DB12∕T 946-2020 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法(天津市).pdf

TCS 65.120 B 25 DB12 天津市由巳ET且，万标准DB 12/T 946-2020 饲料中氨基酸的测定离子交换色谱法Determination of amino acids in feeds-Ion exchange chromatography 2020 - 06 -29发布2020 - 08 -01实施天津市市场监督管理委员会发布目IJ1=1 本标准依据GB!T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位:天津市畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:杨鸿雁、梁世岳、李玉鹏、陈龙宾、范寰、乔家运。DB12/ T 946-2020 I DB12/T 946-2020 饲料中氨基酸的测定离子交换色谱法1 范围本标准规定了饲料中氨基酸的离子交换色谱法测定方法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集与制备、测定步骤和结果计算。本标准适用于饲料原料、配合饲料及浓缩饲料中氨基酸含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB!T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB!T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB!T 14699. 1饲料采样GB!T 20195 动物饲料试样的制备3 原理3. 1 常规酸水解法饲料中的蛋白质在盐酸的作用下，水解成单一氨基酸，经离子交换色谱法分离井以frj三四同柱后衍生测定。水解中，色氨酸全部被破坏，不能测量，脱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。3. 2 氧化酸解法将饲料蛋白中的含硫氨基胆(眈氨酸和蛋氨酸)用过甲酸氧化，使之转变为对酸稳定的氧化物，再通过酸水解法释放出来，经离子交换已谱法分离并以印三四同柱后衍生测定。3. 3 碱水解法饲料中的蛋白质在碱的作用下，水解出色氨酸，经离子交换色谱法分离并以印三四同柱后衍生测定。4 试剂和材料4.1 本标准所用试剂和水，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和GB/T6 682中规定的一级水:所述i的夜如未指明溶剂均系水溶液。试验中所需溶液、制剂及制品，在没有注明其它要求时均按GB/T603 的规定制备。4. 2 盐酸:优级纯。4. 3 盐酸溶液(6mol/U量取盐酸500mL，用水稀释至1000此，混匀。4.4 部三四同溶液:按仪器说明书配制或购买。4.5 pH系列缓忡液、再生液:按仪器说明书配制或购买。DB12/T 946-2020 4.6 甲酸:浓度为88%。4. 7 过甲酸洛液:将30%过氧化氢与甲酸按体积比1:9混合，室温放置1h，置冰水浴中冷却30min, 临用前配制。4. 8 盐酸溶液0.2mol/U取盐酸600mL，用水稀释至1000此，混匀O4. 9 氢氧化埋溶液(4mol/U称取一水合氢氧化惶167.8g，用水溶解并稀释至1000mL，混匀O4.10 拧朦酸纳缓冲液:称取拧橡酸三毛内14.71g、氧化铀2.92g和拧橡酸10.50g，溶于500mL水中，加入硫二甘醇5mL和辛酸o.1 mL，定容至1000mL 4. 11 氢澳酸(48%):分析纯。4.12 高纯氮气:纯度为99.999%。4.13 氨基酸混合标准储备液:含L天门冬氨酸、L苏氨酸等17种常规水解分析用氨基酸，各组分浓度均为2.50 llmol/mL。4. 14 磺基丙氨酸蛋氨酸明标准储备液:准确称取磺基丙氨酸(纯度二三99.0%)105.7 mg和蛋氨酸明(纯度二三99.0%)113.3 mg，用水溶解井定容至250mL，浓度均为2.50flmol/mL, 20C80C保存，有效期1年。4.15 色氨酸标准储备液:准确称取色氨酸标准品(色谱纯)127. 5 mg，加少许水平口数滴o.1 mol/L 氢氧化铀溶液使之溶解，用水定容至250ml.浓度为2.50mol/mL， 20C80C保存，有效期1年。4.16 混合氨基酸标准工作液:准确吸取氨基酸混合标准储备液、磺基丙氨酸一蛋氨酸枫标准储备液和色氨酸标准储备液各1mL，置于25mL容量瓶，用拧朦酸铀缓冲液定容，泪匀，各氨基酸组分浓度均为100nmol/mL, 20C 80C保存，有效期3个月。5 仪器设备5. 1 样品粉碎机。5. 2 样品筛孔径0.1四8m删n凹阳nm田1m5. 3分析天平感量o.1 m吨n昭l咆go5.4 恒温鼓风干燥箱C5.5 氮吹仪。5. 6 旋涡混合仪。5. 7 氨基酸分析仪具有离子交换柱、印二酣柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器。6 样品的采集与制备按GB/T14699. 1采集样品;按GB/T20195制备样品，要求样品粉醉至过0.18mm孔径(80目)样品筛，充分混合均匀后装入密封袋中备用。7 测定步骤7. 1 样品的水解7. 1. 1 常规酸水解法称取试样30mg70 mg (约含蛋白质5mg20 mg，精确至o.1 mg)于25mL水解管中，准确加入10mL盐酸溶液，充氮气约1min后拧紧瓶盖，将水解管放入110CO土lCO恒温干燥箱，水解22h24 ho冷却至室温，泪匀。2 DB12/T 946-2020 氧化酸解法称职试样50mg100 mg (约含蛋白质7.5 mg25吨，精确至0.1mg)于25mL水解管中，冰水浴冷却30日ln后，加入己冷却的过甲酸溶液2mL，待样品湿润(勿摇)，拧紧瓶盖，连同冰浴一起置于OC4C冰箱中，反应16h，加入0.3mL氢澳酸，t辰摇后放回冰浴静置30min，取出放至室温后，加入10mL 盐酸溶液，充氮气约1min后拧紧瓶盖，将水解管放入110C。士lC。恒温干燥箱，水解22h24 ho冷却至室温，用水将内容物转移到25mL容量瓶，定容，混匀。7.1.2 碱7.1解?去称职试样50mg100 mg (约含蛋白质7.5 mg25吨，精确至O.1 mg)于10mL聚四氟乙烯水解管中，加入1.5日lL氢氧化理溶液，充氮气约1min后拧紧瓶盖，放入110CO:tlCO恒温干燥箱，水解20h后，冷却至室温，用水将内容物转移到25mL容量瓶中，用盐酸溶液中和至pH值为67，定容，泪匀。注:以上三种方法依所要测定的氨基酸种类选用O7. 1.3 上机水解液的制备将上述水解液过滤，取0.5mL滤液于小试管中，置于氮吹仪，650C吹干，必要时加少许水重复蒸干2次3次。准确加入2mL5 mL拧棱酸铀缓冲液，旋涡混合仪混匀，用O.22m水系过滤器过滤到上机瓶中，待测。7. 2 测定按照仪器使用说明书放置由三四同溶液与pH系列缓冲液、再生液，设置仪器色谱条件，将混合氨基酸标准工作液与处理好的样品水解液一同上机测定，仪器白动将试样的各氨基酸色谱峰面积与相应的标准品峰面积对比，计算分析，得出各氨基酸的含量，见图107. 3 。且1、。AF、rd响工-咱aaEPH，.矶、卢)ttBEano-h3-U Z的lhm-aAWZO的军军工mO的hu12:; I(陆2号骂。7S 。T 10 一-.,. l5.0 5 )，毛-_. . o. 0 17. 15.0 I. 5 10.0 7.5 5.0 !.5 u 3 混合氨基酸标准工作液色谱图图1结果计算8 DB12/T 946-2020 8. 1 计算方法氨基酸含量计算见式(1)。W仰)二咛丘x100 . (1) 式中:W 某氨基酸的含量，%; A一一每毫升上机水解液氨基酸的含量ng;D 稀释倍数:M一一试样质量mgo8. 2 允许差对于酸解测定的氨基酸，当含量小于或等于0.5%时，两平行样测定值相对偏差不大于5%;含量大于o. 5%时，相对偏差不大于4%。对于色氨酸，当含量小于O.2%时，两平行样测定值之差不大于O.03%;含量大于或等于0.2%时，相对偏差不大于5%。4