DB21∕T 2451-2015 玉米品种真实性鉴定 SSR分子检测方法.pdf

ICS 65.020.20 B 21 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24512015 玉米品种真实性鉴定 SSR 分子检测方法 Maize variety genuineness verification with SSR markers 2015 - 04 - 01 发布 2015 - 06 - 01 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 24512015 I 目 次 前言. II 1 范围. 1 2 规范性引用文件. 1 3 术语、定义和缩略语. 1 4 方法原理. 2 5 仪器设备、试剂和溶液配制. 2 6 检测步骤. 3 7 结果分析和表示. 6 8 结果判定. 6 附录 A（规范性附录） 核心引物名称和序列 . 7 附录 B（规范性附录） 溶液配制 . 9 DB21/T 24512015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省种子管理局。 本标准起草人：朱志成、李波、高振环、邹畅、肖国峰、王汝宝、李洪建、赵前程、王见中、温浩、李鹏、史鸿儒、安辉、徐策、孙丽红、王东坡。 DB21/T 24512015 1 玉米品种真实性鉴定 SSR 分子检测方法 1 范围 本标准规定了玉米品种真实性鉴定的原理、仪器设备、检测步骤及结果判定。 本标准适用于玉米品种真实性 SSR 分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1.1 品种真实性 供检样品与该品种的对照样品是否相符。 3.1.2 对照样品 省级以上种子管理部门收集并保存的与品种名称相符的种子样品。 3.1.3 参照品种 已知等位变异 SSR 位点的品种。 3.1.4 SSR 分子检测 通过 SSR 分子标记检测玉米品种基因组 DNA 的差异，鉴定玉米品种真实性的检测方法。 3.2 缩略语 DB21/T 24512015 2 CTAB：cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTPs：deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核苷三磷酸。 PAGE：polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。 SDS：sodium dodecyl sulfate，十二烷基苯磺酸钠。 SSR：simple sequence repeat，简单重复序列。 Taq酶：Taq- DNA polymerase，耐热DNA聚合酶。 4 方法原理 由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组 DNA 中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通过 PCR 扩增及电泳方法进行检测，从而能够鉴定玉米品种真实性。 5 仪器设备、试剂和溶液配制 5.1 仪器设备 5.1.1 PAGE 检测平台 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR 扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。 5.1.2 毛细管电泳检测平台 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR 扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、DNA 分析仪。 5.2 试剂 5.2.1 PAGE 电泳 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na22H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的盐酸、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、dNTPs、Taq 酶、10Buffer 缓冲液、矿物油、去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（Brph Blue）、二甲苯青 FF、甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide） 、 丙烯酰胺 （acrylamide） 、 硼酸 （Boric Acid） 、 尿素、 亲和硅烷 （Binding Silane） 、疏水硅烷（Repel Silane）、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛。 5.2.2 毛细管电泳 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na22H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的盐酸、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10Buffer缓冲液、矿物油、DNA分析仪专用丙烯酰胺胶、DNA分析仪专用分子量内标、DNA分析仪专用电泳缓冲液。 5.3 溶液配制 DB21/T 24512015 3 DNA提取、PCR扩增、电泳以及银染溶液按照附录B（规范性附录）规定的要求进行配制，所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水的要求，其中银染溶液的配制只需达到三级水的要求。 6 检测步骤 6.1 送验样品及 DNA 提取 6.1.1 送验样品 送验样品为种子，重量不低于 200g 或不少于 500 粒。送验样品为果穗，应不低于 5 个果穗(总粒数不低于 500 粒)；送验样品为幼苗、叶片或苞叶的，应至少含有 40 个个体。 对于玉米自交系或单交种，可采用混合样或单个个体独立检测。混合样的试样应至少含有 20 个个体，单个个体独立检测的试样应至少含有 5 个个体。采用混合样而检测结果在某个引物位点出现异质性并影响到结果判定的，应采用单个个体独立检测，试样应至少含有 20 个个体。 6.1.2 DNA 提取 DNA提取方法可任选6.1.2.1至6.1.2.4所列的一种方法。 DNA质量应符合PCR扩增的要求。 6.1.2.1 CTAB 法 取试样的幼苗或叶片 200mg300 mg 置于 2.0 mL 离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎后，移入 2.0 mL 离心管。每管加入 700 L 经 65预热的 CTAB 提取液，充分混匀，65水浴 60min 充分混匀。每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1）混合液，充分混合后静置 10min，在 12000rpm 条件下离心 15 min。吸取上清液转移至另一离心管内，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20放置 30 min后在 4、12000 rpm 条件下离心 10min，弃上清液，加入 70%乙醇溶液，旋转 2 次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置 10 min 以上。加入 100 L 超纯水或 TE 缓冲液 1，充分溶解后备用。 此方法为 DAN 提取的仲裁方法。 6.1.2.2 SDS 法 剪取试样的幼苗或叶片或剥取干种子的胚，置于 1.5 mL 离心管，加入 100 L 氯仿后研磨，再加入300L SDS 提取液，混匀后在 10000rpm 条件下离心 2min。吸取上清液，转移至预先装有 300L 异丙醇和 300L 5mol/L 氯化钠溶液的 1.5mL 离心管中。 待成团后， 挑出 DNA， 经 70%乙醇溶液洗涤后， 加入 200L TE 缓冲液 1，充分溶解后备用。 6.1.2.3 碱煮法 剥取试样干种子的胚， 或将种子培养至幼苗长度达到 3cm 左右时剪取每株幼苗 1.5cm， 放入 96 孔深孔板中。每孔加入 150L 氢氧化钠溶液，煮沸 5min，然后加入 150L TE 缓冲液 2，充分溶解后备用。 6.1.2.4 试剂盒法 选用适宜SSR标记法的商业试剂盒，并经验证合格后使用。提取方法，按照提供的使用说明进行。 DB21/T 24512015 4 6.2 PCR 扩增 6.2.1 反应体系 PCR 扩增反应体系的总体积可以依据具体情况确定。20L 反应体系应符合表 1 的要求。 本标准推荐了 40 对核心引物，引物名称和序列见附录 A。选用 PAGE 电泳，应合成普通引物，采用单引物电泳。选用毛细管电泳，合成引物时需在上游引物的 5端标记荧光染料，可采用单引物电泳或多引物组合电泳。 对于近似品种，采用本标准推荐 40 对核心引物无明显差异的，可以采用能够区分的特异引物作为进行 SSR 检测。当使用特异引物时，应在检验报告中说明该特异引物的序列信息。 表1 PCR 扩增反应体系 反 应 组 分 原 浓 度 终 浓 度 体 积 （ L） ddH2O 12.35 10Buffer 10 1 2 MgCl2 25 mmol/ L 2.5 mmol/L 2 dNTP 2.5 mmol/ L each 0.15 mmol/ L each 1.2 Taq 酶 5 U/ L 1 U 0.2 引 物 20mol/ L 0.25 mol/ L each 0.25 DNA 25ng/ L 2.5ng/ L 2 6.2.2 反应程序 反应采用下列程序：94预变性5min，1次循环；94变性40s，60退火35s，72延伸45s，进行35次循环扩增反应；72延伸10min。反应程序的反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而进行适当的调整。形成的扩增产物于4保存。 6.3 扩增产物检测 6.3.1 PAGE 电泳 6.3.1.1 制胶 制胶执行下列程序： a) 蘸洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、95%乙醇溶液分别擦洗两遍。玻璃板干燥后，将0.5 mL亲和硅烷工作液，均匀涂在无凹槽的玻璃板上；将0.5 mL疏水硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的玻璃板上。操作过程中两块玻璃板分别处理，防止相互污染； b) 玻璃板彻底干燥后，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上凹槽玻璃板，夹子固定后，用水平仪检测玻璃胶室是否水平； c) 取100mL 4.5%PAGE胶，加入TEMED、25%过硫酸铵各100L，迅速混匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡的出现。 待胶室灌满后， 在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳， 在室温下聚合1h以上。 6.3.1.2 变性 DB21/T 24512015 5 取20l扩增产物（见6.2.2），加入4 L 6加样缓冲液，混匀。在PCR扩增仪上运行94变性5 min，4冷却10 min后备用。 6.3.1.3 电泳 电泳执行下列程序： a) 正极槽 （下槽） 加入1TBE缓冲液600mL， 负极槽 （上槽） 加入经65预热的1TBE缓冲液600mL，拔出样品梳，在90W恒功率下预电泳10min20min； b) 用移液器清除加样槽孔气泡和杂质，插入样品梳（鲨鱼齿朝下），每一个加样孔点入5L样品（6.3.1.2），在80W恒功率下电泳； c) 电泳时间因扩增产物预期片段大小不同而有所不同，一般来说，DNA扩增产物的预期片段，泳动到胶板中部位置，效果较好，可采用上部的二甲苯青指示带进行确定； d) 达到电泳时间后关闭电源，结束电泳，取下玻璃板并轻轻撬开，通常凝胶附着在无凹槽的玻璃板上。 6.3.1.4 染色 染色执行下列程序： a) 将附着凝胶的玻璃板浸入固定液中，轻轻晃动3min后取出，在双蒸水中快速漂洗，时间不超过10 s； b) 将胶板放入染色液中，轻轻晃动5min后取出，在双蒸水中快速漂洗，时间不超过10s； c) 将胶板放入显影液中，轻轻晃动待条带清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在双蒸水中漂洗1min； d) 取出胶板，晾干，放在胶片观察灯上观察，记录结果，拍照保存。 注：固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量，可依据胶板数量和大小调整，以浸过胶面为准。 6.3.1.5 数据记录 供检样品与对照样品在同一电泳板上并排电泳时，每个位点进行逐对比较，并记录比较结果。 供检样品与对照样品DNA指纹库中的指纹数据进行比较时，执行下列程序： a) 将供检样品与参照品种在同一电泳板上并排电泳，逐个位点进行逐对比较，并记录比较结果。 b) 将该样品的纯合位点基因型数据记录为X/X，杂合位点基因型数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点基因型数据记录为0/0； c) 与数据库中对照样品指纹数据进行比较，记录比较结果。 6.3.2 荧光毛细管电泳检测 6.3.2.1 变性 分别取等体积的扩增产物和不同荧光标记的产物，混匀后从混合液中吸取1L，加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，各孔再分别加入0.1L分子量内标和8.9 L去离子甲酰胺。在PCR仪上95 变性5min，取出立即置于碎冰上，冷却10min以上。离心10s后备用。 6.3.2.2 电泳 打开DNA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液、灌胶。将装有样品的微孔板放置于样品架基座上，打开数据收集软件。按照DNA分析仪使用手册进行操作，DNA分析仪将自动运行，并保存电泳数据文件。 DB21/T 24512015 6 7 结果分析和表示 位点差异记录分为下列三种情形： 位点存在差异的或完全相同的，记录为有差异或无差异； 位点数据缺失的，记录为缺失； 位点显示无法判定的，记录为无法判定。 检验结果用比较供检样品和对照样品的位点差异数目表示。统计位点差异记录的结果，计算比较位点数、差异位点数及差异位点。 8 结果判定 供检样品和对照样品的差异位点数目3，判定为与对照样品不相符。 供检样品和标准样品的差异位点数目3，判定为与对照样品相符。 属于下列情形之一的，需要在检验报告中注明： 采用的对照样品数据来自对照样品DNA指纹数据库的； 使用特异引物进行检测的，应提供该特异引物的序列信息。 DB21/T 24512015 7 A A 附 录 A （规范性附录） 核心引物名称和序列 编号 引物名称 染 色 体位置 分组 引物序列 荧光染料 P01 bnlg439w1 1.03 I 上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC 下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC NED P02 umc1335y5 1.06 I 上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG 下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATG PET P03 umc2007y4 2.04 I 上游：TTACACAACGCAACACGAGGC 下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACAC FAM P04 bnlg1940k7 2.08 I 上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC 下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC PET P05 umc2105k3 3.00 I 上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG 下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG PET P06 phi053k2 3.05 I 上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG 下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGC NED P07 phi072k4 4.01 I 上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG 下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTC VIC P08 bnlg2291k4 4.06 I 上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG 下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCC VIC P09 umc1705w1 5.03 I 上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG 下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAG VIC P10 bnlg2305k4 5.07 I 上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG 下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG NED P11 bnlg161k8 6.00 I 上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG 下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGC VIC P12 bnlg1702k1 6.05 I 上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC 下游：AGGACACGCCATCGTCATCA VIC P13 umc1545y2 7.00 I 上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC 下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT NED P14 umc1125y3 7.04 I 上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC 下游：CCACCAACCCATACCCATACCAG VIC P15 bnlg240k1 8.06 I 上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC 下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC PET P16 phi080k15 8.08 I 上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG 下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC PET P17 phi065k9 9.03 I 上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC 下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACC NED P18 umc1492y13 9.04 I 上 游 ： GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG 下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGG PET P19 umc1432y6 10.02 I 上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC 下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC PET P20 umc1506k12 10.05 I 上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG 下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACAC FAM P21 umc1147y4 1.07 II 上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC 下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGC NED P22 bnlg1671y17 1.10 II 上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG 下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATG FAM DB21/T 24512015 8 P23 phi96100y1 2.00 II 上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG 下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCC FAM P24 umc1536k9 2.07 II 上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCG 下 游 ： GAGCATAGAAAAAGTTGAGGTTAATATGGAGC NED P25 bnlg1520K1 2.09 II 上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC 下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTG FAM P26 umc1489y3 3.07 II 上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC 下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGT NED P27 bnlg490y4 4.04 II 上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG 下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTA NED P28 umc1999y3 4.09 II 上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC 下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCG FAM P29 umc2115k3 5.02 II 上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG 下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGG VIC P30 umc1429y7 5.03 II 上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC 下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTG VIC P31 bnlg249k2 6.01 II 上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG 下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAG VIC P32 phi299852y2 6.07 II 上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG 下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGT VIC P33 umc2160k3 7.01 II 上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG 下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATT VIC P34 umc1936k4 7.03 II 上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG 下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTC PET P35 bnlg2235y5 8.02 II 上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG 下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCT VIC P36 phi233376y1 8.09 II 上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG 下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTC PET P37 umc2084w2 9.01 II 上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC 下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGC NED P38 umc1231k4 9.05 II 上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT 下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTC FAM P39 phi041y6 10.00 II 上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT 下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGAC PET P40 umc2163w3 10.04 II 上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC 下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGC NED DB21/T 24512015 9 附 录 B （规范性附录） 溶液配制 B.1 DNA提取 B.1.1 0.5mol/L EDTA溶液 186.1 g Na2EDTA.2H2O溶于800 mL水中，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至1000 mL，高压灭菌。 B.1.2 1 mol/L Tris- HCl溶液 60.55 g Tris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500 mL，高压灭菌。 B.1.3 0.5 mol/L HCl溶液 25 mL浓盐酸(36- 38%)，加水定容至500mL。 B.1.4 CTAB提取液 81.7g 氯化钠和 20g CTAB溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris- HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA 40 mL，定容至1000 mL，4 贮存。 B.1.5 SDS提取液 1 mol/L Tris- HCl 50 mL，0.5 mol/L EDTA 50 mL，5 mol/L NaCl 50 mL，SDS 7.5 g，定容至500 mL。 B.1.6 氢氧化钠溶液 2 g固体NaOH溶于水中，加水定容至500 mL。 B.1.7 TE缓冲液1 1 mol/L Tris- HCl 5mL，0.5 mol/L EDTA 1mL，加HCl调pH至8.0，定容至500 mL。 B.1.8 TE缓冲液2 1 mol/L Tris- HCl 5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，0.5 mol/L HCl 100 ml，定容至500 mL。 B.1.9 5 mol/L NaCl溶液 146 g 固体NaCl溶于水中，加水定容至500 mL。 B.2 PCR扩增 B.2.1 SSR引物 用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40mol/L的储存液，等体积混合成20mol/L的工作液。 B.2.2 6加样缓冲液 去离子甲酰胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1 mL，溴酚兰0.125 g，二甲苯青0.125 g。 DB21/T 24512015 10 B.3 电泳 B.3.1 40PAGE胶 丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500 mL。 B.3.2 4.5% PAGE胶 尿素450g，10TBE缓冲液100mL，40% PAGE胶112.5mL，定容至1000 mL。 B.3.3 Bind缓冲液 49.75 mL无水乙醇和250 L冰醋酸，加水定容至50 mL。 B.3.4 亲和硅烷工作液 在1 mL Bind缓冲液中加入5L Bind原液，混匀。 B.3.5 疏水硅烷工作液 2二甲基二氯硅烷。 B.3.6 25%过硫酸铵溶液 0.25 g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。 B.3.7 10TBE缓冲液 Tris碱108 g，硼酸 55 g，0.5 mol/L EDTA溶液37 mL，定容至1000 mL。 B.3.8 1TBE缓冲液 10TBE缓冲液500 mL，加水定容至5000 mL。 B.4 银染 B.4.1 固定液 100 mL冰醋酸，加水定容至1000 mL。 B.4.2 染色液 2 g硝酸银，加水定容至1000 mL。 B.4.3 显影液 1000 mL蒸馏水中加入30 g 氢氧化钠和5 mL甲醛。 _