化学发光技术综述.doc

化学发光技术综述化学发光免疫测定（CLIA）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。（一）原理化学发光免疫测定（CLIA）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。（二）特点特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。（三）分类1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。1.1直接化学发光化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。1.1.1 吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。特点：发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。优点主要有：背景发光低，信噪比高；发光反应干扰因素少；光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；标记物稳定（在2-8 下可保存数月之久）。1.1.2.三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。1.2 酶促反应化学发光是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。酶促化学发光灵敏度高，但速度慢，酶活性容易受外界影响，其代表性的发光物质有鲁米诺及其衍生物、AMPPD1.2.1. 鲁米诺及其衍生物（HRP)激活酶为辣根过氧化物酶（HRP)，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。但在使用增强剂的情况下，发光的持续时间可延到30-60min，发光强度至少增加100倍以上。现通常采用的体系是Luminol/H2O2/HRP体系，即用HRP标记抗原或抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用NaOH+H2O2作发光启动试剂，化学发光反应2min后，光反射强度达到最高峰；20min后，光强度减少20%。1.2.2. 异鲁米诺（ABEI）新产业的化学发光使用的发光剂，使用的是闪光非酶激活技术，加入启动液后测试0.1-3s时间内的发光强度。1.2.3 AMPPD (AP)激活酶为碱性磷酸酶（AP）AMPPD的特性：(1) 在碱性环境下，AMPPD的非酶解性的水解程度低，即本底低；(2) 热稳定性好，在pH=7.0的水中，30时的分解半衰期为142h；(3) 发光为辉光型，波长为470nm，在15min时强度达到高峰，15-60min内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得出正确结果；(4) 加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDMQ)或BSA等，能明显增强AP酶解AMPPD的发光强度，增强因素达100-100000倍。现通常采用的体系是Dioxetane/AP/Enhance System，即用碱性磷酸酶(AP)标记抗原或抗体，用(金钢烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物，在发光底物中加入增强剂。使用此系统的有美国DPC公司的Immulite System和Beckman Coulter公司Automated Immunoassay System等，迈瑞的化学发光所使用的底物基本上属于AMPPD。2、从固相载体上，一般分为板式分离和磁珠分离2.1 板式分离技术：将抗原/抗体包被在微孔板上，反应时，待检物质通过抗原抗体反应结合于包被板上，通过洗涤液数次洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。此分离技术和酶联免疫分析技术（ELISA）一致,只是将最后的显色剂改为发光剂得以实现，多数手工法检测，及部分半自动仪器使用这种分离技术，由于抗原抗体结合在反应孔中，反应面积有限，所以为达到充分反应，孵育时间一般比较长。常为0.5h2h。手工法化学发光最常用的发光体系是鲁米诺/H2O2/增强剂，规格和ELISA基本一致，为48T/96T。2.2 磁珠分离技术超顺磁珠是一种表面带有特定活性基团、大小均匀、 球形、具有超顺磁性及保护壳的微粒。超顺磁珠在有外磁场存在时表现出磁力而发生聚集，无磁场时又失去磁力而分散开来。通过一定的方法可将抗原/抗体等活性物质和磁珠表面的活性基团结合而包被于磁珠上面，检测时，将待检物和包被有抗原/抗体的磁珠在一定条件下孵育，通过抗原抗体反应结合，后通过增加外部磁场，磁珠产生磁性而聚集在一起，即可进行洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，最后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。使用磁珠法分离，由于反应时磁珠均匀分布于整个液体中，反应面积较大，更容易充分反应，故孵育的时间较短。（四）一些自动化仪器使用的方法原理：项目LIAISONByk-Sangtec)Axsym(雅培）Acess（贝克曼）Immulite 2000(DPC）ELECSYS 2010（罗氏）ACS180（拜耳）固相超顺磁珠塑胶微粒超顺磁珠塑料球，离心超顺磁珠超顺磁珠发光方式异鲁米诺酶促发光离子捕获AP/4-MUP酶促发光AMPPD酶促发光AMPPD电发光三联吡啶钌吖啶酯 3、通过活动，使学生养成博览群书的好习惯。B比率分析法和比较分析法不能测算出各因素的影响程度。C采用约当产量比例法，分配原材料费用与分配加工费用所用的完工率都是一致的。C采用直接分配法分配辅助生产费用时，应考虑各辅助生产车间之间相互提供产品或劳务的情况。错 C产品的实际生产成本包括废品损失和停工损失。C成本报表是对外报告的会计报表。C成本分析的首要程序是发现问题、分析原因。C成本会计的对象是指成本核算。C成本计算的辅助方法一般应与基本方法结合使用而不单独使用。C成本计算方法中的最基本的方法是分步法。XD当车间生产多种产品时，“废品损失”、“停工损失”的借方余额，月末均直接记入该产品的产品成本 中。D定额法是为了简化成本计算而采用的一种成本计算方法。F“废品损失”账户月末没有余额。F废品损失是指在生产过程中发现和入库后发现的不可修复废品的生产成本和可修复废品的修复费用。F分步法的一个重要特点是各步骤之间要进行成本结转。()G各月末在产品数量变化不大的产品，可不计算月末在产品成本。错G工资费用就是成本项目。()G归集在基本生产车间的制造费用最后均应分配计入产品成本中。对J计算计时工资费用，应以考勤记录中的工作时间记录为依据。()J简化的分批法就是不计算在产品成本的分批法。()J简化分批法是不分批计算在产品成本的方法。对 J加班加点工资既可能是直接计人费用，又可能是间接计人费用。J接生产工艺过程的特点，工业企业的生产可分为大量生产、成批生产和单件生产三种，XK可修复废品是指技术上可以修复使用的废品。错K可修复废品是指经过修理可以使用，而不管修复费用在经济上是否合算的废品。P品种法只适用于大量大批的单步骤生产的企业。Q企业的制造费用一定要通过“制造费用”科目核算。Q企业职工的医药费、医务部门、职工浴室等部门职工的工资，均应通过“应付工资”科目核算。 S生产车间耗用的材料，全部计入“直接材料”成本项目。 S适应生产特点和管理要求，采用适当的成本计算方法，是成本核算的基础工作。()W完工产品费用等于月初在产品费用加本月生产费用减月末在产品费用。对Y“预提费用”可能出现借方余额，其性质属于资产，实际上是待摊费用。对 Y引起资产和负债同时减少的支出是费用性支出。XY以应付票据去偿付购买材料的费用，是成本性支出。XY原材料分工序一次投入与原材料在每道工序陆续投入，其完工率的计算方法是完全一致的。Y运用连环替代法进行分析，即使随意改变各构成因素的替换顺序，各因素的影响结果加总后仍等于指标的总差异，因此更换各因索替换顺序，不会影响分析的结果。()Z在产品品种规格繁多的情况下，应该采用分类法计算产品成本。对Z直接生产费用就是直接计人费用。XZ逐步结转分步法也称为计列半成品分步法。A按年度计划分配率分配制造费用，“制造费用”账户月末(可能有月末余额/可能有借方余额/可能有贷方余额/可能无月末余额)。A按年度计划分配率分配制造费用的方法适用于(季节性生产企业)