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有：常用的标记物有：酶、荧光素、放射性同位素、胶体金、生物素、电子致酶、荧光素、放射性同位素、胶体金、生物素、电子致 密物等。密物等。免疫荧光技术（荧光抗体技术）免疫荧光技术（荧光抗体技术）【原理】是在免疫学、生物化学及显微镜术进展的基础上发展起来的一项技术，具有特异、敏感、快速的特点。将荧光色素（常用异硫氰基荧光黄，简称FITC）与特异性抗体（或抗原）以共价键基团牢固结合，但不影响该血清抗体的免疫特性。这种荧光标记的抗原抗体复合物，可通过荧光灯源中产生的紫外光或蓝紫光激发产生荧光，而从荧光显微镜加以观察。【方法】主要有直接法和间接法。主要有直接法和间接法。免疫荧光 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）（Enzyme linked lmmunosorbent Aassay）【原理】把抗原抗体的免疫反应和酶（主要有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）的高效催化作用有机地结合起来，并仍保持其免疫和酶的活性。结合在抗原抗体复合物上的酶在遇到相应的底物时，可以催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色的物质。颜色反应的深浅与抗体或抗原的量成正比。【方法】主要有间接法和双抗体夹心法主要有间接法和双抗体夹心法 常用底物：邻苯二胺（OPD）,四甲基联苯胺（TMB）用于测定抗体用于测定抗体ELISA：双抗体夹心法双抗体夹心法-用于测定抗原用于测定抗原 ELISA：双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HCG（操作）（操作）l器材：器材：1个小杯个小杯/1人，标本人，标本1、标本、标本2 A、B、C液液（H2O2、TMB、HRP标记抗HCG二抗）l方法：小杯内加标本两滴方法：小杯内加标本两滴 甩干、水洗三次甩干、水洗三次 加一滴加一滴C液（红色）液（红色）甩干、水洗三次甩干、水洗三次 加加A、B液各一滴液各一滴 置于白纸上，观察结果置于白纸上，观察结果l结果判断：蓝色为结果判断：蓝色为+*瓶盖不能盖错，小杯用后扔进杂物盆！瓶盖不能盖错，小杯用后扔进杂物盆！5min5min示教：荧光标记技术l老鼠肝细胞印片+SLE病人血清（含有抗核抗体，一抗）+荧光标记的抗人的抗核抗体的抗体（二抗）l荧光显微镜（C-301）下观察：黄绿荧光标记的老鼠肝脏细胞核细细 菌菌 总总 论（一）论（一）革兰染色法：革兰染色法：1884年年Gram创建，是细菌学中最创建，是细菌学中最为经典的染色法。为经典的染色法。意义：意义：对细菌鉴别、选择抗菌药物、研究细菌致病对细菌鉴别、选择抗菌药物、研究细菌致病性等有重要意义。性等有重要意义。原理：原理：与细菌细胞壁有关，尚未完全阐明。与细菌细胞壁有关，尚未完全阐明。细菌的基本形态细菌的基本形态 细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，细菌是一类具有细胞壁的单细胞微生物，形体微小，一般以微米（形体微小，一般以微米（m m）作为测量单位。）作为测量单位。细菌按其外型可分为球菌、杆菌、螺型菌三细菌按其外型可分为球菌、杆菌、螺型菌三大类。不同种类的细菌大小不一，大多数球大类。不同种类的细菌大小不一，大多数球菌直径约菌直径约1 1 m m，杆菌长，杆菌长2 2 5 5 m m，宽，宽0.30.3 1 1 m m。球菌球菌(coccus)葡萄球菌葡萄球菌G G淋病奈瑟氏菌淋病奈瑟氏菌GG杆菌杆菌(bacillus)大肠杆菌G-螺形菌螺形菌(spiral bacterium)弧菌：一个弯曲弧菌：一个弯曲 螺菌：多个弯曲螺菌：多个弯曲霍乱弧菌空肠弯曲菌细菌的特殊结构细菌的特殊结构荚膜、鞭毛、芽胞、荚膜、鞭毛、芽胞、菌毛荚膜（荚膜（Capsule）荚膜：细菌细胞壁外包裹的一层较厚、粘性、胶冻样的物质，普通染色不易着色。主要功能：1.与细菌的毒力有关，抗吞噬、抗消化 2.潴留水分，抗干燥一般在机体内和营养丰富的培养基中形成 肺炎双球菌鞭毛（鞭毛（flagellum）多种细菌（大多数杆菌，少数球菌，全部弧菌和螺菌）菌体上有细长而弯曲的丝状物，称为鞭毛芽胞（芽胞（spore）n芽胞（spore）：是细菌躲避恶劣环境，维持生存而处于代谢相对静止的休眠体，并非细菌的繁殖体，折光性强，不易着色。能产生芽孢的细菌为G+菌。菌毛（pilus）l菌毛(pilus)：菌体表面遍布，细、短、直、硬。分普通菌毛（粘附作用、致病性）、性菌毛（传递DNA）。电镜可见。革兰染色革兰染色操作步骤操作步骤 【涂片涂片】取载玻片取载玻片 接种环取混合菌液接种环取混合菌液1-21-2环涂片（直径环涂片（直径约约1cm1cm）自然干燥自然干燥 固定（通过火焰三次）固定（通过火焰三次）【染色染色】结晶紫结晶紫1min 1min 水洗水洗 碘液碘液1min 1min 水洗水洗 酒精脱色酒精脱色30S 30S 水洗水洗 稀释复红稀释复红1min 1min 水洗水洗 吸水纸印干吸水纸印干 油镜观察油镜观察 *注意无菌操作！注意无菌操作！有菌玻片放在水池旁玻片缸内有菌玻片放在水池旁玻片缸内!作业：作业：1.作图细菌基本形态、特殊结构 2.ELISA：原理、方法、结果、结论 3.革兰染色：方法、结果（图）作图请注意大小比例作图请注意大小比例此课件下载可自行编辑修改，供参考！此课件下载可自行编辑修改，供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！