第7章-细菌的遗传分析.ppt

7.1 细菌细菌(xjn)的细胞和基因组（掌握）的细胞和基因组（掌握）7.2 大肠杆菌的突变型及其筛选（了解）大肠杆菌的突变型及其筛选（了解）7.3 细菌的接合与中断杂交染色体作图（掌握）细菌的接合与中断杂交染色体作图（掌握）7.4 F因子与性导（自学了解）7.5 细菌的转化与转导作图（掌握）细菌的转化与转导作图（掌握）7.6 细菌同源重组的机制（自学了解）第七章 细菌的遗传(ychun)分析第一页，共六十八页。本章主要以本章主要以大肠杆菌（大肠杆菌（E.coli）为材料为材料(cilio)(cilio)，讨论：，讨论：1 1、细菌的遗传物质的传递规律、细菌的遗传物质的传递规律 2 2、细菌染色体作图、细菌染色体作图 3、细菌同源重组的分子机制第二页，共六十八页。7.1 细菌细菌(xjn)的细胞和基因组的细胞和基因组7.1.1 细菌细菌(xjn)的细胞的细胞7.1.2 细菌的基因组细菌的基因组第三页，共六十八页。7.1.1 细菌细菌(xjn)的细胞的细胞E.coli 的菌落的菌落colonyE.coli 细胞细胞E.coli 的拟核的拟核 nucleoid第四页，共六十八页。细菌细菌:真细菌（真细菌（eubacteria）如大肠杆菌（如大肠杆菌（Escherchia coli）古细菌（古细菌（archaebacteria）如詹氏甲烷球菌如詹氏甲烷球菌 （Methanococcus jannaschii）多种形态存在：球菌（多种形态存在：球菌（cocci）杆菌（杆菌（bacilli）螺旋菌（螺旋菌（sprilla）等）等大小：随种类大小：随种类(zhngli)不同而异不同而异 杆菌一般长杆菌一般长15，宽，宽0.51；球菌以直径大小表示，一般为球菌以直径大小表示，一般为0.51；螺旋菌一般长为螺旋菌一般长为150，直径为，直径为0.51 第五页，共六十八页。细菌的基本结构：细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞壁、细胞膜、拟核、核糖体、细胞质及内含物；细胞质及内含物；细菌的特殊结构：细菌的特殊结构：如荚膜和鞭毛如荚膜和鞭毛遗传物质遗传物质环状环状核酸分子，也可称染色体。核酸分子，也可称染色体。单细胞单细胞菌落（菌落（clone）/菌株（菌株（strain）世代世代(shdi)时间短时间短，20分钟一代，容易得到生化突变型。分钟一代，容易得到生化突变型。原养型原养型prototroph 营养缺陷型营养缺陷型auxotroph细菌与细菌之间可有细菌与细菌之间可有遗传物质的交换遗传物质的交换第六页，共六十八页。经渗透处理经渗透处理(chl)的的E.Coli 释放出来的释放出来的DNA，其染色体长，其染色体长度度1200m细菌染色体细菌染色体不凝缩，没有着丝粒，也没有纺不凝缩，没有着丝粒，也没有纺锤体结构。锤体结构。细菌繁殖细菌繁殖：双链环形：双链环形DNA分子随着细胞分子随着细胞(xbo)伸长而采取伸长而采取二分分裂二分分裂（binary fission）的方）的方式分开。式分开。细菌染色体的复制与细胞二分细菌染色体的复制与细胞二分(r fn)分裂分裂第七页，共六十八页。7.1.2 细菌细菌(xjn)的基因组的基因组细菌染色体大多为细菌染色体大多为裸露裸露(lul)的的环状闭合环状闭合DNA双链双链，没有组蛋白和其，没有组蛋白和其他蛋白质结合，也不形成核小体结构。位于细胞内一个称为他蛋白质结合，也不形成核小体结构。位于细胞内一个称为“拟核拟核”（nucleoid）的区域中。这种结构有利于外源的区域中。这种结构有利于外源DNA的插入。细菌的染色的插入。细菌的染色体长度为体长度为25035 000m不等。不等。第八页，共六十八页。拟核结构拟核结构(jigu)电镜观察表明：电镜观察表明：拟核结构最显著的特征是其拟核结构最显著的特征是其DNA被被包裹压缩包裹压缩成一个成一个个有序的环状结构域个有序的环状结构域(loop domain)。大肠杆菌基因组长大肠杆菌基因组长 4639229 bp，在松弛状况，在松弛状况(zhungkung)：1 333 m长，长，而其细胞长度约为而其细胞长度约为2 m、宽宽1m，必须压缩最少，必须压缩最少1 000倍后才能装入细倍后才能装入细胞中。胞中。对对拟核成分拟核成分分析表明，分析表明，DNA占占80，其余为，其余为RNA和和蛋白质蛋白质。已分离出。已分离出HU、H1等等DNA结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构结合蛋白，类似于真核染色体的结构蛋白，可能与结构域的形成有关。大肠杆菌拟核中约有域的形成有关。大肠杆菌拟核中约有100个个结构域结构域，每个相当于，每个相当于40 kb，各个结构域具有相对的独立性各个结构域具有相对的独立性。染色体。染色体(拟核拟核)的结构域是超螺旋结构。这的结构域是超螺旋结构。这是是DNA双螺旋的螺旋轴盘绕而形成的螺旋，是双螺旋的螺旋轴盘绕而形成的螺旋，是DNA三级结构的一种形式。三级结构的一种形式。第九页，共六十八页。如用如用DNA酶处理酶处理大肠杆菌拟核，各结构域大肠杆菌拟核，各结构域DNA链将会断裂，超螺旋结构受到破链将会断裂，超螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。拟核的中央坏，变为松弛型结构。拟核的中央(zhngyng)部分为支架蛋白和部分为支架蛋白和RNA。若用若用RNA酶处理酶处理，拟核中，拟核中DNA的折叠结构即不能保持，说明的折叠结构即不能保持，说明RNA和支架蛋白是和支架蛋白是保持拟核结构的重要因素保持拟核结构的重要因素细菌染色体以高度细菌染色体以高度(god)组装的形式存在组装的形式存在第十页，共六十八页。E.coli的染色体为闭合双链环状的染色体为闭合双链环状DNA，长约，长约1333m.1997年测定完成年测定完成 E.coli K-12 MG1655菌株全基因组菌株全基因组:4639229（约（约4.7106）bp其中其中(qzhng)：87.8 编码蛋白质编码蛋白质 0.8 编码稳定性编码稳定性RNA 0.7%无编码功能的重复序列无编码功能的重复序列 11 属调节序列和具有其它功能属调节序列和具有其它功能在编码蛋白质序列：总共编码在编码蛋白质序列：总共编码4288种种已知和未知的蛋白质（可读框）已知和未知的蛋白质（可读框），其中，其中约约38功能不明功能不明。E.coli 的全基因组概况的全基因组概况(gikung)第十一页，共六十八页。在在K-12 MG1655菌株中，基因的平均长度为菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间基因之间的平均间隔约为隔约为118bp，但是菌株之间可能会有很大的差别。，但是菌株之间可能会有很大的差别。2005年报道了第二个菌株年报道了第二个菌株E.coli K-12 W3110基因组的完整序列。基因组的完整序列。比较比较K-12 MG1655菌株和菌株和K-12 W3110菌株，发现两者基因组大小并不菌株，发现两者基因组大小并不是一致是一致(yzh)的：的：K-12 W3110基因组大小为基因组大小为 4646332bp，基因总数为，基因总数为4464个个K-12 MG1655基因组大小为基因组大小为4639229bp，基因总数为，基因总数为4288个个E.coli 的全基因组概况的全基因组概况(gikung)第十二页，共六十八页。E.coli 的全的全基因基因组组仅显示部分基因仅显示部分基因注意图距单位：注意图距单位：min第十三页，共六十八页。7.2 大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)的突变型及其的突变型及其筛选筛选7.2.1 大肠杆菌的突变类型大肠杆菌的突变类型（1）合成代谢功能的突变型）合成代谢功能的突变型（anabolic functional mutants）野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂野生型品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，这称为有机物的功能，这称为合成代谢功能合成代谢功能（anabolic function）。）。这需要大量基因这需要大量基因(jyn)的表达，其中任何一个必需的基因的表达，其中任何一个必需的基因(jyn)发生了发生了突变都不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能突变都不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，这种突变型称为的实现，这种突变型称为营养缺陷型营养缺陷型。它们多是。它们多是条件致死突变条件致死突变（condition lethal mutation），因为能通过在基本培养基中添加所需），因为能通过在基本培养基中添加所需的有机成分使具有这种突变的细菌存活。的有机成分使具有这种突变的细菌存活。第十四页，共六十八页。（2）分解代谢功能的突变型）分解代谢功能的突变型（catabolic functional mutants）野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能使复野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能使复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子，如杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能将复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物。这些降解功能称为能称为分解代谢功能分解代谢功能（catabolic function）。）。同样，一系列降解功能的实现也需要许多有关基因的表达，其中任同样，一系列降解功能的实现也需要许多有关基因的表达，其中任何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。何一个基因的突变都会影响降解功能的实现。如如Lac突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为唯一碳源的突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本基本(jbn)培养基中，而野生型培养基中，而野生型Lac细菌都能利用乳糖。细菌都能利用乳糖。Lac表型可表型可能是因为能是因为lacZ或或lacY基因发生突变，分别产生了基因型为基因发生突变，分别产生了基因型为lacZ或或lacY的突变型菌株。这种菌株显然亦是的突变型菌株。这种菌株显然亦是条件致死突变型条件致死突变型。第十五页，共六十八页。（3）抗性突变型）抗性突变型（resistant mutants）细菌由于某基因的突变而对某些细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体噬菌体或或抗生素抗生素产生抗性（产生抗性（resistant）。）。对噬菌体的抗性对噬菌体的抗性突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬突变往往是以某种方式改变细菌的膜蛋白，从而某种噬菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低菌体不能吸附或吸附在这种突变细菌上的能力降低(jingd)。对抗生素产生抗性对抗生素产生抗性的突变是一个严重的公害问题，所以研究得也较的突变是一个严重的公害问题，所以研究得也较深入，而且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。如对链霉素抗深入，而且细菌对各种抗生素的抗性机制各不相同。如对链霉素抗性突变的细菌是由于核糖体的性突变的细菌是由于核糖体的30S亚基的亚基的S12蛋白变异，链霉素能和蛋白变异，链霉素能和敏感细菌（野生型）的敏感细菌（野生型）的S12结合，从而使翻译过程发生差错或者使结合，从而使翻译过程发生差错或者使翻译过程的启动作用失效。而抗链霉素突变型的翻译过程的启动作用失效。而抗链霉素突变型的S12不再和链霉素不再和链霉素结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的结合，因此抗性突变细菌可以在链霉素存在的情况下，进行正常的翻译作用和正常的分裂繁殖。翻译作用和正常的分裂繁殖。第十六页，共六十八页。第十七页，共六十八页。7.2.2 细菌细菌(xjn)的培养与突变型筛选的培养与突变型筛选影印培养法影印培养法第十八页，共六十八页。7.3 细菌的接合与中断细菌的接合与中断(zhngdun)杂交染色体杂交染色体作图作图细菌中，大肠杆菌（细菌中，大肠杆菌（E.coli）是最为广泛的遗传学实验材料）是最为广泛的遗传学实验材料细菌的遗传重组细菌的遗传重组(zhn z)可以通过三种途径来实现：可以通过三种途径来实现：（1）接合（接合（conjugation）：细菌细胞经直接接触，把一个细菌细胞经直接接触，把一个 细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体），从而实现遗传重组。接合能传递大段的从而实现遗传重组。接合能传递大段的DNADNA，在细菌的，在细菌的 遗传重组中是效率最高的遗传重组中是效率最高的。（2）转化（转化（transformation）：是指游离的细菌：是指游离的细菌DNA片段片段 被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。被吸收到不同的细菌细胞内（受体）。（3）转导（转导（transduction）：是指一种细菌的：是指一种细菌的DNA片段经片段经 过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。过温和的或经有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌。第十九页，共六十八页。7.3.1 细菌细菌(xjn)的接合的接合注意注意(zh y)实验设计的严谨实验设计的严谨性性1.严格的对照严格的对照control2.多重营养缺陷型多重营养缺陷型1946年，年，Lederberg和和Tatum的实验的实验结果结果(ji gu)说明了什么？说明了什么？结果结果A+B混合培养后的菌液涂布混合培养后的菌液涂布在基本培养基上可以在基本培养基上可以1/107的频率的频率长出原养型菌落，而单独的长出原养型菌落，而单独的A和和B则不能在基本培养基上生长。则不能在基本培养基上生长。第二十页，共六十八页。1.A、B两个菌株之间发生杂交导致某种形式的遗传重组？两个菌株之间发生杂交导致某种形式的遗传重组？2.原养型菌落的出现不一定原养型菌落的出现不一定(ydng)是基因型的改变，可能是培养上的是基因型的改变，可能是培养上的互补，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系互补，即一些物质从一个品系的细胞中泄漏出来而被另一个品系的细胞所吸收？的细胞所吸收？3.还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个品系间还是另一种可能，是基因型的改变，但不一定是由于两个品系间的杂交，而是一个品系的的杂交，而是一个品系的DNA片段逸出细胞后，携带着相应的基片段逸出细胞后，携带着相应的基因（如因（如met+bio+）进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而产）进入另一个品系的细胞，因为这种转化作用而产生了上述的原养型？生了上述的原养型？实验结果可能实验结果可能(knng)的解释：的解释：第二十一页，共六十八页。澄清上述问题澄清上述问题U型管实验：型管实验：1950年年Davis：U型管实验，有力地支持了细菌菌株杂交的判断。型管实验，有力地支持了细菌菌株杂交的判断。他用一个他用一个U型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分隔为相等的两臂。型管，在底部用一块过滤器隔开，把管分隔为相等的两臂。滤器的孔很小，细菌不能通过滤器的孔很小，细菌不能通过(tnggu)，只有象，只有象DNA这样这样0.1微米的游离微米的游离分子、培养液和营养物质可以通过分子、培养液和营养物质可以通过(tnggu)。U型管两臂中分别为营养缺陷型品系型管两臂中分别为营养缺陷型品系A和和B，使它们繁殖到饱和状，使它们繁殖到饱和状态，同时在态，同时在U型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培养液充分型管的一端交替地吸和压，使两臂中的培养液充分混合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在混合，但细菌的两个品系的细胞却不会接触。在U型管中培养一型管中培养一些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能些时间后，再从两端分别取细菌进行培养，没有发现一个细菌能在基本培养基上生长。在基本培养基上生长。第二十二页，共六十八页。两种细胞之间的物理两种细胞之间的物理(wl)接触是接合重组的必要条件接触是接合重组的必要条件大肠杆菌大肠杆菌F和和F细胞之间细胞之间通过通过菌毛菌毛(pilus)进行接合进行接合细菌的接合细菌的接合第二十三页，共六十八页。F 因子与细菌因子与细菌(xjn)的接合的接合F因子：因子：fertility factor致育因子或性因子。致育因子或性因子。是游离于细菌染色体外的是游离于细菌染色体外的闭合闭合(b h)环状环状DNA，但有时，但有时也可整合至染色体上也可整合至染色体上F细胞：细胞：含有含有(hn yu)F因子，供因子，供体体F细胞：细胞：不含不含F因子，受体因子，受体第二十四页，共六十八页。F 因子因子(ynz)的结的结构构F因子包含因子包含(bohn)3个区个区1.原点原点 origin：转移的：转移的起点起点2.致育基因致育基因：编码生成菌毛的蛋白，形成：编码生成菌毛的蛋白，形成接合管接合管3.配对区配对区：与染色体多处区域：与染色体多处区域配对配对，可使，可使 F 因子整合至因子整合至染色体上染色体上第二十五页，共六十八页。高频高频(o pn)重组重组 high frequency of recombination，HfrF 与与F 之间杂交只有之间杂交只有F因子的传递，而细菌的染色体并不转移，因此尽管因子的传递，而细菌的染色体并不转移，因此尽管F因子转移频因子转移频率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约是每百万个细胞中发生一次重组，率很高，但两者染色体之间重组频率很低，大约是每百万个细胞中发生一次重组，因此因此F 品系称为品系称为 低频重组（低频重组（low frequency recombination，Lfr）。F因子也可以整合到细菌染色体中，像这种带有一个整合的因子也可以整合到细菌染色体中，像这种带有一个整合的F 因子的品系则称因子的品系则称为为高频高频(o pn)重组（重组（high frequency recombination，Hfr），因为，因为Hfr细细胞与胞与F 细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给细胞接合后可以将供体染色体的一部分或全部传递给F 受体受体，当供，当供体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，体和受体的等位基因带有不同标记时，在它们之间就可以发生重组，重组频率可达到重组频率可达到10-2以上，故称以上，故称Hfr品系。品系。F因子：因子：整合的整合的 F 因子偶尔也能离开细菌染色体回到细胞质中，少数情况下，因子偶尔也能离开细菌染色体回到细胞质中，少数情况下，脱离染色体时，可以携带寄主的少数基因，形成环状的脱离染色体时，可以携带寄主的少数基因，形成环状的F。这种。这种含有细含有细菌染色体基因的菌染色体基因的 F 因子叫做因子叫做F（F prime）因子）因子第二十六页，共六十八页。根据根据F F因子存在的状态不同而将细菌分为：因子存在的状态不同而将细菌分为：F 菌株：缺乏菌株：缺乏 F 因子。因子。F 菌株：具有游离的菌株：具有游离的 F 因子。因子。Hfr菌株：菌株：F 因子整合因子整合(zhn h)到宿主染色体上。到宿主染色体上。F菌株：带有部分宿主染色体的游离菌株：带有部分宿主染色体的游离 F 因子。因子。由此也决定了它们之间的接合性能和遗传重组的频率：由此也决定了它们之间的接合性能和遗传重组的频率：F F，不能接合，因为相互排斥。，不能接合，因为相互排斥。F F，不能接合，因无，不能接合，因无 F 因子不能形成因子不能形成(xngchng)接合管。接合管。F F，可接合并将受体，可接合并将受体F 转化为转化为F，但为低频重组。，但为低频重组。Hfr F，可接合，受体一般为，可接合，受体一般为F，但为高频重组。，但为高频重组。F F，可接合，并将受体，可接合，并将受体F 转变为转变为F，并对所携带的宿主基因是高频重组。，并对所携带的宿主基因是高频重组。第二十七页，共六十八页。细菌细菌(xjn)重组的特点重组的特点Hfr 与与F 细胞之间接合，通常只细胞之间接合，通常只有部分的供体染色体有部分的供体染色体DNA进入受体。内外进入受体。内外(niwi)基基因形成因形成部分二倍体部分二倍体部分部分(b fen)二倍体区发生二倍体区发生奇数次奇数次交换交换导致线性染色体，该导致线性染色体，该细胞不能存活细胞不能存活部分二倍体区发生部分二倍体区发生偶数次交换偶数次交换形成形成重组的环状染色体，该细胞可重组的环状染色体，该细胞可存活存活细菌重组的特点：细菌重组的特点：基因转移是基因转移是单方向的单方向的，仅供体，仅供体受体受体这与真核生物减数分裂中染色单体间交换导致的重组不同这与真核生物减数分裂中染色单体间交换导致的重组不同第二十八页，共六十八页。7.3.2 中断杂交中断杂交(zjio)与重组作图与重组作图（1）中断杂交（）中断杂交（Interrupted-mating experiment）实验原理）实验原理 Wollman和和Jacob想了解想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把它的基因转入品系在杂交时，什么时候把它的基因转入F细胞，进行了一些实验，其中中断杂交实验对细胞，进行了一些实验，其中中断杂交实验对E.coli的遗传的遗传(ychun)研究作出了重大的突破。研究作出了重大的突破。Hfr 菌株菌株 thr+leu+azir tonr lac+gal+strs F-菌株菌株 thr leu azis tons lac gal strrazi 叠氮化钠；ton:噬菌体T1；str:链霉素；lac:乳糖(r tn)；gal:半乳糖(r tn)第二十九页，共六十八页。接合接合采用采用Hfr菌株为菌株为strs，F菌株为菌株为strr，混合通气培养混合通气培养(细菌与细细菌与细 菌开始接触菌开始接触)形成形成(xngchng)接合管。接合在完全培养基上进行，培养基以接合管。接合在完全培养基上进行，培养基以 葡萄糖为碳源，不加链霉素、叠氮化钠和噬菌体葡萄糖为碳源，不加链霉素、叠氮化钠和噬菌体T1。中断接合中断接合在接合处理后的不同时间搅拌（在接合处理后的不同时间搅拌（断开接合管断开接合管,使配对的细菌使配对的细菌 分开分开）和提取样品，从而获得不同接合时间（）和提取样品，从而获得不同接合时间（min）的细菌样品。）的细菌样品。杀死杀死Hfr将不同接合时间的细菌样品稀释后接种在将不同接合时间的细菌样品稀释后接种在含有链霉素含有链霉素的完的完 全培养基上，结果对链霉素敏感的全培养基上，结果对链霉素敏感的Hfr菌株被杀死，只有菌株被杀死，只有F 细菌存活。细菌存活。检查检查F 细菌所含供体基因细菌所含供体基因将获得不同接合时间的将获得不同接合时间的F 细菌样品都细菌样品都 分别接种在含叠氮化钠，含噬菌体分别接种在含叠氮化钠，含噬菌体T1，含乳糖而无葡萄糖，含半乳糖，含乳糖而无葡萄糖，含半乳糖 而无葡萄糖的培养基上，统计各供体基因出现的频率。而无葡萄糖的培养基上，统计各供体基因出现的频率。作图作图根据各基因出现时间先后的顺序将它排列在染色体上，并标明根据各基因出现时间先后的顺序将它排列在染色体上，并标明 出现的时间，而各基因出现时间的差数就是它们之间的距离，这种图出现的时间，而各基因出现时间的差数就是它们之间的距离，这种图 距是以时间（距是以时间（min）为单位的，有别于真核生物遗传作图时以厘摩）为单位的，有别于真核生物遗传作图时以厘摩 （cM）为单位。）为单位。Hfr 菌株菌株 thr+leu+azir tonr lac+gal+strs F-菌株菌株 thr leu azis tons lac gal strr第三十页，共六十八页。中断杂交中断杂交(zjio)结结果：果：第三十一页，共六十八页。这种根据供体基因进入这种根据供体基因进入(jnr)(jnr)受体细胞的受体细胞的顺序和时间顺序和时间绘制连锁图的绘制连锁图的技术，称为技术，称为中断杂交技术中断杂交技术（Interrupted mating technique）。营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择重组型排除亲代型的营养缺陷型突变基因在杂交试验中有选择重组型排除亲代型的作用，所以称为被选择的标记基因。作用，所以称为被选择的标记基因。结果发现结果发现HfrHfr的未选择性标记基因进入的未选择性标记基因进入F F所需时间：所需时间：分钟分钟 转移的转移的HfrHfr基因基因 9 0 9 azir 11 azir tonr 18 azir tonr lac+25 azir tonr lac+gal+（2）中断）中断(zhngdun)杂交作图杂交作图第三十二页，共六十八页。F 因子因子(ynz)在细菌染色体上有在细菌染色体上有许多插入位点许多插入位点，而，而且其插入片段的取向不同而形成不同的且其插入片段的取向不同而形成不同的Hfr品品系。用这些不同系。用这些不同Hfr菌株进行中断杂交实验，菌株进行中断杂交实验，则它们的则它们的转移起点转移起点、基因转移顺序基因转移顺序以及以及转移转移方向方向都不相同都不相同E.coli K12的部分遗传图的部分遗传图注意图距单位：注意图距单位：min第三十三页，共六十八页。（3）重组）重组(zhn z)作图作图基因距离较远基因距离较远用中断杂交作图是很有效的，但是用中断杂交作图是很有效的，但是基因距离较基因距离较近近，基因间转移时间在，基因间转移时间在2 min之内，那么仅用中断杂交实验进行基之内，那么仅用中断杂交实验进行基因定位就不十分精确可靠因定位就不十分精确可靠(kko)。这时可用传统的这时可用传统的重组作用法重组作用法（recombination mapping）例如：例如：根据中断杂交试验（时间单位法），已知根据中断杂交试验（时间单位法），已知lac 和和 ade 这两这两个基因是紧密连锁的，在某些品系的杂交中个基因是紧密连锁的，在某些品系的杂交中 ade基因是后于基因是后于lac 进入进入F细胞的。细胞的。问两基因间的距离为多少？问两基因间的距离为多少？第三十四页，共六十八页。以下杂交：以下杂交：Hfr lac ade strs F lac ade strr 重组子重组子 ade strr在在含有链霉素的基本培养基含有链霉素的基本培养基上，上，Hfr细菌被杀死，因其为细菌被杀死，因其为strs未杂交的未杂交的F lacadestrr 也死亡，因为是腺嘌呤缺陷型也死亡，因为是腺嘌呤缺陷型所以选出来的重组子都是所以选出来的重组子都是 ade strr因为因为ade 是在是在lac之后之后(zhhu)进进F细胞，所以我们选出的细胞，所以我们选出的Fade strr，一定是由同时得到，一定是由同时得到lac和和ade的的下图显示了该杂交组合可能的交换情形下图显示了该杂交组合可能的交换情形第三十五页，共六十八页。Hfr lac adeF lac adeHfr lac adeF lac adeHfr lac adeF lac adeHfr lac adeF lac adeF lac adeF lac adeF lac adeF lac adelac和和ade之间未交换之间未交换(jiohun)lac和和ade之间单交换之间单交换(jiohun)之一，产生重组子，之一，产生重组子，但不能生长，因为是腺嘌呤缺陷型但不能生长，因为是腺嘌呤缺陷型lac和和ade之间单交换之二产生之间单交换之二产生(chnshng)重重组子组子lac和和ade 之外双交换，但产生的之外双交换，但产生的不是不是lac和和ade间的重组子间的重组子第三十六页，共六十八页。计算计算(j sun)lac 和和 ade 之间的重组率之间的重组率1、选择在腺甘酸（、选择在腺甘酸（ade）缺乏的培养基上生长的类型。）缺乏的培养基上生长的类型。它们表明它们表明ade基因已转入细胞。基因已转入细胞。2、选出的、选出的lacade类型即是重组类型即是重组(zhn z)子，因为位于后面的子，因为位于后面的 ade都已进入，表明都已进入，表明lac也已进入，而也已进入，而lacade表型表型 就是供体受体就是供体受体lac、ade两个基因间发生交换的结果。两个基因间发生交换的结果。可用此来计算重组值。可用此来计算重组值。所以，它们的重组率，也可代表基因间的距离所以，它们的重组率，也可代表基因间的距离RF第三十七页，共六十八页。时间图距与重组时间图距与重组(zhn z)率图距的关率图距的关系系 用时间单位法测得这两个基因间的距离是用时间单位法测得这两个基因间的距离是1分钟，用重组法测分钟，用重组法测得的重组值是得的重组值是20。用重组率（。用重组率（RF）所测得的基因间距离与用）所测得的基因间距离与用中断杂交中断杂交(zjio)以时间（以时间（T）为单位的基因间距离基本上是一致）为单位的基因间距离基本上是一致的。两个值的比：的。两个值的比：RF:T约等于约等于20，即它们之间关系大约是，即它们之间关系大约是1 min等于等于20个图距单位（个图距单位（cM）。）。所以大致上是，所以大致上是，1个时间单位个时间单位（1分钟）相当于分钟）相当于20重组值重组值。大肠杆菌染色体全长约大肠杆菌染色体全长约100 min，含，含4106核苷酸对，所以总图核苷酸对，所以总图距相当于距相当于2 000 cM，故，故1 cM2 000 bp。这种。这种接合重组作图在短接合重组作图在短距离内是有效的距离内是有效的。如相距。如相距2 min以上的就有可能表现不连锁。同以上的就有可能表现不连锁。同时这种时这种接合重组不产生交互重组类型接合重组不产生交互重组类型，所以用这种方法得出的，所以用这种方法得出的图距图距和减数分裂生物中所确定的图距不同和减数分裂生物中所确定的图距不同。第三十八页，共六十八页。7.5 细菌的转化细菌的转化(zhunhu)与转导作与转导作图图7.5.1 细菌的转化细菌的转化(zhunhu)与与作图作图7.5.2 细菌的转导与作图细菌的转导与作图第三十九页，共六十八页。7.5.1 细菌细菌(xjn)的转化作图的转化作图细菌的转化细菌的转化:DNA直接转入受体细胞的过程。直接转入受体细胞的过程。环状环状DNA转化：整体进入整合。转化：整体进入整合。片段片段DNA转化：单链进入整合。转化：单链进入整合。在实施以上步骤时：在实施以上步骤时：一般一般(ybn)要对受体细胞进行处理要对受体细胞进行处理：化学处理或用强电场处理（：化学处理或用强电场处理（electroporation，电穿孔）。，电穿孔）。目的目的是增加受体细胞膜对供体是增加受体细胞膜对供体DNA的可透性。的可透性。制备感受态细胞制备感受态细胞（competent recipient cell）：能吸取）：能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞。在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因叫做感受态细胞。在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子（子（competence factor），可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶），可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶（translocase），它参与），它参与DNA的吸收。的吸收。第四十页，共六十八页。转化过程可以分为几个步骤：转化过程可以分为几个步骤：双链双链DNA分子和细胞表面感受位点可逆性的结合。分子和细胞表面感受位点可逆性的结合。供体供体DNA片段被吸入受体细胞。片段被吸入受体细胞。侵入受体细胞的供体双链侵入受体细胞的供体双链DNA转变成单链形式，转变成单链形式，其中一条链被降其中一条链被降解解。未被降解的一条链部分或整个地与受体未被降解的一条链部分或整个地与受体DNA链进行交换链进行交换(jiohun)重组，形成重组，形成杂合的杂合的DNA分子分子（heteroduplex DNA）。）。这种杂合的这种杂合的DNA复制以后，形成一个亲代类型（受体）的复制以后，形成一个亲代类型（受体）的DNA和一和一个重组类型的个重组类型的DNA并导致转化细胞的形成与表达。并导致转化细胞的形成与表达。第四十一页，共六十八页。通过转化确定基因连锁、基因顺序和图距：通过转化确定基因连锁、基因顺序和图距：在转化过程中，在转化过程中，DNA小片段小片段受体。受体。相距很远的二个基因很难同时存在于一个相距很远的二个基因很难同时存在于一个DNA片段中，若两个基因的二片段中，若两个基因的二个片段同时进入受体，一般不能同时进行转化的，按照个片段同时进入受体，一般不能同时进行转化的，按照(nzho)概率定概率定律，两个片段同时转化的概率是它们的单独转化的概率的乘积，这种律，两个片段同时转化的概率是它们的单独转化的概率的乘积，这种概率是很低的。概率是很低的。两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，片段中，并同时整合到受体染色体里并同时整合到受体染色体里共转化（共转化（cotransformation），），共转共转化的基因一般是连锁的化的基因一般是连锁的。第四十二页，共六十八页。共转化频率的计算：共转化频率的计算：例：例：在一个转化实验中，用在一个转化实验中，用a+b+品系的供体品系的供体DNA，转化基因型，转化基因型 ab 的受体品系，得到的受体品系，得到(d do)的转化类型和数目：的转化类型和数目：a+b+307 a+b 215 a b+278转化子的总数是转化子的总数是800,（用（用a+作为选择作为选择(xunz)）问问 b位点与位点与a位点共转化的频率是多少？位点共转化的频率是多少？解：解：a+基因与基因与b+基因共转化的频率用整个基因共转化的频率用整个a+转化子数目以及转化子数目以及 a+和和b+转化子数目的值来计算。转化子数目的值来计算。a+b+共转化子数共转化子数307，a+转化子有两种类转化子有两种类a+b+（307）和）和a+b(215)总数是总数是522。a b+类型与所提问题不相关，因为对于类型与所提问题不相关，因为对于a+来说它们不是转化子，所以：来说它们不是转化子，所以：a+和和b+共转化共转化的频率是：的频率是：307/522 10058.8%共转化率共转化率 100ab共转化子数目共转化子数目a转化子数目转化子数目第四十三页，共六十八页。用共转化确定用共转化确定(qudng)基因顺序：基因顺序：例如：例如：如果基因如果基因p和和q常常一起传递到受体，这样两个基因可能是相常常一起传递到受体，这样两个基因可能是相对地紧密连锁，同样基因对地紧密连锁，同样基因q和和o也经常一起传递到受体细胞。这两也经常一起传递到受体细胞。这两个基因也是彼此连锁的。个基因也是彼此连锁的。两种可能的排列顺序：两种可能的排列顺序：poq 和和 pqo。若顺序是若顺序是poq，这样，这样p和和o必将共转化必将共转化,因为它们比因为它们比p和和q靠得更靠得更紧密。紧密。若顺序是若顺序是pqo，这样，这样p和和o将很少或根本不发生共转化，因为它将很少或根本不发生共转化，因为它们离得相对较远。们离得相对较远。结果表明没有结果表明没有p和和o的共转化，说明基因顺序肯定是的共转化，说明基因顺序肯定是pqo第四十四页，共六十八页。基因顺序和图距的计算基因顺序和图距的计算(j sun)：例如：例如：用枯草杆菌（用枯草杆菌（Bacillus subtilis）的一个菌株）的一个菌株trp2 his2tyr1作供体，作供体，提取提取DNA，向受体，向受体trp2 his2 try1 菌株进行了转化，得到转化菌株进行了转化，得到转化子类型如下：子类型如下：问问3个基因间的距离和排列个基因间的距离和排列(pili)顺序如何？顺序如何？第四十五页，共六十八页。基因基因(jyn)顺序和图距的计算：顺序和图距的计算：注意：注意：计算计算trp2和和his2之间的重组值时，之间的重组值时，685个个trp2 his2是与供体是与供体trp2 his2这这2个基因之间未发生交换的细胞个基因之间未发生交换的细胞(xbo)数，因此不能统计在内数，因此不能统计在内trp2 his2 tyr1344013第四十六页，共六十八页。供体供体DNA片段片段(pin dun)受体菌受体菌染色体染色体DNA1 2 31 2 3 发生发生交换产生重组子：交换产生重组子：1 2 3发生发生交换