汉黄芩素抗非小细胞肺癌细胞的作用研究.pdf

Studyof1药理毒理47Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)中药与临床汉黄芩素抗非小细胞肺癌细胞的作用研究李静阳，向丽”，余鹏，张迪，孟宪丽？摘要 目的：探讨汉黄苓素对H1299与A549非小细胞肺癌细胞的作用，以期为汉黄苓素抗肺癌作用研究提供理论依据。方法：采用CCK-8法检测汉黄苓素对H1299和A549细胞活力的影响，确定汉黄苓素后续实验给药剂量；采用平板集落形成实验研究汉黄苓素对H1299和A549细胞增殖的抑制作用；细胞划痕实验考察汉黄苓素对H1299和A549细胞迁移能力的影响；流式细胞术检测汉黄苓素对H1299和A549细胞周期及凋亡的影响。结果：汉黄苓素可抑制H1299和A549细胞的生长，对H1299和A549细胞集落形成有显著抑制作用（p0.01），表明汉黄苓素能有效抑制H1299和A549细胞的生长和增殖。汉黄苓素能够抑制H1299和A549细胞的迁移能力，且随着给药浓度和给药时间的增加，细胞的迁移率减小。流式细胞术检测发现汉黄苓素能将H1299和A549细胞周期阻滞在G0/G1期且能促进H1299和A549细胞凋亡。结论：汉黄苓素能够抑制H1299和A549细胞的生长、增殖和迁移，阻滞细胞周期在GO/G1期并可促进肺癌细胞凋亡。关键词 汉黄芩素；非小细胞肺癌；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 16 7 4-9 2 6 X(2023)04-009-06the effect of wogonin on non-small cell lung cancer cells/Ler cells/LI Jing-yang,XIANG Li,YU Peng,ZHANG Di,MENG Xian-li/(1.School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan;2.Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan)Abstract Objective:To investigate the pharmacodynamic effects of wogonin on H1299 and A549 cells,in order to provide theoreticalbasis for the anti-lung cancer effects of wogonin.Method:The CCK-8 method was used to detect the effect of wogonin on the cell viabilityof H1299 and A549 cells to determine the safe concentration range of wogonin and the dose for subsequent experiments.The inhibitoryeffect of wogonin on the proliferation of H1299 and A549 cells was further investigated by plate colony formation assay.The effects ofwogonin on the migration of H1299 and A549 cells were studied by cell scratch assay.The effects of wogonin on the cellcycle and apoptosisof H1299 and A549 cells were detected by flow cytometry.Result:Wogonin inhibited the growth of H1299 and A549 cells.In addition,wogonin significantly inhibited the colony formation of H1299 and A549 cells(p 0.01),suggesting that wogonin could inhibit the growthand proliferation of H1299 and A549 cells.Wogonin inhibited the migration of H1299 and A549 cells,and the mobility of cells decreasedwith increasing concentration and administration time.Wogonin arrested H1299 and A549 cell cycles in G0/G1 phase.Wogonin can promoteapoptosis of H1299 and A549 cells.Conclusion:Wogonin can inhibit the growth,proliferation and migration of H1299 and A549 cells,arrest the cell cycle in GO/Gl phase and promote cell apoptosis.Key words Wogonin;non-small cell lung cancer;cell proliferation;cell migration;apoptosis基金项目 国家自然科学基金青年基金（8 19 0 39 0 2）；四川省科技创新苗子工程（2 0 2 10 7 6）；成都市卫生和计划生育委员会临床药学重点学科（成卫计函(2018187号)作者单位 1.成都中医药大学药学院，四川成都6 11137；2.成都中医药大学中医药创新研究院，四川成都611137作者简介】李静阳（19 9 7-），女，在读硕士研究生，主要从事中药药效与毒理研究Tel:18382308196Email:通讯作者 孟宪丽（19 6 4-），女，教授，主要从事中药药效与毒理研究Tel:13540488646Email:mx1999 收稿日期 2 0 2 3-0 4-0 4由于人口老龄化、环境污染、吸烟人数增加等原因，肺癌已成为2 0 2 0 年癌症死亡的主要病因，约占所有癌症的11.4%和死亡人数的18%-2 。根据不同分化程度和形态特征，肺癌可分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌患者的人数占所有肺癌患者总数的8 0%-8 5%3。尽管手术治疗、化疗、放疗以及靶向治疗取得了重大进展，但肺癌患者的存活率仍然较低，形式依然严峻4。肺癌患者的低生存率主要是由于其有较高的转移率和复发率，且耐药严重5。因此，有必要深人研究肺癌的发病机制，探索新的药物和治疗方法。中药黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)，性苦、寒，归肺、胃、胆、大肠经，具有清热燥湿，48PharmacyhineseMateriaMedica2023;14(4)中药与临床泻火解毒，止血，安胎的功效。其含有大量抗肿瘤活性的黄酮类化合物，如黄芩素7 、黄芩苷8-0 、汉黄芩素.12 ，等等。汉黄芩素（Wogonin）为中药黄芩的有效成分之一，是一种不溶于水、只溶于有机溶剂的黄色针状结晶物，具有抗炎13.14、抗肿瘤15.16等多种药理活性。近年来，国内外对于汉黄芩素治疗肺癌的研究不断深人，其报道也日益增多。近期研究显示，汉黄芩素能够通过多种途径抑制肺癌细胞的活性8 。其中，汉黄芩素可通过调控miRNA-135b-3p靶向SIX4抑制A549细胞上皮间质转化，进而抑制肿瘤细胞的转移并降低肺肿瘤细胞的耐药性17。汉黄芩素可通过调控E-cadherin、Vi me n t i n 蛋白等转移标志蛋白，从而抑制IL-6诱导的A549细胞侵袭。同时，汉黄芩素能抑制转移相关转录因子Snail、T w i s t 的表达，进而抑制A549细胞转移18)。此外，汉黄芩素可通过可调控JAK/STAT信号通路，下调Bcl-2和survivin蛋白等促进肺癌细胞凋亡(1 9 。汉黄芩素在治疗非小细胞肺癌中具有很大潜力，探究其治疗非小细胞肺癌的作用意义深远。本实验以汉黄芩素为研究对象，通过体外实验研究汉黄芩素对非小细胞肺癌细胞系H1299和A549在细胞生长、增殖、迁移、细胞周期和凋亡中的作用。1实验材料1.1实验药物汉黄芩素（货号：DST191023-025，乐美天生物技术有限公司），化学结构式见图1；顺铂（货号：P4394-25MG，Si g m a 生物有限公司）OHOH图1汉黄芩素化学结构式1.2细胞株人非小细胞肺癌细胞系A549购于上海复祥生物科技有限公司；人非小细胞肺癌细胞系H1299购于上海中乔新舟生物科技有限公司。1.3实验试剂澳洲胎牛血清青（货号：2 17 39 6 9 RP，美国Gibco公司）、RPMI-1640培养基（货号：C11875500BT，美国Gibco公司）、0.2 5%胰酶-EDTA（货号：PYG0067，武汉博士德生物科技有限公司）；青霉素-链霉素（货号：SV30010，美国HyClone公司）；CCK-8细胞增殖-毒性试剂盒（货号：AR1160）、0.5%结晶紫水溶液（货号：BC-DL-011-100mL，南京生航生物技术有限公司）、细胞周期检测试剂盒（货号：E-CK-A351，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、细胞凋亡检测试剂盒（货号：40 30 2 ES60，上海Yeasen生物科技有限公司）1.4实验设备CO,细胞培养箱（型号：CCL-170B-8，新加坡思高科技有限公司）；生物安全柜（型号：SE-RIESA2，美国Thermo公司）；倒置显微镜（型号：DMil，德国莱卡公司）；全自动双荧光细胞计数器（型号：CellometerK2，深圳市达科生物科技股份有限公司）；水浴锅（型号：DZKW-S-4，上海跃进有限公司）、全波长多功能酶标仪（型号：Spectra-MaxiD5，美国TherrmoFisher Scientific公司）、L-530低速离心机（型号：5510 110 32 7，湘仪实验室仪器开发有限公司）、流式细胞仪（型号：FACS-CantoTMII，美国BD公司）2实验方法2.1CCK-8法测定汉黄芩素给药后H1299和A549细胞的增殖活力取对数生长期的H1299和A549细胞制成单细胞悬液，以8 10 4cellsmL细胞每孔的密度接种于9 6 孔板上，每孔体积为2 0 0 L。并于细胞培养箱中进行培养8 h。待细胞贴壁后，加入不同浓度汉黄芩素（1、10、40、6 0、8 0、10 0、12 0、150、2 0 0 M）给药处理，继续培养2 4h。培养结束后加人CCK-8溶液，继续培养1.5小时。用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度。根据吸光度计算细胞的存活率及汉黄芩素的半数抑制浓度ICso值，细胞存活率=（A45o实验孔-A45o空白孔）（A450对照孔-A45o空白孔）100%。2.2细胞平板集落形成测定将H1299和A549细胞以50 0 个/孔的密度接种于6孔板中，用不同浓度汉黄芩素（42.5、8 5、17 0M）处理H1299细胞，汉黄芩素（40、8 0、16 0M）处理A549细胞，给药2 4h后，更换为完全培养基。使用10 gmL顺铂（CDDP）作为阳性药。完全培养基每3天更换一次，12 天后，取出6 孔板，弃去培养基，用PBS清洗2 次，之后每孔加人10 0%甲醇1mL固定细胞10 min后弃去甲醇。每孔中加人0.5%结晶紫水溶液1mL，染色2 0 min弃去结晶紫溶液，用PBS清洗至洗涤液无色，倒置空干。待细胞集落染色空干后，观察计数。克隆形成率（%）=细胞克隆数/接种细胞数10 0%。Pharmacy and Chinese Materia Medica2023;14(4)中药与临床49：2.3细胞划痕实验在细胞6 孔板背后用马克笔沿直尺画直线，直线横穿过孔，每孔至少穿过5条线。取对数生长期的H1299和A549细胞以110 cellsmL的密度均匀接种于6 孔板中，每孔2 mL。置于细胞培养箱内培养，等细胞密度达到8 0%以上后进行实验。使用2 0 0 L无菌枪头沿着标记线的垂直方向划线，注意枪头笔直不倾斜。用PBS轻柔洗去刮下的悬浮细胞，再加人不同浓度汉黄芩素进行给药处理。分别于划痕后0、2 4、48小时于显微镜下观察各孔细胞愈合情况并拍照。划痕愈合率（%）=（初始划痕宽度-指定时间划痕宽度）初始划痕宽度10 0%。2.4细胞周期检测取对数生长期的细胞，将细胞以110 cellsmL-1的密度均匀接种于6 孔板中，每孔2 mL。待各孔细胞融合至8 0%，给不同浓度汉黄芩素处理2 4h。之后用PBS洗涤细胞1次，以同样的方法收集并调整细胞浓度为110 cellsmLl。取该浓度下1mL单细胞悬液用预冷的PBS洗2 次后，弃上清，加人50 0 LPBS重悬细胞，并逐滴缓慢加入10 0%已预冷乙醇（-2 0）1.5mL，边加边晃动使乙醇终浓度为7 5%，4固定过夜。染色前用PBS洗去固定液，加人50 0 LPI/RNaseA染色工作液，室温避光染色30 min。流式细胞仪上机检测，记录激发波长为48 8 nm处红色荧光。2.5细胞凋亡检测取对数生长期的H1299和A549细胞，将细胞以110 cellsmL的密度均匀接种于6 孔板中，每孔2 mL。待各孔细胞融合至8 0%，给药处理2 4h。收集经汉黄芩素给药2 4h后的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2 次。加入10 0 L1xBindingBuffer重悬细胞。避光加人5LAnnexinV-FITC和10 LPI StainingSolution，轻轻混匀，避光、室温反应15min。加人40 0 L1BindingBuffer，混合均匀后放置冰上，样品在1小时内用流式细胞仪检测。FITC绿色荧光在FITC通道检测，PI的红色荧光在PE通道检测。2.6统计方法各组实验数据均采用SPSS21.0软件进行分析，最后数据资料以均数标准差（xs）的形式表示。数据符合正态分布时，组间差异采用ANOVA分析，数据不符合正态分布时选用非参数检验分析。（当p0.05时，则差异不具有统计学意义）。采用GraphPadPrism6.0软件进行作图。3结果3.1汉黄芩素对H1299和A549细胞生长抑制的影响采用CCK-8法检测汉黄芩素对H1299和A549细胞的生长抑制影响。与空白组相比，汉黄芩素给药后对H1299和A549细胞生长均有抑制作用，且呈剂量依赖性。由图2 和图3分析得出，8 5M和8 0 M汉黄芩素分别对H1299和A549细胞生长的抑制率达到50%以上，汉黄芩素对H1299细胞的ICso值为8 5.2 7M，对A549细胞的ICso值为40 M，最终确定汉黄芩素对H1299细胞的药物浓度为：42.5、8 5、17 0M；对A549细胞的药物浓度为：40、8 0、16 0 M。以此浓度开展后续实验研究。150-H1299150H1299*100-10050-50-0豆0.00.51.01.52.02.5logWogoninconcentrationWogonin(uM)图2 不同浓度汉黄芩素对H1299细胞增殖活力的影响（n=6）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p0.001150-A5491507A549100-10050-50-0-400.00.51.01.52.02.5Wogonin(M)logWogoninconcentration图3不同浓度汉黄芩素对A549细胞增殖活力的影响（n=6）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p0.0013.2汉黄芩素对H1299和A549细胞增殖的影响采用平板集落形成实验观察汉黄芩素对单个H1299和A549细胞增殖能力的影响。结果如图4所示，经不同浓度汉黄芩素处理的H1299和A549细胞克隆形成能力与对照组相比明显减弱，且克隆体积也显著小于对照组。集落形成测定实验表明汉黄芩素能够显著抑制H1299和A549细胞的增殖，结合CCK-8和集落形成实验结果，表明了汉黄芩素能够抑制非小细胞肺癌细胞的生长和增殖。Wogonin(M)ControlCDDP42.585170H1299150760A549工40100-408016020-50-6tsVntrolCDDPWogonin(uM)Wogonin(aM)图4汉黄芩素对H1299和A549细胞增殖抑制的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p 0.0 0 150.Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)中药与临床3.3汉黄芩素对H1299和A549细胞迁移能力的影响采用细胞划痕实验检测汉黄芩素对H1299和A549细胞迁移能力的影响。给予H1299和A549细胞不同浓度的汉黄芩素2 4h和48 h后，与空白组进行比较，结果表明划痕宽度随着汉黄芩素给药处理浓度和给药时间的增大而增宽，划痕两侧的细胞密度逐渐减少，划痕愈合率也逐渐减小（如图5和图6），汉黄芩素能够显著抑制H1299细胞的迁移，并且呈现浓度和时间依赖性。ControlCDDPWogonin-42WoRomIn-85Wogonin-1zo2448h60-H129924h1007H129948h8040-*60401*20*家*2010070St170CDDPControlCDDPWogonin(uM)ControlWogonin(M)图5汉黄芩素对H1299细胞迁移的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p0.001ControlCDDPWogonio-4oWogonin-8oWogonin-16024h48h207A54924h30A54948h15-一201010500160CDDPCDDPControlWogonin(u.M)ControlWogonin(M)图6 汉黄芩素对A549细胞迁移的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p 0.0 0 13.4汉黄芩素对H1299和A549细胞周期的影响采用流式细胞术检测H1299和A549细胞周期各阶段比例，结果如图7 和图8 所示，顺铂给药后H1299和A549细胞处于S期的比例增加，处于G2期细胞的比例减少，提示顺铂能够将H1299和A549细胞阻滞与S期。而汉黄芩素给药后处于S期和G2期的细胞比例减少，处于G0/G1期的细胞所占比例增多，提示汉黄芩素能够将H1299和A549细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞DNA合成受阻导致细胞无法顺利进入下一个细胞周期，从而抑制细胞生长。ControlCDDPWogonin-42.5uMWogonfn-85pMWogonin-17ouMH12991507一G2SGO/G110050-CDDPWogonin(M)图7 汉黄芩素对H1299细胞周期的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p 0.0 0 1ControlCCDPWogonto-4ouMWogonin-8opiMWogouin-160MA5491507G2S一GO/G1100-50-Wogonin(M)图8 汉黄芩素对A549细胞周期的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p0.0013.5汉黄芩素对H1299细胞凋亡的影响细胞凋亡是细胞的基本特征之一，在细胞发育、组织内正常细胞群稳定、机体防御和免疫、肿瘤的发生进展等方面有重要作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧，当发生细胞凋亡时细胞膜发生变化，PS从细胞膜内侧外翻至外表面。膜联蛋白AnnexinV能与PS高度亲和，故可使用荧光素FITC标记AnnexinV作为探针，进行凋亡细胞和活细胞的鉴别。然而，坏死细胞的PS蛋白也会外翻，AnnexinV无法区分凋亡细胞和坏死细胞。采用能与细胞内DNA结合而不透过完整细胞膜的核酸染料碘化丙啶（PI）与AnnexinV-FITC共同检测，可以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡和坏死细胞。51Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(4)中药与临床本实验采用不同浓度汉黄芩素对H1299和A549细胞处理2 4h后，用AnnexinV-FITC/PI双染，通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果表明汉黄芩素能够促进H1299和A549细胞凋亡，其凋亡率随着药物浓度增加而上升（见图9 和图10）ControlCDDPWogonin-42.5pMWogonin-ssMWogonin-17opMAnaexiuV-FTTC15-H1299(%)opussondody105A2.5Wogonin(M)图9 汉黄芩素对H1299细胞凋亡的影响（n=3）注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p 0.0 0 1二ControlCDDPWogonin-4oyiMWogonin-sopMWogonin-16ojNonexinV-FIT40-A549(/)oneassondody3020*1040Wogonin(uM)图10 汉黄芩素对A549细胞凋亡的影响（n=3)注：与空白对照组比较，*p0.05，*p 0.0 1，*p0.0014讨论肺癌是目前临床治疗的一个重要问题，在治疗过程中如何抑制肺癌细胞的增殖，这对患者的预后有重要意义2 0.2 1。在本实验研究中，首先通过CCK-8法探究汉黄芩素对非小细胞肺癌细胞H1299和A549细胞的生长抑制作用，实验数据显示汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的增殖，且有剂量依赖趋势，并根据实验结果确定后续实验汉黄芩素给药剂量：H1299（低：42.5M，中：8 5M，高：170M），A 549（低：40 M，中：8 0 M，高：160M）。接着通过平板集落形成实验也表明汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的增殖，其结果与CCK-8法检测实验结果基本一致，这些结果进一步证明了汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的增殖。此外，本实验探究了汉黄芩素对H1299和A549细胞的迁移作用，通过细胞划痕实验发现汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞愈合，且随着汉黄芩素给药浓度和给药时间的增加，细胞愈合率依次降低，说明汉黄芩素能够抑制H1299和A549细胞的迁移。细胞周期是细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束的整个过程，是细胞生命活动的基本过程，其分为细胞间期：G0/G1期、S期和G2期，细胞分裂期：M期两个阶段2-2 4。细胞间期进行细胞DNA合成，分裂期进行细胞分裂，肿瘤的生长与细胞周期调控有着紧密联系，大量文献研究表明将肿瘤细胞周期阻滞在细胞间期，尤其是阻滞在GO/G1期可发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用2 5-2 7 。本实验流式细胞术检测结果表明汉黄芩素可以将H1299和A549细胞周期阻滞在GO/G1期，有效抑制细胞DNA合成，进而抑制细胞生长。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，由多蛋白严格控制的一个主动过程，对于维持机体生长发育有着重要意义2 8-2 9 。细胞凋亡与肿瘤治疗研究有着密切关系，促进肿瘤细胞调亡与抑制肿瘤细胞增殖相辅相成，对患者治疗及预后有积极作用30-31。本实验通过对汉黄芩素处理后的H1299和A549细胞进行AnnexinV-FITC/PI双染，再通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平，结果表明随着汉黄芩素给药浓度的增加，H1299和A549细胞凋亡率也随之增加，这与汉黄芩素可诱导肺癌细胞凋亡等文献结果吻合32 。综上所述，汉黄芩素可以抑制H1299和A549细胞增殖和迁移，使细胞周期阻滞在GO/G1期，并诱导H1299和A549细胞调亡，这为开发汉黄芩素进一步治疗肺癌提供了药效理论依据。参考文献1 Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global Cancer Statistics2020:Globocan estimates of Incidence and Mortality World-wide for 36 Cancers in 185 Countries J.CA:a cancer journalfor clinicians,2021,71(3):209-49.2 Xue Q,Lv L,Wan C,et al.Expression and Clinical Role ofSmall Glutamine-Rich Tetratricopeptide Repeat(Tpr)-Con-taining Protein Alpha(Sgta)as a Novel Cell Cycle Protein inNSCLC JJ.Journal of cancer research and clinical oncology,2013,139(9):1539-49.3 T.F.Lou,D.Sethuraman,P.Dospoy,et 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