DB44∕T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感（H5亚型）的H1和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程(广东省).pdf

ICS 65.020.30 B 41 备案号25946-2009DB44 广东省山巳T目，万标准DB44/T 664-2009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型的HI和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程HI and mu1tiplex RT-PCR for detection and differentiation between GPMV and H5 subtype of AIV in goose 2009-08-06发布2009-12-01实施广东省质量技术监督局发布目IJ1=1 本标准附录A、附录B和附录C为规范性的附录。本标准由广东省农业厅提出井归口。本标准起草单位:华南农业大学兽医学院。DB44/T 664-2009 本标准主要起草人:任涛、徐成刚、罗开健、曹伟胜、袁少华、廖明、张桂红、辛朝安。DB44/T 664-2009 鹏的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的HI和多重RT-PCR鉴别诊断技术操作规程1 范围本标准规定了应用血凝抑制试验(HI试验)和反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)技术鉴别诊断鹅的禽副粘病毒病与H5禽流感的材料准备、操作方法及结果判定。本标准适用于鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的鉴别诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的号|用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GS/T 18936 高致病性禽流感诊断技术。3 术语和定义GB/T 18936确定的以及下列术语和定义适用于本标准。3. 1 鹏的禽副粘病毒病是近年来的新病，是由鹉的禽副粘病毒(GooseParamvxovirus ，GPMV)引起的鹅的一种高发病率、高死亡率的烈性传染病，以消化道充血、出血为特征的急性传染病。3. 2 高致病性禽流感High1y Pathogenic Avian Tntluenza Virus 是由正主古病毒科流感病毒属的禽类高致病性A型流感病毒(主要为H5亚型)引起的一类急性、高接触性的禽类烈性传染病，具有高发病率和高死亡率的|临床特征。3. 3 红细胞凝集试验是指感染禽类的某些病毒与红细胞发生结合出现红细胞凝集的现象。3. 4 血;疑效价是指红细胞凝集试验中出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以log2为单位。3.5 红细胞凝集抑制试验即HI试验，是指使用特异性免疫血清可以抑制某些感染禽类的病毒与红细胞凝集的现象。3.6 血;疑抑制效价是指HI实验中不出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以log2滴度为单位。3. 7 四单位抗原根据抗原HA效价结果进行稀释，配制出血凝效价为2个log2单位的抗原稀释液。DB44/T 664-2009 3. 8 反转录聚合目酶每链反应R巳盯 ve阳e创rse是指利用反转录酶将病毒RN阳A反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增的检测方法。RT-PCR使RNA检测的敏感性提高了几个数量级，使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。3. 9 特异性引物是指针对特定模板DNA基因片段设计的一小段与DNA片段两侧互补的人工合成寡核昔酸。3.10 无RNase水是指除去RNA酶活性的双亲水。4 HI试验4.1 仪器设备及材料4. 1. 1仪器设备:离心机，最大转速至少应达到5000g;微量振荡器96孔V型板5L50L八道移液器。4.1.2 材料lmL、10mL吸管10mL离心管2mL一次性注射器。pH值为7.4，浓度为O.01mollL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)3.8%拧撮酸纳抗凝剂1%鹅红细胞悬液GPMV和HPAIV抗原、标准血清以及阴性血洁。试剂的配方见附录B4. 2 采样与样品制备:每只鹅心脏或翼下采血lmL2mL静置或离心，待血洁忻出后备用。4.3操作规程4.3.1 HA效价的测定在96孔V型反应板的l孔12孔均加入25LPBS，换吸头:吸取GPMV或HPAIV25L于第l孔中混匀后吸出25L至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸取25L弃去并换吸头;同样，换吸头后取25LAIV进行在另外一排孔中进行同样的操作，有必要的话，每种抗原可以重复做一排:每孔加入25LPBS; 吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25L;置于微量振荡器上振荡30s，室温(200C250C)静置40min后观察结果:对照孔C121U红细胞应成明显纽扣状沉到孔底，此时根据完全血凝的最高稀释倍数得出HA效价。4.3.2 四单位抗原校正用微量移液器向反应板的2孔6孔加PBS25L，第1孔不加:根据4.3.1HA效价的测定结果配制四单位GPMV及HPAIV抗原，用微量移液器吸取25L四单位抗原分别加入第1孔、第2孔中，从第2孔开始混匀后吸出25L至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去2.5L;每孔加入2.5LPBS;用微量移液器再吸取1%鹅红细胞悬液依次加入l孔6孔，每孔2.5L;于微量振荡器上振荡30s;室温(200C250C)静置40min后观察结果:如第l、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔红细胞产生75%的沉淀，第6孔为对照完全沉淀，出现以上结果，表明所配四单位抗原准确，校正成立。否则，重新测HA效价并且配制四单位抗原，然后再做校正直至出现以上结果。4. 3. 3 HI 试验每排孔检测l份血洁，同时设立阳性血清对照和阴性血清对照，试验步骤如下:在微量反应板的1孔11孔加入25LPBS，第12孔加入50LPBS;吸取待检血清25L置于第1孔中，1昆匀后吸取25L于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25L，弃去1孔11孔均加入4.3. 2中配制好的四单位抗原25L，室温(200C250C)静置至少30mino吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25L;置于微量振荡器上振荡30s，混合均匀，室温(200C250C)静置40min后观察结果。4. 4 结果判定将反应板倾斜成450角，只有抗原对照孔(1日U红细胞将成明显的纽扣状沉淀，红细胞对照孔(12孔)成泪滴状流淌，才可以进行HI结果的判定。同时，只有阴性对照孔血清效价不大于210品，阳性对照孔血清2 DB44/T 664-2009 误差不超过1个10g二，试验结果才有效。HI效价小于或等于310g二判定HI试验阴性HI效价等于41og判定为可疑，需重复试验HI效价大于或等于51og判定HI试验阳性。5 RT-PCR实验5. 1 仪器设备及材料5. l. 1仪器设备:生物安全拒PCR仪:电泳仪:凝胶成像系统;小型台式高速低温离心机:水浴锅。5. l. 2耗材:微量移i夜器(配有滴头);0.5mL或O.2mL PCR反应管:一次性手套1.5mL灭菌离心管。5. 2 材料5. 2. 1 RNA提取试剂:氯仿(分析纯或以上试剂);DEPC处理的无RNase去离子水:异丙醇(分析纯或以上试剂);无RNase水配制的75%乙醇:反转录随机引物(pd(N) 6, 20Jlmol/L)、AMV反转录酶、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)Ex-Taq酶2.5mmol/LdNTP 1昆合物:凝胶加样缓冲液1XTri s-jj(乙酸电泳缓冲液:10mg/mL澳化乙皖(EB)l. 0%琼脂糖凝胶(含O.5g/mL EB) DNA分子量标准(DL2000)PCR扩增引物(浓度分别为25pmol/L，见附录B.l)。试剂的配制见附录Bo5. 2. 2病料的处理:按照国标GB/T18936的2.1进行。5.3 操作规程5.3.1核酸抽捏取250L5.2.2中制备的病料组织上清液，置于一灭菌的1.5mL离心管中，同时设立阴性对照及鹅的禽副粘病毒、H5亚型禽流感病毒阳性对照，再分别加入冰冷的裂解液750L，剧烈混合样品15s，室温放置5mino加入200L氯仿，反转离心管混合2次，剧烈混合10s，4 oC下以10000g离心15min;吸取上层水相500L加入另一支灭菌的1.5mL离心管中，加入异丙醇500L，4 oC放置10mi口，4C下以10000g离心15min;小心弃去全部上清液，加入1mL 75%乙醇，上下轻缓反转两次，4 oC下以10000g离心5min;弃去全部上洁，在超净工作台放置5min10min，至管壁上无肉眼可见液体，即制得总RNA;加入DEPC水溶液20L，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，冰浴保存备用，若需长期保存须放置在-70oC条件下。5.3.2 RT 在一个1.5mL灭菌离心管中依次加入5XAMV缓冲液2此，2.5mmol/LdNTP混合物2此，p d (N) 6 1 II L, RNasin 0.25此，AMV反转录酶2.町，轻缓混匀:加入6.25L 5. 3. 1制得RNA;于室温放置10min 放入42oC水浴中1h，然后冰浴2min，所得的反应液即为反转录产物cDNAocDNA可置于一200C保存或直接做PCR。5.3.3 PCR 在一个O.5mL或O.2mL灭菌PCR管中依次加入:无RNase水19.3此，10XEX-Taq援j中液2.5此，dNTP混合物11lL，引物PP1，PP2, PP3和PP4各为O.5吐，EX-Taq酶O.2L (2.5川，轻缓混匀。加入1L5. 3. 2步骤中制备中的cDNA，轻缓泪匀，500g离心10秒。置于PCR仪中先94oC, 3 min进行预变性，再按94oC 40 s, 53 oC 30 s, 72 oC 30 s，运行30个循环，最后72oC延伸7mino同时设立阳性对照和阴性对照。PCR产物的检测:待PCR反应结束后，每个PCR管取5L反应液于l.0%琼脂糖凝胶(含O.5g/mL EB) 中，同时加入DNA分子量标准(DL2000) 5L作为参照，在120V恒压下电泳20mi口，取凝胶置于凝胶成像仪中观察或成像。注RT-PCR操作程序要求在超净工作台中进行，并使用一次性手套，离心管、PCR反应管及敝量加样吸头等应使用一次性塑料制品，使用前经121C高压30rninj(菌，核酸抽提进行前，用酒精棉将二L作台和移液器擦拭遍。5.4 结果判定当阴性对照无任何DNA扩增条带或在250bp附近和500bp750bp间不出现DNA扩增带，GPMV阳性对照在250bp附近位置和H5亚型AIV阳性对照在500bp750bp间位置上出现DNA扩增条带时，若被检样品在250bp附近的位置上出现DNA扩增，判断为GPMV阳性，记为(GPMV+)若被检样品在500bp750bp间的位置上出现一条DNA扩增，判断为AIV-H5阳性，记为(AIV+)0检测结果凝胶电泳图参见附录A.2。3 DB44/T 664-2009 注:废弃澳化乙统或含有1臭化乙链的电泳缓冲液、凝胶等要集中回收处理。4 附录A(规范性附录)引物序列及RT-PCR检测结果判断图示A. 1 PCR特异性引物A. 1. 1 PCR特异性引物核昔酸序列PP1: 5 GCT CGG TTC GTC GAC AAT CT 3 (20口t)PP2: 5 GGG ATC GCG CTT GTT TCA A 3 (19丑t)PP3: 5 TGG CAG GGA ATG GTA GAT G 3 (19日t)PP4: 5 TAG GGA ACT CGC CAC TGT TG 3 (20日t)DB44/T 664-2009 人工合成引物，使用前利用灭菌的DEPC处理水稀释至25pmol/队，分装成小量放置于-200C保存备用，避免反复冻融OA.1.2 PCR特异性引物扩增的目的基因PPl/PP2为针对GPMVNP基因部分片段的特异性引物，预计扩增片段约为250bp;PP3/PP4为针对H5亚型AIVHA基因部分片段的特异性号|物，预计扩增片段约为541bpoA. 2 PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图图B.1PP1/PP2为引物RT-PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图M:分了星;标准DNAMarker DL2000 1: GPMV阳性对照(+) 2: GPMV叫疑被检样品3: NDV 4: H5亚型AIV5: H9 W型AIV6:阴性对照(一)bp 2000 1000 750 岳口025口10口图B.2 PP3/PP4为引物RT-PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图M:分了-量标准DNAMarker DL2000 1: H5亚型AIV阳性对照(+) 2: H5亚型AIV叫疑被检样品3: H9 W型AIV4: GPMV 5: NDV 6:阴性对照(一)DB44/T 664-2009 附录B(规范性的附录)j窑液的自己制B.1 pH7.2的O.01mol/L PBS 用天平称量1.096g磷酸氢二纳、O.316g磷酸二氢铀和8.5g氯化铀(分析纯或以上试剂)，溶解于950mL蒸馆水中，待溶解完全后用氢氧化铀或盐酸调pH至7.2，最后定溶至1OOOmL，灭菌或过滤后使用。8.2 抗;要是剂用天平称量3.8g拧棱酸二铀(分析纯或以上试剂)，溶解定溶于100mLPBS中，待溶解完全后即可使用O8. 3 1 %红细胞悬液由鹅翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内(按抗凝剂:全血=1:2的比例)，迅速混匀oft水平离心机中以3OOOg 5mi口，用吸管吸去土;青液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加PBS，慢慢混合均匀，再在离心机中:3OOOg离心5min，弃去上清液，再加PBS泪匀，如此反复洗涤离心3次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。使用时用1mL吸管吸取1mL红细胞泥，然后加入99mLPBS中，即为1%红细胞悬液。红细胞悬液最好现用现配，置于4C冰箱中可保存:34天。B.4 75%乙醇j容液在750mL无水乙醇中加入DEPC处理水溶液定容至1OOOmL, -20C保存。B.5 1 %DEPC处理水溶液将1mL二乙基焦碳酸脂CDEPC)加入双蒸水井定容至1OOOmL，置于摇床37C振摇过夜，然后121c高压30min，分装备用。注DEPC是一种潜在的致癌物质，操作时应戴手套和口罩并尽量在通风的条件下进行，避免呼吸和皮肤的接触。B.6 10%SDSl容液将100.Og电泳级SDS加入900mL双蒸水中，力口热至68C助i容，用浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，然后加水定容1OOOmL。分装备用，室温保存。B.7 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶液二水乙二肢四乙酸二呐CEDTA-Na2H20) 186.1g 氢氧化铀20.Og 双蒸水:定容至1OOOmL 8.8疑胶加样缓冲液庶糖:0.5mo1/L EDTA(pH 8.0): 10%SDS: 澳酣蓝:40. Og 20 mL 5mL 50. Omg DB44/T 664-2009 双蒸水75日lL先将庶糖完全溶解于双蒸水，然后按)11员序加入其余各成分，1守所有成分溶解泪合均匀后，用0.22州的微孔滤膜过滤除菌，40C保存。8. 9 Tr i s-冰乙酸电泳缓冲液B. 9.1 50 xTAE缓冲液:Tris: 242g 0乙酸:57. 1 mL O. 5mol/L EDTA(pH8. 0): 100mL 双蒸水:定容至1OOOmL B.9.2 1 xTAE缓冲液50 x TAE缓冲液:20 mL 双亲水:定容至1OOOmL B.10 10mg/mL滇化乙徒在90mL双蒸水中加入1.Og澳化乙皖，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解后定容至100mL。用铝宿包裹容器或移至棕色瓶中，保存于室温备用。;臭化乙链是强i秀变剂井有中度毒性，使用还有这种染料的溶液时应戴上于套，称量时要戴面罩，废弃澳化乙链或含有澳化乙链的电泳液、凝胶等要集中回L/欠处理，处理方法见附录D。8.10 1%琼脂糖;疑胶将制胶板水平放置在工作台上，放上合适的梳子。称量1.Og琼脂糖于三角瓶中，加入100mLlx TAE电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖，待琼脂糖溶液冷却至500C左右时，加入10mg/mU臭化乙链溶液5此，充分混合。将琼脂糖凝胶溶液沿胶板边沿缓慢连续注入，凝胶厚度控制在4mm左右，待J疑胶完全凝固后，将J疑胶板放置入己加入lxTAE电泳缓冲液的电泳槽中，使之没过胶面，拔出梳于，以各加样电泳。注:本附录中所用的试剂应为分析级(AR)或优质级(GR)。2 DB44/T 664-2009 附录G(规范性的附录)漠化乙fE溶液的净化处理c. 1 浓度大于0.5mg/mL漠化乙徒溶液的净化处理加入足量的水使澳化乙皖溶液的浓度降低至O.5mg/mL以下，在此溶液中加入0.2倍体积新配制的5%次磷酸和0.12体积新配制的0.5mol!L亚硝酸呐，调节该溶液的pH至3.0以下，小心混匀。在室温作用2毡，加入10倍量的1mol!L碳酸氢铀溶液，混合均匀，倒去溶液。C. 2 含有0.5g/mL滇化乙徒电泳缓冲液的净化处理每1OOOmL溶液中加入100mg粉状活性炭，在室温作用1h，不时摇动，用滤纸过滤溶液，丢弃溶液，另用塑料袋封装滤纸和活性炭焚化处理。