DB21∕T 2536-2015 副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25362015 副结核分支杆菌实时荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis 2015-10-15 发布 2015-12-15 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25362015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴斌、万超、屈菲。DB21/T 25362015 1 副结核分枝杆菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subssp.paratuberculosis）实时荧光PCR检测方法。本标准适用于副结核分枝杆菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值：达到阈值的循环数（Cycle Threshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（Taq DNA polymerase）RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）4 原理 采用TaqMan方法，比对副结核分枝杆菌基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料 DB21/T 25362015 2 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1 试剂 5.1.1 PBS：配制方法见附录 A.1。5.1.2 Triton-X-100 5.1.3 Trizol 裂解液。5.1.4 三氯甲烷。5.1.5 柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液：配制方法见附录 A.2。5.1.6 75%乙醇：配制方法见附录 A.3。5.1.7 异丙醇（-20 预冷）。5.1.8 4%氢氧化钠：配制方法见附录 A.4。5.1.9 4%硫酸：配制方法见附录 A.5。5.1.10 其他试剂：荧光 PCR 反应缓冲液：含 50mmol/L KCl：配制方法见附录 A.6,10mmol/L Tris-HCl（pH8.3）：配制方法见附录 A.7,2.5 mmol/L MgCl2：配制方法见附录 A.8,5%二甲基亚砜（DMSO）：配制方法见附录 A.9，5%甘油：配制方法见附录 A.10。可采用等效商品化试剂。5.1.11 dNTP Mixture(各 10 mM)、EX-Taq酶(5 U/L)，UDG 酶。5.1.12 引物：以副结核 F57 基因序列合成一对特异性引物：上游引物 5-GTCAGCGGCGGTCCAG-3，下游引物 5-GCAGCTCCAGATCGTCATTC-3，TaqMan 探针（FAM）5-ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC-3（BHQ-1）均配制成 10 umol/L，-20 保存。5.2 仪器与耗材 5.2.1 接种棒 5.2.2 荧光 PCR 检测仪。5.2.3 高速台式冷冻离心机（最高可达 13 000 r/min）。5.2.4 微量移液器：0.5 L10 L，5 L20 L，20 L200 L，100 L1000 L。5.2.5 组织匀浆器。5.2.6 冰箱(2-8)。5.2.7 微量可调移液器。5.2.8 离心管。5.2.9 微量带芯吸嘴（10L，100L，1000L）。5.3 仪器与耗材 6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守 SN/T 1193 的有关规定。7 操作步骤 7.1 样本的采集与处理 7.1.1 培养物：直接取液体培养基培养的菌液，对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量菌样，放到 0.01mol/L pH7.6PBS 中，振荡混匀形成悬浮菌液。DB21/T 25362015 3 7.1.2 血样：用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清。7.1.3 奶样：无菌采集奶液于灭菌的容器中。7.1.4 粪便：选取新鲜粪便（腹泻或或有粘液、血液、粘膜的粪便），盛于灭菌容器中。7.1.5 组织：选取有明显病变的肠段，回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。8 操作方法 8.1 样品前处理 8.1.1 血样、培养物（菌液）前处理：取 2ml 全血样品或培养物（菌液），15000g 离心 10min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分震荡，15000g 离心 10min，弃上清；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.2 奶样前处理：取 10ml 奶液，加 100L Triton-X-100,震荡混匀，15000g 离心 10 min，弃上清；加 1ml0.01mol/L pH7.6PBS,充分振荡混匀，15000g 离心 10 min，弃上清；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.3 粪样前处理：取粪样 2g，按 1：5 的比例加入 4%硫酸溶液，充分振荡混匀，室温静置 0.5h；取上层约 3ml 液体，5000g 离心 1min，取上清，15000g 离心 10 min，弃上清；加等量 0.01mol/L pH7.6PBS,充分振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g 离心 10 min，弃上清，重复本步骤一次；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.1.4 组织样品前处理：取适量组织样品（剔除脂肪，被膜），剪碎，按 1：5 的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液，充分研磨；加等量 4%氢氧化钠溶液，继续研磨 5-10min，使组织液化；充分振荡混匀，75室温静置 0.5h；取上层约 3ml 液体，5000g 离心 1min，取上清，15000g 离心 10 min，弃上清；加等量 0.01mol/L pH7.6PBS,充分振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g 离心 10 min，弃上清，重复本步骤一次；收集沉淀物，继续进行核酸提取。8.2 核酸提取 自上述完成前处理的样品中加入100l DNA提取液，充分振荡混匀，55温浴30min，98加热10min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取上清。粪便样品进行以下步骤：加3倍体积异丙醇，颠倒混匀，放置5min；4 15000g离心10min，弃上清，加3倍体积70%乙醇，振荡洗涤；4 15000g离心10min，弃上清，室温干燥5min；加入50l无DNA酶、无RNA酶水，混匀、溶解核酸，直接用于PCR。也可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3 实时荧光 PCR 反应 8.3.1 反应体系 8.3.2 用漩涡混匀器将表 1 中各组分混匀后瞬间离心，备用。荧光 PCR 反应体系（25L,核酸模板2L），10PCR 缓冲液【10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl】2.5L，2.5mmol/L MgCL2 5L，10 mmol/L DNTP 2L,上下游引物 10mol/L 1L，探针 5mol/L 1L，1UTaq 酶。需配制的荧光 PCR 预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后再每个 PCR 光学管中分装 20L。8.3.3 反应参数 DB21/T 25362015 4 将7.3.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下：第一阶段，预变性 95 3 min；第二阶段，95 3 s、60 33 s，40 个循环；荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。9.2.2 阳性对照的 Ct 值应28，并出现特定的扩增曲线。9.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无副结核分枝杆菌核酸。9.3.2 阳性判定 Ct值30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在副结核分枝杆菌核酸。DB21/T 25362015 5 A A 附 录 A(规范性附录)试剂的配制 A.1 0.01 mol/L pH7.6 PBS 先配制A液、B液。A液(0.2mol/L NaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)：称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO412 H20)71.6g，或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO42H20)35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mL A液和87mL B液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4。A.2 柠檬酸钠一磷酸缓冲液 先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(O.2molL磷酸二氢钠溶液)：称取磷酸二氢钠(NaH2PO42H20)15.61g，加双蒸水溶解，定容至500mL。B液(O.2molL磷酸氢二钠溶液)：称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H20)35.82 g，加双蒸水溶解，定容至500mL。分别量取51mL A液、49mL B液，混合即成100mL pH6.8磷酸缓冲液。称取2.84g柠檬酸钠(Na3C6H5O2H2O)，加入100mL pH6.8磷酸缓冲液中，充分溶解。采用(121士2)0.1MPa，15min高压灭菌后贮存于4。A.3 75乙醇溶液 量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100ml。室温保存。A.4 4氢氧化钠溶液 称取8g氢氧化钠，加入双蒸水，充分溶解,定容至200ml。室温贮存。A.5 4硫酸溶液 98%的浓硫酸10ml，加入双蒸水，定容至450ml。室温贮存。A.6 50mmol/L 氯化钾（50mmol/L KCl）称取3.73g氯化钾，加入双蒸水，充分溶解，定容至1000ml。室温贮存。A.7 10mmol/L Tris-HCl 称取 0.3028g Tris，用双蒸水溶解，然后用 HCl 调节 pH 至 8.0，最后定容到 250mL，室温贮存。A.8 2.5 mmol/L MgCl2 称取0.059g MgCl2，用双蒸水溶解，定容到250mL，室温贮存。DB21/T 25362015 6 A.9 5二甲基亚砜 量取5ml二甲基亚砜，加入双蒸水中，充分溶解，定容至100ml。室温贮存。A.6 10甘油溶液 量取10ml甘油，加入双蒸水中，混匀，定容至100ml。室温贮存。_