淋巴细胞亚群检测的临床应用-山西省人民医院.ppt

淋巴细胞亚群检测的临床应用淋巴细胞亚群检测的临床应用检验科检验科 梁红萍梁红萍2012-52012-5主要内容主要内容l为何要检测为何要检测“淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群”？l何时检测？何时检测？l如何解读？如何解读？l如何应用？（肿瘤、自身免疫、感染、儿科）如何应用？（肿瘤、自身免疫、感染、儿科）l案例分析案例分析l标本要求标本要求为何要检测为何要检测“淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群”？关键词：免疫关键词：免疫（拉丁文，免（拉丁文，免)免疫基本功能免疫基本功能:识别自己与非己-动态平衡 免疫系统：免疫系统：由免疫器官、免疫细胞及免疫分子组成，遍布全身、相互制约的 网络免疫相关疾病：免疫相关疾病：应答过高:变态反应(过敏性疾病,四型)不平衡:应答不足:感染、肿瘤、放射病、血液病、免疫缺损症 自身组织应答：自身免疫疾病（SLE、类风湿性关节炎）免疫应答类型免疫应答类型：二种 1、固有性免疫应答：识别多种病原体的共有成分（多糖），非特异性应答。机械性防御机制：机械性防御机制：皮肤、粘膜（口腔、呼吸道、消化道、泌尿）；体液免疫机制：体液免疫机制：补体系统；急性相蛋白（CRP等）；吞噬细胞（单核-巨噬细胞、粒细胞）；NK（肿瘤、病毒感染细胞、异源）；ADCC。感染早期数分或96h内执行防卫。2、适应性免疫应答：识别特异的病原体，特异性应答 T及B淋巴细胞，感染后4-5天对识别的病原体进行杀伤清除，发生在固有性免疫应答之后。B淋巴细胞针对细胞外的细菌病原体，引发吞噬作用，介导体液免疫 T淋巴细胞抵抗细胞内复制的病原体（病毒、结核菌），介导细胞免疫T细胞与B细胞系统的特性(共性：产生记忆细胞）T细胞系统（cell mediated mmunity,CMI)B细胞系统(humoral immunity)-介导细胞免疫，自身分化效应细胞-来源于胸腺-巨噬细胞处理后的抗原识别-分两大类：细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells,CTL)和调节T细胞（regulatory T cells,T reg),Treg=辅助性T细胞Th+抑制性T细胞Ts-Th:识别特异性抗原,正反馈免疫调节；Th=Th1+Th2+Th0-Ts:负反馈免疫调节；-CTL：杀伤表达特异抗原的靶细胞，如病毒、结核菌等感染的靶细胞或肿瘤细胞-T细胞活化先天性免疫系统的防御机制，如巨噬细胞-Th1(IFN-)-介导体液免疫，经Ab执行免疫功能-来源于骨髓-识别天然蛋白质抗原-增殖时需要T辅助细胞Th的刺激-分化成浆细胞-合成抗原特异性抗体-发挥抗独特型抗体的免疫调节-防御细胞外病原体(细菌)，以抗体介导，促使巨噬细胞和补体系统活化，ADCC-Th2(IL-4,IL-5)何时检测何时检测“淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群”？评价免疫功能（血常规、评价免疫功能（血常规、IgIg、补体、淋巴细胞亚群）、补体、淋巴细胞亚群）术前；术前；新生儿筛查（原发性免疫缺陷病）；新生儿筛查（原发性免疫缺陷病）；体检体检诊断免疫相关疾病（如诊断免疫相关疾病（如HIVHIV初筛有反应时）初筛有反应时）免疫治疗疗效观察免疫治疗疗效观察出现免疫功能低下症状时检测出现免疫功能低下症状时检测1 1、经常感到疲劳；经常感到疲劳；2 2、经常感冒；、经常感冒；3 3、伤口容易感染；、伤口容易感染；4 4、肠胃功能下降；自身保护能力差；、肠胃功能下降；自身保护能力差；5 5、易受到传染病的侵袭；、易受到传染病的侵袭；6 6、精神萎靡；、精神萎靡；7 7、易昏睡、易昏睡 8 8、爱做梦（恶梦）、爱做梦（恶梦）9 9、身心憔悴、身心憔悴 Sheep erythrocyte rosetter(E-rosettes)for T-cellsSurface immunoglobulin(sIg)for B-cellsSurface immunoglobulin(sIg)for B-cells流式细胞仪检测原理流式细胞仪检测原理流式细胞术的特点z流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术z流式细胞术=细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术+激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术z测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞z可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量z具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况z高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.20.5um)z既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上流式细胞术的应用使得过去应用E-玫瑰花结试验或EAC-花环试验检测T或B淋巴细胞成为历史应用抗CD（cluster of differentiation,CD)单抗将免疫细胞区分得更细、更科学、更能描述免疫细胞的机能状态由于流式细胞仪将静态的、显微镜下肉眼观察改为动态的、计算机信号处理，因此，在流式细胞仪上T细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数200个细胞成为几秒钟内计数上万个，因此，结果更真实、更具有统计意义。淋巴细胞亚群流式术的基本内容淋巴细胞亚群流式术的基本内容荧光染料标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，结合多色荧光分析，即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。淋巴细胞为CD45阳性，颗粒度较低的一群细胞z淋巴细胞主要分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和 NK细胞（CD16+56+）zT淋巴细胞又分为zT helper/T inducer（CD3+CD4+），(ThCD29+/Ti CD45RA+)、zT suppressor/T cytotoxic（CD3+CD8+）(TsCD28-/Tc CD28+)如何解读如何解读“淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群”报告报告解读原则：解读原则：1、综合判断，CD4+%、CD8+%、CD4+/CD8+：初步评估机体免疫状态，快速便利2、结合血常规结果，同时关注百分比和绝对数3、当CD4+/CD8+比例倒置时，一定要确认是CD4+细胞绝对数降低，还是CD8+细胞绝对数增加所致，两种情况的临床意义不同4、（CD3+%）+（CD19+%）+（CD16/56+%）=100%5%，如相差过于悬殊，临床具有一定提示意义。研究表明感染和血液肿瘤最易出现等式严重偏离5、NK细胞：天然免疫系统的一个重要组成部分，约占外周血单核细胞的15-30%，可通过非MHC性限制性途径识别并在多数情况下杀伤被病毒感染细胞。HIV感染时，与CD4+T细胞计数相关 NK细胞的抗肿瘤免疫比T细胞的抗肿瘤免疫更重要 不明原因流产患者：NK细胞数量与早孕组相比明显减少6、避免将细胞表面标志和功能间的联系绝对化，原因：6.1 CD4+T细胞又分为Th1和Th2,Th1主要介导细胞免疫和炎症反应，涉及抗病毒、抗胞内寄生菌和移植物排斥；Th2主要参于B细胞增殖、抗体产生和超敏反应性疾病。同时两者互为抑制，它们在免疫调节中互相拮抗，起着十分微妙的作用6.2己有研究表明确实存在CD4+杀伤T细胞，因而不能说CD4+T细胞一定发挥上调作用 解读原则：解读原则：7、随着现代免疫学的发展，对T细胞表面标志及其生物学作用的分子机制有了更深入的认识。鉴于T细胞功能亚群的传统分类已不能反映真实情况，有必要淡化所谓辅助性T细胞/抑制性T细胞等的概念。实际上，无论是CD4+T细胞或CD8+T细胞，均包括可发挥正、负调节（即辅助或抑制）作用的功能亚群。8、与时俱进解读原则：解读原则：临 床 应 用 原发性免疫缺陷病：原发性免疫缺陷病：原发性免疫缺陷病：原发性免疫缺陷病：患者血液淋巴细胞免疫表型可出现多种异常。如患者血液淋巴细胞免疫表型可出现多种异常。如严重联合免疫缺陷病（严重联合免疫缺陷病（SCIDSCID）时，）时，T T淋巴细胞缺乏；淋巴细胞缺乏；X X连锁无丙种球蛋连锁无丙种球蛋白血症，白血症，B B淋巴细胞数量缺乏或减少。淋巴细胞数量缺乏或减少。HIVHIVHIVHIV感染和感染和感染和感染和AIDSAIDSAIDSAIDS：CD4+TCD4+T淋巴细胞是淋巴细胞是HIVHIV感染的主要细胞。感染的主要细胞。CD4+TCD4+T淋巴淋巴细胞计数用于评价细胞计数用于评价HIVHIV感染后免疫系统受损的程度。感染后免疫系统受损的程度。CD4+TCD4+TCD4+TCD4+T细胞细胞细胞细胞：下降：下降 CD8+TCD8+T细胞：细胞：HIVHIV感染早期增高，发展为感染早期增高，发展为AIDSAIDS时下降时下降 NKNK细胞：降低，特别是疾病晚期细胞：降低，特别是疾病晚期免疫缺陷病 淋巴细胞数量减低，部分患者表现出与淋巴细胞数量减低，部分患者表现出与淋巴细胞数量减低，部分患者表现出与淋巴细胞数量减低，部分患者表现出与AIDSAIDSAIDSAIDS和部分晚和部分晚和部分晚和部分晚期肿瘤患者相似的免疫功能状态。期肿瘤患者相似的免疫功能状态。期肿瘤患者相似的免疫功能状态。期肿瘤患者相似的免疫功能状态。研究发现：研究发现：研究发现：研究发现：SARSSARSSARSSARS患者淋巴细胞及其各亚群均受到破坏，以患者淋巴细胞及其各亚群均受到破坏，以患者淋巴细胞及其各亚群均受到破坏，以患者淋巴细胞及其各亚群均受到破坏，以T T T T细胞细胞细胞细胞受损为主，而且受损为主，而且受损为主，而且受损为主，而且CD4CD4CD4CD4细胞比细胞比细胞比细胞比CD8CD8CD8CD8细胞受损更为严重。细胞受损更为严重。细胞受损更为严重。细胞受损更为严重。治疗后病情好转或治愈后，治疗后病情好转或治愈后，治疗后病情好转或治愈后，治疗后病情好转或治愈后，T T T T淋巴细胞数量可逐渐恢淋巴细胞数量可逐渐恢淋巴细胞数量可逐渐恢淋巴细胞数量可逐渐恢复正常。复正常。复正常。复正常。SARS活动期SLE患者外周血CD16CD56细胞百分率明显降低SLE、强直性脊柱炎和类风湿性关节炎患者外周血CD4细胞百分率显著降低，CD8+细胞百分率显著升高，CD4/CD8比值降低或倒置。治疗后患者CD4细胞明显增加，CD8+细胞显著降低，CD4/CD8+比值显著升高。SLE患者活动期和非活动期的淋巴细胞亚群结果有显著差异强直性脊柱炎和类风湿性关节炎患者活动期和非活动期的淋巴细胞亚群结果无显著差异 自身免疫疾病 干细胞移植后免疫系统将重建，但是极为缓慢。NK细胞首先开始升高，随后T、B淋巴细胞开始恢复。CD4+比CD8+重建更晚。倒置CD4+/CD8+两年才能逆转。造血干细胞移植后重建排斥反应和排斥反应和免疫抑制剂治疗监测。CD4/CD8低于0.2,则停止使用免疫抑制剂；若CD4/CD8过高，则提示容易发生排斥反应 器官移植后免疫监测恶性肿瘤治疗前CD3+细胞数量、CD4+/CD8+细胞比值降低，化疗或放疗有效时则可逐渐恢复或达到正常水平。癌转移时，CD3、CD4明显减少，CD8明显增多，CD4/CD8明显减少肿瘤终末期CD4/CD8比值，可预测患者存活期 实体肿瘤疗效观察 病毒性感染的重要标志1、艾滋病：免疫功能普遍低下是艾滋病患者最明显的特征。CD4+细胞显著低于正常对照组，而CD8+细胞正常，CD4+/CD8+比值下降。2、慢性乙肝患者：CD3、CD4、CD8均下降，CD4/CD8正常，表明患者T细胞辅助性、杀伤性功能下降，引起病毒清除困难，导致慢性迁延性肝损伤；3、慢活肝、肝硬化患者：CD3、CD4下降，CD8增高，CD4/CD8下降，患者免疫自稳功能下降，从而引起自身免疫损伤，肝细胞持续性、大量损伤；4、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、流行性出血热、麻疹急性期、水痘、猩红热和一些上呼吸道感染患者均可表现CD4下降、CD8升高能及CD4/CD8比值下降。牛皮癣牛皮癣患者血液中T淋巴细胞各亚群的数量常无明显的差别但患者皮肤病变的部位浸润淋巴细胞却以辅助/诱导性T细胞（TH）占优势案 例 分 析 1 1、邢某，男，左上肺癌邢某，男，左上肺癌 20102010年年1 1月月1515日入院检测：日入院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 51%20%26%12%21%51%20%26%12%21%2010 2010年年3 3月月2222日出院检测：日出院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 55%27%24%11%18%55%27%24%11%18%1 1、邢某，男，左上肺癌邢某，男，左上肺癌 20102010年年1 1月月1515日入院检测：日入院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 51%20%26%12%21%51%20%26%12%21%2010 2010年年3 3月月2222日出院检测：日出院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 55%27%24%11%18%55%27%24%11%18%2 2、曹某，男，胃癌曹某，男，胃癌 20102010年年3 3月月2424日入院检测：日入院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 43%30%15%4%29%43%30%15%4%29%2010 2010年年4 4月月2323日治疗后检测：日治疗后检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 53%35%21%4%31%53%35%21%4%31%3 3、唐某，男，慢淋唐某，男，慢淋 20102010年年8 8月月2525日入院检测：日入院检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 17%6%9%79%4%17%6%9%79%4%2010 2010年年9 9月月2121日治疗后检测：日治疗后检测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 53%17%34%36%9%53%17%34%36%9%2010 2010年年1010月月2525日治疗后监测：日治疗后监测：CD3 CD4 CD8 B NKCD3 CD4 CD8 B NK 80%14%60%13%10%80%14%60%13%10%淋巴细胞亚群的新指标需要进一步细分的淋巴细胞亚群需要进一步细分的淋巴细胞亚群zT helper/T inducer（CD3+CD4+），(ThCD29+/Ti CD45RA+)zT suppressor/T cytotoxic（CD3+CD8+）(TsCD28-/Tc CD28+)根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为：CD4+：Th1:CD4+IFNr+Th2:CD4+IL+Th0:CD4+IFNr+IL+CD8+：Tc1:CD8+IFNr+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD4+IFNr+IL4+调节性T细胞（regulatory T,Treg):淋巴细胞亚群中的新成员。是一群具有负调节机体免疫反应的淋巴细胞。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过渡损伤机体的重要作用也参与肿瘤细胞逃避机体免疫监视和慢性感染。诱导产生的细胞：1、TR1细胞：以分泌IL-10为特征，负调节免疫应答。2、TH3细胞：最早在口腔耐受性动物模型中发现，以分泌转化生长因子beta（TGF-beta）作为其功能性细胞激素。研究显示可能与口腔耐受性、黏膜免疫机制有关。CD特征：CD4+CD25+Foxp3+临床应用：1、诊断：肿瘤患者增高，类似NK（5-10%）2、疗效观察：化疗前9%，化疗后3%，时效性强，是肿瘤科医生重点关注指标 3、口腔耐受性、黏膜免疫机制有关Naive/Memory T Naive/Memory T 细胞亚群细胞亚群:淋巴细胞亚群中的新成员。Memory T细胞：记忆T细胞，CD45RO+T细胞分裂和分化后，会分别形成记忆T细胞和效应T细胞，而记忆T细胞则会在下一次抗原入侵时再次将记忆中的杀毒方法再次调动出来，再次杀灭抗原。记忆T细胞活着，病毒也就活着；记忆T细胞死亡，病毒也就死亡；病毒增殖也完全依赖于记忆T细胞的分裂。因此，摧毁记忆T细胞，也就可以摧毁“躲藏”起来的艾滋病病毒。肿瘤特异性记忆T细胞Nave T细胞：纯真/幼稚T细胞，CD45RA+没有记忆的T细胞临床应用：联合观察CD4和CD8，以CD4细胞为主 1、诊断：活动性多发性硬化症，Nave T细胞选择性缺失 2、肿瘤治疗疗效观察：治疗前，记忆T细胞占主要，属病态。治疗有效时，纯真/幼稚T细胞明显增多，记忆T细胞比例下降。1、肝素抗凝血或EDTA抗凝血，新鲜标本2、周一至周五上午9:30am前将标本送到检验科三楼住院临检室3、当天下午4:00pm后取结果/3、周六日及法定节假日不检测Thanks for listening!