DB36∕T 886-2015 南方水稻黑条矮缩病防治技术规程.pdf

ICS 67.060 B22 备案号：48490-2016 DB36 江西省地方标准 DB 36/ T 8862015 南方水稻黑条矮缩病防治技术规程 Technical Regulation for Disease Control of Southern Rice Black-streaked Dwarf Disease 2015 - 12 - 21 发布 2016 - 03 - 15 实施江西省质量技术监督局 发 布 DB36/ T 8862015 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 南方水稻黑条矮缩病综合防治技术 . 2 附录 A（规范性附录） 南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)dot-ELISA 检测方法 . 4 附录 B（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病原、症状及传毒 . 7 附录 C（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病情划分指标. 8 DB36/ T 8862015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由江西省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：兰波、杨迎青、李湘民、黄瑞荣、黄蓉、胡建坤、陈洪凡、熊艳。 DB36/ T 8862015 1 南方水稻黑条矮缩病防治技术规程 1 范围 本标准规定了南方水稻黑条矮缩病（Southern Rice Black-streaked Dwarf Disease）防治术语和定义、防治原则、指标、措施和方法。 本标准适用于南方水稻黑条矮缩病的防治。 2 术语和定义 2.1 南方水稻矮缩病毒 southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV) 属斐济病毒属(Fijivirus) 暂定新种，病毒粒体球状,直径70nm75nm，存在于寄主植物韧皮部筛管及伴胞内， 导致寄主植物矮化、 茎表纵向条状排列小瘤突等症状。 该病毒基因组由10片段dsRNAs组成，由大到小分别命名为S1S10。白背飞虱（Sogatella furcifera Horvth）是其主要的田间传毒介体。 2.2 白背飞虱带毒率 rate of viruliferous WBPH 携带SRBSDV的白背飞虱虫量占白背飞虱调查总虫量的百分比率。 2.3 病丛（株）率 diseased cluster(plant) rate 发病水稻丛（株）数占调查总丛（株）数的百分率。 2.4 显症 symptomatic appearance 水稻感染SRBSDV一段时间后表现出植株矮缩、倒生根、纵向排列的小瘤突等症状，一般感染15d左右达显症高峰。 2.5 发生面积 diseased epidemic area 指田间南方水稻黑条矮缩病实际发生病丛率大于1%的田块面积总和。 2.6 综合防治 integrated control 是指从农田生态系的总体观念出发，以预防为主，有机地、因地制宜地、协调地使用农业的、化学的、生物的和物理的防治措施以及其他有效的生态学手段，把病、虫、草的发生数量控制在经济允许水平之下，以达到高产、优质、低成本和少公害或无公害的目的。 DB36/ T 8862015 2 3 南方水稻黑条矮缩病综合防治技术 3.1 防治原则 实施抓前期保后期,抓秧田保大田的治虫防病策略。 3.2 白背飞虱监测 在水稻秧苗期至分蘖期， 采用自动虫情测报灯， 逐日收集白背飞虱， 将每日白背飞虱样品置于1.5mL尖底或2mL平底小离心管中。 为防止虫体腐烂， 管内再放入适量经70%酒精浸润的纸巾或棉球， 盖紧管盖，管壁表明地点和日期，初处理后进行及时检测，每周集中检测1次。如遇白背飞虱集中迁入峰，则单独检测峰日白背飞虱。采用dot ELISA检测试剂盒或采用商品化PCR试剂盒测定白背飞虱的带毒率情况。每批次检测白背飞虱数量应在100头以上（如果1次采虫不足100头，可采用连续几天收藏或采集的虫体标本进行检测）。然后逐个架次反应类型（带毒白背飞虱呈现阳性反应），记载带毒虫量。根据式（1）计算带毒率。 S H= . (1) Z 式中： H带毒率，单位为百分率（%）； S带毒虫量，单位为头； Z检测总虫量，单位为头。 3.3 南方水稻黑条矮缩病监测 在观察区调查每种主要水稻类型田块不少于20块，面积不少于1hm2,可结合白背飞虱大田普查同时进行。采用平行跳跃10点取样，本田每点调查20丛。记录调查情况，病进行带毒率检测（记载发病田块数、发病丛数，计算病田率、病虫率）。 3.4 农业防治 选种抗（耐）病品种，适当密植，在秧田期和移栽后15d内进行田间排查，发现病株及时拔除深埋，再从健康稻丛中分出部分稻苗补缺。合理施肥，防止深水灌溉,使水稻生长不过旺。 3.5 生物防治 利用寄生性天敌如寄生蜂， 黑肩绿盲蝽， 捕食性天敌蜘蛛， 稻田养鸭等措施控制白背飞虱种群数量。 3.6 物理防治 利用频振式杀虫灯、黑光灯、性信息素诱杀白背飞虱。 3.7 化学防治 3.7.1 药剂拌种 在种子催芽露白后用60高渗吡虫啉悬浮剂(高巧或优拌)10mL加50mL水， 再均匀拌1.5kg(以干种子计重)种子，放在阴凉处的薄膜上晾8h24h药液全干后即可播种，拌药后的种子不能放在水泥地上，不能暴晒。 DB36/ T 8862015 3 3.7.2 防治适期 根据南方水稻黑条矮缩病田间发病丛数调查结果，结合白背飞虱的虫源基数和带毒率、耕作制度、气候条件、 白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度等因素综合分析， 做出南方水稻黑条矮缩病发生程度趋势预报，做好药剂防治。 3.7.3 合理选用农药 对1、2代白背飞虱选用长持效药剂，如吡蚜酮、噻嗪酮、宁南霉素等，对3代白背飞虱及秧苗期白背飞虱防治应选用速效性药剂防治，如吡虫啉、烯啶虫胺等药剂。施药时保证充足药剂量及药液量，确保防治效果。 DB36/ T 8862015 4 A A 附 录 A （规范性附录） 南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)dot-ELISA 检测方法 A.1 试验原理 dot- ELISA是以硝酸纤维素膜(NC膜）为固相载体的ELISA检测方法，具有简便、快速、特异、敏感、便于推广、不需特殊仪器等优点。目前在人类、动植物病原检测中广泛应用。携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱（或水稻植株）样品的匀浆液点到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入杭南方水稻黑条矮缩病毒鼠单杭，则单抗与固相伉原(SRBSDV)形成抗原抗体复合物；再加入辣根过氧化物酶（HRP）检测植株时加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗鼠IgG抗抗体（即二抗），则抗抗体与上述抗原抗体复合物结合形成抗原抗体酶标抗抗体复合物； 加入显色底物， 复合物上的酶催化底物生成沉淀型有色产物而显色。由于每步之间均有洗涤的步骤，若待测白背飞虱（水稻植株样品中不含SRHSDV，则酶标抗休将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。肉眼观察斑点颜色有无及深浅来进行样品中SR BSDV的定性和半定量检测。 A.2 白背飞虱样品检测 A.2.1 主要试剂与材料准备 0.01mol/L PBS 10mL SRBSDV单克隆抗休 0. 1 mL HRP 标记羊抗鼠IgG二抗 0.04 mL TMB显色底物液 4 mL 10 x浓缩封闭液 5 mL 10 x抗体稀释液 5 mL 20 x浓缩洗涤液 10 mL (注：以上试剂均保存于4下) NC膜 2张 A.2.2 操作步骤 a) 一头白背飞虱放入 1. 5 mL 的离心管中后加人 50L200L 0.01 mol/L PBS，用牙签或 200L枪头捣碎飞虱； b) 5000 r/min 离心 3 min,如无条件此步可以省略； c) 取 3L 上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，室温干燥 10min20min; d) NC 膜浸入到封闭液中室温封闭 30min; e) NC 膜放入用抗体稀释液 1:1000 倍稀释的单抗中室温孵育 30 min60 min; f) 水平摇床上用洗涤液洗膜 3 次4 次，每次 3min; g) NC膜放入用抗体稀释液1:1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30 min60 min; h) 水平摇床上用洗涤液洗膜 4 次5 次，每次 3 min; DB36/ T 8862015 5 i) 将 TMB 底物显色液滴加到膜表而进行显色反应,待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，肉眼观察结果，并记录检测结果 。 A.2.3 缓冲液配方 a) 磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH7. 4): NaCl 8 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO412H2O 3g，加蒸馏水 950 mL 溶解后调 pH 至 7.4.定容至 l000mL。 b) 封闭液：用去离子水将 10 x 封闭液按 1：9 体积比进行稀释(1 份:10 x 封闭液+ 9 份去离子水，稀释后的封闭液在 4环境可保存 l 个月。 c) 洗涤液：用去离子水将 20 x 浓缩洗涤液按 1：19 体积比进行稀释（或按需量稀释) （1 份 20 x浓 缩洗涤液+19 份去离子水），稀释后的洗涤液在 4环境可保存 1 个月。 d) 抗体稀释液：用去离子水将 10 x 抗体稀释液按 l：9 体积比进行稀释（l 份 10 x 封闭液+9 份去离子水），稀释后的抗体稀释液在 4环境可保存 1 个月。 A.2.4 注意事项 A.2.4.1 硝酸纤维素膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用摄子和戴一次性PE手套取膜； A.2.4.2 NC膜CK+ 处为阳性对照(点带SRBSDV的自背飞虱匀桨液)； A.2.4.3 NC.膜CK-为阴性对照（点无SRBSDV的自背飞虱匀浆液） ； A.2.4.4 NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实验过程中应朝上； A.2.4.5 抗体在使用前10min之内稀释； A.2.4.6 阳性对照和阴性对照来自于带毒和非带毒的白背飞虱，仅用于dot-ELISA检测； A.2.4.7 该试剂盒反应温度为438，最佳反应温度为37。 A.2.5 贮藏条件及保存期 试剂盒于28避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。 A.3 水稻植株样品检测 A.3.1 主要试剂与材料 0.01 mol/LPBS 10 mL SRBSDV单克隆抗体 0.1mL AR标记羊抗鼠IgG二抗 0.04mL 10 x浓缩封闭液 5mL 10 x抗体稀释液 5 mL 20 x浓缩洗涤液 20 mL NBT储备液 0.15 mL BCIP储备液 0.1mL 底物缓冲液 20 mL 注：以上试剂均保存于4下。 NC膜 2张 A.3.2 操作步骤 DB36/ T 8862015 6 a) 水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按 l：(1030) (重量；休积，g/mL）加人 0.01 mol/LPBS后研解； b) 5000r/min 离心 3min; c) 去 2L 上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，室温干燥 10 min20 min; d) NC 膜浸入到封闭液中室温封闭 30min; e) NC 膜放入用封闭液 1：1000 倍稀释的单抗中室温孵育 30min60min; f) 水平摇床上用洗涤液洗膜 3 次4 次，每次 3min; g) NC 膜放入用封闭液 l：1000 倍稀释的 AP 标记羊抗鼠 IgG 二抗中室温孵育 30min60min; h) 水平摇床上用洗涤液洗膜 4 次5 次，每次 3 min; i) 6LNBT 和 33LBCIP 底物加到 10 mL 底物缓冲液中混匀洗好的膜放人底物显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗下，肉眼观察结果，并记录结果； A.3.3 缓冲液配方 a) 磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)：NaCl 8g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO4 12H2O 3g，加蒸馏水 950 mL，溶解后调 pH 至 7.4 定容至 1000 mL。 b) 封闭液：用去离子水将 10 x 封闭液按 l：9 体积比进行稀释(1 份:10X 封闭液+9 份去离子水），稀释后的封闭液在 4环境可保存 l 个月。 c) 洗涤液：用去离子水将 20 x 浓缩洗涤液按 l：9 体积比进行稀释（或按需量稀释）（l 份 20 x浓缩洗涤液+19 份去离子水），稀释后的洗涤液在 4环境可保存 1 个月。 d) 抗体稀释液： 用去离子水将 10 x 抗体稀释液按 l： 9 体积比进行稀释(1 份 10 x 封闭液+9 份去离子水)，稀释后的抗体稀释液在 4环境下保存 1 个月。 e) 底物显色液：66L NBT 和 33L BCIP 加到 10mL 的底物缓冲液混匀. A.3.4 注意事项 A.3.4.1 NC膜位于2张保护纸中间，不要用手直接触摸膜，用摄子和戴一次性PE手套取膜； A.3.4.2 NC膜上滴加检测样品的一面为正面，整个实脸过程中应朝上； A.3.4.3 硝酸纤维素膜CK+处为阳性对照点含SRBSDV病毒的水稻叶片汁液） ； A.3.4.4 硝酸纤维素膜CK-处为阴性对照（点健康水稻叶片汁液） ； A.3.4.5 抗体在使用前10min稀释； A.3.4.6 底物显色液要现配现用； A.3.4.7 阳性对照和阴性对照来自于水稻病叶，仅用于dot-ELISA检测； A.3.4.8 该试剂盒反应温度为438，最佳反应温度为37。 A.3.5 贮藏条件及保存期 试剂盒于28避光保存，冷冻保存更佳。该产品有效期为6个月。 DB36/ T 8862015 7 B B 附 录 B （资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病原、症状及传毒 B.1 学名 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）。 B.2 症状 南方水稻黑条矮缩病主要症状表现为：分蘖增加，叶片短阔、僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上现初蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起，不抽穗或穗小，结实不良，不同生育期染病后的症状略有差异。苗期发病，心叶生长缓慢，叶片短宽、僵直、浓绿，叶脉有不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色。根短小，植株矮小，不抽穗，常提早枯死。分蘖期发病，新生分蘖先显症，主茎和早期分蘖尚能抽出短小病穗，但病穗缩藏于叶鞘内。拔节期发病，剑叶短阔，穗颈短缩，结实率低。叶背和茎秆上有短条状瘤突。 B.3 传毒媒介和传毒 传毒媒介： 主要白背飞虱； 植株之间不相互传毒； 白背飞虱不经卵传毒； 白背飞虱获毒时间为30min；传毒为15min。 传毒：病毒初侵染源以外地迁入的带毒白背飞虱为主，冬后带毒寄主（如田间再生苗、杂草等）也可成为初侵染源；带（获）毒白背飞虱取食寄主植物即可传毒。 C C D DB36/ T 8862015 8 E D 附 录 C （资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病情划分指标 C.1 南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级指标 见表C.1。 表 C.1 南方水稻黑条矮缩病病情严重程度分级指标 级别 症状 0 级 健株，无症状 1 级 植株矮缩不明显，能抽穗，但穗小，结实率低，在中上部叶片基部可见纵向皱褶，在茎秆下部节间和节上可见蜡白色或黑褐色隆起的纵向排列小瘤突 2 级 植株矮缩丛生，高度不及正常株的 3/4，有的能抽穗，但相对抽穗迟而小，实粒少，粒重轻，半包在叶鞘里，剑叶短小僵直 3 级 植株分蘖增多丛生，矮缩明显，高度不及正常株 1/2，主茎及早生分蘖尚能抽穗，但穗头难以结实，或穗小，似侏儒病 4 级 植株严重矮缩，高度不及正常株的 1/3,后期不能抽穗，常提早枯死 C.2 南方水稻黑条矮缩病发生程度分级指标 见表C.2。 表 C.2 南方水稻黑条矮缩病发生程度分级指标 发生程度 轻发生 （1 级） 偏轻发生 （2 级） 中等发生 （3 级） 偏重发生 （4 级） 大发生 （5 级） 发生面积占种植面积比例，% 病丛率，% _