DB21∕T 2433-2015 树莓组培育苗技术规程.pdf

ICS 65.020.01 B 61 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24332015 树莓组培育苗技术规程 Technical regulation on tissue culture of raspberry 2015 03 01 发布 2015 05 01 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 24332015 I 目 次 前言. 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语与定义.1 4 材料的选择.2 4.1 选择的部位.2 4.2 取材季节的选择.2 4.3 器官发育年龄的选择.2 4.4 取材的大小.2 5 消毒灭菌.2 5.1 外植体消毒灭菌.2 5.2 培养基高压灭菌.2 5.3 接种器具灭菌.2 6 初代培养.3 6.1 培养基配制.3 6.2 培养环境条件.3 6.3 培养方法.3 7 继代培养.3 7.1 培养基配制.3 7.2 培养环境条件.3 7.3 培养方法.3 7.4 增殖速率的计算.3 7.3.1 按理论计算.3 7.3.2 实际计算.3 8 生根培养.4 8.1 培养基配制.4 8.2 培养室环境条件.4 8.3 培养方法.4 8.4 根的生长.4 9 组培苗的移栽.4 9.1 移苗的季节.4 9.2 移苗的方法.4 9.2.1 清除培养基.4 9.2.2 苗床准备.4 9.2.3 移栽后的管理.4 9.2.3.1 移植后 10d 之内.5 9.2.3.2 移栽后 10d19d.5 DB21/T 24332015 II 9.2.3.3 生长 20d30d. 5 10 技术档案. 5 附录 A（规范性附录） 树莓组培苗木质量分级. 6 附录 B（资料性附录） 树莓组培苗移栽病虫害防治药剂用量 . 7 附录 C（资料性附录） 组培室的构成及基本设备. 8 DB21/T 24332015 III 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录，附录B、C为资料性附录。 本标准由辽宁省林业厅提出并归口。 本标准主要起草单位：阜新市林业种苗管理站、阜蒙县林业科技示范中心。 本标准主要起草人：张秀艳、齐金海、丁立娜、曹 颖、武春艳、李 钱、于 丹、杨树勇、丁瑞军、田明芳、赵方明、张志会、刘金城、宋春颖、付 玉、李 畅、霍 旺、柳士东、王国兴、舒红、胡玉珠、杨志勇、李亚辉、陈宝财、张 莹、龙忠勤、姬 东、扈延伍、董芷维、齐金艳、李 宁、贾斌英、柴旭光、杨爱风。DB21/T 24332015 1 树莓组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了树莓（Rubus corchorifolius L.f.）组织培养育苗过程中材料的选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、组培苗的移栽和技术档案等。 本标准适用于树莓在省内的工厂化组织培养育苗生产作业。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6001 育苗技术规程 LY/T 1770 桉树无性系组培快繁技术规程 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 LY/T 2041 黄藤和单叶省藤组培快繁技术规程 NY/T 2253 菠萝组培苗生产技术规程 DB31/T 349 非洲菊组培苗生产技术规范 DB34/T 1806 蓝莓组培育苗技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 树莓 Rubus corchorifolius L.f. 蔷薇科悬钩子属的多年生落叶性灌木。 3.2 组培苗 Tissue cultured seeding 根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，诱导出愈伤组织，不定芽、不定根，最后形成完整的植株，这个植株叫组培苗。 3.3 外植体 Explants 植物组织培养所利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表DB21/T 24332015 2 皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，称为外植体。 3.4 初代培养 Primary culture 又称诱导芽培养，外植体接种到培养基上以后，一般先放在培养室进行弱光培养，首先要得到无菌的材料，然后逐渐促进材料的分化和生长，这是试管苗的第一代，称初代培养。 3.5 继代培养 Subculture 又称分化培养，初代培养以后通过不断调试培养基和转接试管苗，使试管苗数量很快扩大，这种不断转苗增殖的过程称为继代培养。 3.6 生根培养 Rooting culture 在培养基上，利用从茎表皮细胞分裂形成突起的根原基，进一步从表皮培养形成根的过程。 4 材料的选择 4.1 选择的部位 应选择树莓的茎尖、茎段。 4.2 取材季节的选择 在春季芽开始萌发或正萌发生长时取材。 4.3 器官发育年龄的选择 以当年枝的嫩芽、嫩枝段做材料，分生能力强，形态建成快。 4.4 取材的大小 茎尖、茎段长0.5cm1.0cm，茎段每段留芽1个2个。 5 消毒灭菌 5.1 外植体消毒灭菌 用流水冲洗2h以上，拿到超净工作台上，用75%酒精冲洗30s40s，无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞处理3min4min，无菌水冲洗5次。 5.2 培养基高压灭菌 用高压灭菌锅在压力1.1MPa，温度为121下，灭菌20min。 5.3 接种器具灭菌 DB21/T 24332015 3 剪子、镊子、500ml烧杯（处理外植体使用）用牛皮纸包装，做到无漏洞，捆绑好，用高压灭菌锅在压力1.1MPa，温度为121下，灭菌20min。 6 初代培养 6.1 培养基配制 初代培养所用培养基：MS+BA1.0mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.8g/L。 6.2 培养环境条件 在无菌的环境下，培养室温度2325，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，整齐摆放在培养架（五层，每层间隔45cm,透光）上，培养室技术要求参照附录C。 6.3 培养方法 在植物生长季节取树莓茎，将叶片去掉，并将茎剪成 0.5cm1.0cm 带芽茎段，休眠芽预先剥除鳞片，采用 75%酒精消毒 30s40s，0.1%升汞水溶液消毒处理 3min4min，再用无菌水洗涤 5 次。然后在超净工作台上接种在初代培养基上。 7 继代培养 7.1 培养基配制 分化培养所用培养基为MS+BA0.5mg/L+GA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.8g/L。 7.2 培养环境条件 在无菌的环境下，培养室温度2325，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，整齐摆放在培养架（五层，每层间隔45cm,透光）上，培养室技术要求参照附录C。 7.3 培养方法 外植体长满培养瓶，就需转入到新的增殖培养基中，在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm1.2cm插入培养瓶内，三段为一簇，每瓶6簇。长满瓶后重复操作，这样一代一代地继续下去，就形成了树莓组织苗的无性繁殖体系。树莓扩繁方法有分株繁殖方式。 7.4 增殖速率的计算 7.4.1 按理论计算 1年内能繁殖试管苗的数量,可用式（1）计算 nmxy =（1） 式中：y为年繁殖苗数； m为无菌母株苗数； x为每个培养周期增殖的倍数； n为全年可增殖的周期次数。 7.4.2 实际计算 DB21/T 24332015 4 从接种开始，由1个芽经过1年繁殖后，应记录转接次数，统计实际得到的苗数，然后可以计算出实际繁殖周期和每个周期试管苗增殖的倍数。实际繁殖数往往低于理论计算数。 8 生根培养 8.1 培养基配制 生根培养所用培养基为1/2MS+BA0.3mg/L+IAA0.2mg/L+糖15g/L+琼脂4.8g/L。 8.2 培养室环境条件 培养室温度1825，湿度20%30%，光照强度2200lx2500lx，培养室技术要求参照附录C。 8.3 培养方法 在生根培养基中诱导生根。 树莓采用培养基瓶内一步生根法生根。 将生长健壮的茎尖接入生根培养基中诱导生。在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm1.2cm插入培养瓶内，每瓶插10株12株。 8.4 根的生长 根细长，通常有1条5条根，颜色白色。正在生长的白色根吸收力强，移苗容易成活。 9 组培苗的移栽 9.1 移苗的季节 组培苗的生长不受季节的影响，如果温室条件很好，夏季能降温，达到四季如春，则移苗也没有季节性。但组培苗移入温室的时候以冬季和早春为最好，经过冬季和早春的移苗和生长，到春暖花开的季节移苗到大田，再经过田间较长时间的生长而成为理想的壮苗。 9.2 移苗的方法 9.2.1 清除培养基 组培苗从瓶中取出， 放在盛有20左右的水中， 将附着在根上的培养基清洗掉， 洗时注意不能伤根，对生根过长的根要适当修剪。再放入另一盆温水中清洗1次，将培养基彻底洗掉，以免残留的培养基引起污染和霉烂。最后蘸1000倍2000倍海藻素类（促进生根）溶液后移栽。 9.2.2 苗床准备 在温室大棚内准备好移苗床。苗床要铺上装好基质的穴盘。基质要求排水性和透气性良好，同时也要有一定的保水性。采用草炭和沙子混合，按照比例为1:1。对基质进行消毒，用500倍800倍敌克松溶液喷洒基质。 70孔穴盘，每个孔种3棵，均匀分布在穴孔内，先挖一小穴，舒展根系，深度以叶片不接触基质、叶心不能埋入土内为宜，种植后轻轻镇压。种好后用细喷雾器喷水，冲掉叶面上可能沾着的基质，并使基质和根系密切接触。 9.2.3 移栽后的管理 DB21/T 24332015 5 9.2.3.1 移栽后 10d 之内 湿度：要保持空气湿度在90%左右，因为刚移栽的试管苗很嫩，叶片水分蒸发量大，而根系吸水功能差。有条件的最好用间歇喷雾，没有间歇喷雾的条件，则用塑料拱棚保湿。 温度：移苗期间的温度最好保持在2025左右，最低不要低于15，最高不要超过28。处于一个温度比较低的环境下，根系生长比较快，地上部生理活动比较缓慢，可逐步恢复生机，适应外界环境。 光照：光照一般不要过强和过弱，保护地冬季、早春光照一般在10000lx左右是合适的。 气：每天一早一晚各通风1次，每次通风以湿度降到60%70%。 9.2.3.2 移栽后 10d 19d 根系有一定的吸收功能，叶片也不再是非常幼嫩状态，要逐步降低空气湿度到40%50%，塑料棚上的薄膜可逐渐打开或全部打开。叶面喷肥，喷施N15-P15-K15复合肥500倍，加速幼苗生长。 每1周喷1次杀菌剂， 一般可用多抗霉素1000倍和异菌多菌灵1500倍 （或恶霉灵1000倍） 以防根腐病、灰霉病等发生，详见附录B。 9.2.3.3 生长 20d30d 一般在温室苗床移栽的组培苗， 生长20d30d即转移到营养杯内， 在移栽时根系已盘根错节与基质一起形成一团，要求基质不散移入土中，并及时浇水。在营养杯内再长35d40d，达到、级，即可出圃，详见附录A。 10 技术档案 按GB/T 6001要求，建立相应育苗技术管理档案。 DB21/T 24332015 6 附录 A （规范性附录） 树莓组培苗木质量分级 表 A 树莓组培苗木质量分级 苗木等级 级苗 级 苗 根系 根系 树种名称 苗木种类 苗龄 地径cm 苗高cm 长度cm 侧根数（条） 根团直径cm 地径cm 苗高cm 长度cm 侧根数（条） 根团直径cm 综合控制指标 、级苗百分率 适用范围 树莓 组培苗 1-0 0.4 10 15 20以上 5 0.20.4 510 1015 1020 35 组培脱毒苗，顶芽完整，无机械损伤，无病虫害，不失水，有旺盛的生命力 100 北至黑龙江、内蒙；南至广东、云南等省份 注：1-0表示1年生组培苗，未经移植。 DB21/T 24332015 7 附录B （资料性附录） 树莓组培苗移栽病虫害防治药剂用量 表B 树莓组培苗移栽病虫害防治药剂用量 药剂名称 剂型 防治病害、虫害种类 药量 备注 敌克松 粉剂 500800倍 基质消毒 异菌多菌灵 悬浮剂 根腐病、灰霉病 1500倍 移栽后喷施 多抗霉素 水剂 根腐病、灰霉病 15002000倍 移栽后喷施 恶霉灵 99%粉剂 根腐病、灰霉病 1000倍 移栽后喷施 阿维菌素 5%乳油 红蜘蛛 15002000倍 移栽后喷施 DB21/T 24332015 8 附录C （资料性附录） 组培室的构成及基本设备 组培实验室一般应包括更衣室、洗瓶室、配置室、配药室、灭菌室、接种室、培养室、驯化棚室等。结合具体情况，可以合并部分分室。 C.1 洗瓶室 用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗和整理等。要求房间宽敞明亮，方便多人同时工作，有电源、水源，上下水通畅；地面耐湿、防滑、排水良好，便于清洁。 设备及用具：工作台、烘箱、晾干架、周转筐、各种规格的毛刷、药品柜等。 C.2 培养基配置室 用于培养基的配置、植物材料的预处理。要求房间宽敞明亮、通风干燥，方便多人同时工作，有电源、水源，上下水通畅。 设备及用具：电子分析天平、托盘天平、电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴振荡器、微波炉、冰箱、展示柜、移液管、培养瓶、试剂瓶、烧杯、量筒、容量瓶、培养皿、玻璃棒、记号笔、封口膜、瓶盖、周转筐、纱布、小推车等。 C.3 灭菌室 用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。要求安全、通风、明亮；墙面和地面防潮、耐高温。水源、电源加热；上下水通畅； 设备及用具：压力灭菌锅、周转筐、换气扇、小推车等。 C.4 接种室 进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，即无菌操作室。要求空间宜小不宜大，密闭、干爽安静、清洁明亮、不易积尘。门窗密闭性好、吊装紫外光灯，保持环境无菌或低密度有菌状态；安置空调机；人流与物流分开。 设备及用具：超净工作台、空调机、接种器械灭菌器、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、接种工具、手持喷雾器、工作台、污物桶等。 C.5 培养室 用于培养离体材料。要求面积不宜过大，1020m2 ，培养室外有缓冲间或走廊；能够控制光照和温度；保持整洁，防止微生物污染；可通风、降湿、散热；专线供电和配电设备。 设备及用具：空调、排风扇、培养箱、除湿机、时控器、干湿温度计、培养架、日光灯、工作台、配电箱等。 C.6 驯化棚室 用于组培苗的驯化移栽。要求环境清洁无菌，可控温、保湿、遮阴、防虫、采光良好。 设备及用具：遮阳网、暖气、移栽床、穴盘等。