第六章-微生物的生长及其控制（1）《微生物学教程》.ppt

第第6 6章章 细菌的生长及其控制细菌的生长及其控制（1 1）生长与繁殖生长与繁殖生生长长:生生物物个个体体物物质质有有规规律律地地、不不可可逆逆增增加加，导导致致总量（体积、大小、重量）总量（体积、大小、重量）扩大扩大的生物学过程。的生物学过程。繁繁殖殖:生生物物个个体体生生长长到到一一定定阶阶段段，通通过过特特定定方方式式产产生生新新的的生生命命个个体体，即即引引起起生生命命个个体体数数量量增增加加的的生生物学过程。物学过程。生长生长=量变量变 繁殖繁殖=质变质变 微生物个体生长的含义微生物个体生长的含义 适适宜宜培培养养条条件件：将将微微生生物物的的一一个个细细胞胞置置适适宜宜培培养条件下培养。养条件下培养。新新 陈陈 代代 谢：谢：细胞（或孢子）按其自身的细胞（或孢子）按其自身的 生命生命活动规律进行新陈代谢。活动规律进行新陈代谢。同同化化大大于于异异化化：微微生生物物个个体体的的原原生生质质总总重重量量不不 断地增加，就是微生物的生长。断地增加，就是微生物的生长。微生物的群体生长微生物的群体生长定定 量量 定定 容：容：将一定量的微生物的细胞接到一定将一定量的微生物的细胞接到一定体积的容器内，置于适宜的条件下培养。体积的容器内，置于适宜的条件下培养。群群 体体 代代 谢：谢：群体的新陈代谢群体的新陈代谢同同 化化 异异 化：化：生物细胞群体生物细胞群体生物量增加生物量增加:微生物的群体生长微生物的群体生长细菌群体形成的过程在在一一定定时时间间和和条条件件下下细细胞胞数数增增加加（微微生生物物群群体体生生长长），即，即“生长生长”，一般均指群体生长。群体生长群体生长=个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法一、一、一、一、测生长量测生长量直接法直接法 l测体积法测体积法l称干重法称干重法 测定丝状真菌常用方法测定丝状真菌常用方法 间接法间接法l比浊法比浊法 目测或分光光度法（目测或分光光度法（450-650nm450-650nm）l生理指标法生理指标法 测含氮、碳、磷量测含氮、碳、磷量比比浊浊法法:在在一一定定波波长长下下，测测定定菌菌悬悬液液的的光光密密度度，以以光光密密度度(optical(optical density,density,即即OD.)OD.)表表示示菌菌量量。实实验验测测量量时时应应控控制制在在菌菌浓浓度度与与光光密密度度成成正正比的线性范围内，否则不准确。比的线性范围内，否则不准确。二、测繁殖数二、测繁殖数直接法直接法 计数板计数板间接法间接法l平板菌落计数法平板菌落计数法l厌氧菌的菌落计数法厌氧菌的菌落计数法计数板构造计数板构造25X1625X16型血球计数板型血球计数板平板计数法平板计数法平板计数法平板计数法平板计数法平板计数法厌氧菌的菌落计数法厌氧菌的菌落计数法亨盖特滚管培养法亨盖特滚管培养法 严格厌氧菌，著名美国微严格厌氧菌，著名美国微生物学家生物学家R.E.HungateR.E.Hungate 于于19501950年设计，故名。年设计，故名。半固体深层琼脂法半固体深层琼脂法 良好厌氧性良好厌氧性,设备较简单设备较简单,操作较简易操作较简易 (双歧杆菌双歧杆菌,乳酸菌等乳酸菌等)。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律同步生长的概念：同步生长的概念：采用一定的方法使细胞群体处于分采用一定的方法使细胞群体处于分裂步调一致的状态。裂步调一致的状态。环境诱导法：环境诱导法：变换温度、光线或对于稳定期的培养物变换温度、光线或对于稳定期的培养物添加新鲜培养液。添加新鲜培养液。物理学方法：物理学方法：通过物理学方法选择。例如选择性过通过物理学方法选择。例如选择性过滤或梯度离心法。滤或梯度离心法。两种同步法两种同步法环境条件诱导法环境条件诱导法：如用氯霉素抑制、藻胞的光照、：如用氯霉素抑制、藻胞的光照、黑暗、控制等，可能造成细胞循环周期改变。黑暗、控制等，可能造成细胞循环周期改变。机械选择法机械选择法：膜过滤法、膜洗脱法、密度梯度离：膜过滤法、膜洗脱法、密度梯度离心法等。心法等。同步生长法特点：同步生长法特点：同步性丧失：同步性丧失：在培养过程中，其同步性丧失较快。在培养过程中，其同步性丧失较快。丧失的原因：丧失的原因：群体中的不同细胞个体间分裂周期群体中的不同细胞个体间分裂周期差异。差异。获得同步生长的方法：获得同步生长的方法：诱导法诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。不同的周期变化。选择法选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。影响细胞代谢。原理：细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。典型生长曲线典型生长曲线概念：概念：定量描述液体培养基中微生物群体生长规定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线称为律的实验曲线称为生长曲线生长曲线（growth curvegrowth curve）。条件：条件：将少量纯种单细胞微生物群体、接入适宜将少量纯种单细胞微生物群体、接入适宜的恒定容积的培养液中，在适宜温度、通气与酸的恒定容积的培养液中，在适宜温度、通气与酸碱度等条件下，微生物群体细胞量有规律地增加碱度等条件下，微生物群体细胞量有规律地增加的过程。的过程。只适用于单细胞微生物如只适用于单细胞微生物如细菌和酵母菌细菌和酵母菌。生长曲线生长曲线（growth curve）结果：结果：根据微生物的根据微生物的生长速率常数（生长速率常数（growth rate growth rate constantconstant）即每小时分裂次数（）即每小时分裂次数（R R）的不同，以）的不同，以细胞数目的细胞数目的对数值对数值为纵坐标与培养时间作横坐为纵坐标与培养时间作横坐标，绘制出的由标，绘制出的由延滞期、指数期、稳定期和衰延滞期、指数期、稳定期和衰亡期亡期4 4个阶段组成的曲线。个阶段组成的曲线。典型生长曲线延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期生长曲线生长曲线生长曲线图示生长曲线图示生长曲线图示生长曲线图示延延滞滞期期对对数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期（1）延滞期延滞期 lag phase特点特点 生长速率常数为生长速率常数为零零；细胞形态变大或增长；细胞形态变大或增长；细胞内的细胞内的RNARNA含量增高；合成代谢活跃；对外界含量增高；合成代谢活跃；对外界环境敏感。环境敏感。影响因素影响因素 接种龄接种龄接种量接种量培养基成分培养基成分延滞期产生原因延滞期产生原因移植规律：移植规律：群体移植后产生延滞期是生命活动群体移植后产生延滞期是生命活动的基本规律，是适应新环境需要一定的时间的的基本规律，是适应新环境需要一定的时间的表现。表现。原原 因：因：因诱导酶、因诱导酶、ATPATP、HH及各种原材料等的合成需及各种原材料等的合成需环境及时间。环境及时间。细胞修复细胞修复：细胞损伤部分的修复需一定的时间。细胞损伤部分的修复需一定的时间。（2）指数期（）指数期（exponential phase）又称又称对数期对数期（logarithmic phaselogarithmic phase）：群体细胞）：群体细胞分裂与其数量以分裂与其数量以几何级数几何级数增加的一段时期。增加的一段时期。特点：特点：生长速率最大、代时最短生长速率最大、代时最短；细胞进行平；细胞进行平衡生长衡生长;酶系活跃、代谢旺盛。酶系活跃、代谢旺盛。指数期几个名词指数期几个名词R R：生长速率常数：生长速率常数 即为单位时间内生物体细胞所分裂的代即为单位时间内生物体细胞所分裂的代数值数值(每小时分裂的次数每小时分裂的次数)。G G：代时：代时即为生物体细胞每分裂一次所需时间或群体细胞即为生物体细胞每分裂一次所需时间或群体细胞的原生质体增加一倍所花的倍增时间。的原生质体增加一倍所花的倍增时间。N N ：繁殖代数：繁殖代数即指生物群体的全部在单位时间内共繁殖即指生物群体的全部在单位时间内共繁殖的代数的代数 (植物、动物、人植物、动物、人?)?)。生长限制因子：生长限制因子：凡在培养液中处于较低浓度范围内，可影凡在培养液中处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物或营养因子。响生长速率和菌体产量的营养物或营养因子。一些细菌的代时一些细菌的代时体温菌：体温菌：大肠杆菌大肠杆菌 G=12.5 G=12.5 17 min 17 min 枯草杆菌枯草杆菌 G=26 G=2632 min 32 min 结核杆菌结核杆菌 G=792 G=792 932 min932 min室温菌：室温菌：褐球固氮菌褐球固氮菌 G=240 min G=240 min 大豆根瘤菌大豆根瘤菌 G=410 min G=410 min 嗜热菌：嗜热菌：嗜热芽胞菌嗜热芽胞菌 G=18 min G=18 min 指数期影响因素指数期影响因素菌种菌种营养成分营养成分营养物浓度营养物浓度培养温度：对实际应用有参考价值培养温度：对实际应用有参考价值酸碱度酸碱度指数期的应用指数期的应用特性：群体生理特性一致，细胞成分平衡发群体生理特性一致，细胞成分平衡发展和生长速率恒定。展和生长速率恒定。应用：应用：宜作宜作发酵种子发酵种子；是代谢、生理研究的；是代谢、生理研究的好材料；是增殖噬菌体的最佳菌龄。好材料；是增殖噬菌体的最佳菌龄。(3）稳定期（）稳定期（stationary phase）生长速率常数为零生长速率常数为零；（新繁殖细胞数；（新繁殖细胞数=衰亡细衰亡细胞数）菌体产量达到最高点。胞数）菌体产量达到最高点。菌体产量与营养物消耗间呈比例关系（用生菌体产量与营养物消耗间呈比例关系（用生长产量常数长产量常数Y Y表示）。表示）。胞内出现贮藏物（糖原、异染颗粒和脂肪等）；胞内出现贮藏物（糖原、异染颗粒和脂肪等）；形成芽胞。形成芽胞。产生产生抗生素抗生素等次生代谢物。等次生代谢物。稳定期到来的原因稳定期到来的原因消耗：消耗：营养物的消耗营养物的消耗失调：失调：营养物的比例失调（碳氮比）营养物的比例失调（碳氮比）累积：累积：有害代谢产物的累积（酸、醇、毒素等）有害代谢产物的累积（酸、醇、毒素等）不适：不适：物化条件不适宜（物化条件不适宜（pHpH、氧化还原电势等、氧化还原电势等）稳定期与生产实践稳定期与生产实践SCPSCP收获期收获期 ：以菌体量为主的最佳收获期：以菌体量为主的最佳收获期产物收获期产物收获期：与菌体相平行的代谢产物的收获：与菌体相平行的代谢产物的收获生物测定生物测定：宜作生物测定的菌源（维生素、碱基、：宜作生物测定的菌源（维生素、碱基、氨基酸）氨基酸）连培的依据连培的依据：启示连续培养的主要依据：启示连续培养的主要依据（4）衰亡期（）衰亡期（decline phase）概念：概念：群体中个体死亡速度超过新生个体速度。群体中个体死亡速度超过新生个体速度。特点：特点：负负 增增 长长：R R 为为负负值值；细细胞胞形形态态多多样样，产产生生膨膨大与不规则退化形态大与不规则退化形态自溶现象：自溶现象：菌体常发生自溶现象菌体常发生自溶现象芽胞释放芽胞释放：产芽胞菌体常在此期释放芽胞等：产芽胞菌体常在此期释放芽胞等次生代谢物累积次生代谢物累积衰亡期到来原因衰亡期到来原因失调：失调：碳氮比严重失调碳氮比严重失调 耗尽：耗尽：培养基内营养物近耗尽培养基内营养物近耗尽恶化：恶化：培养环境的进一步恶化培养环境的进一步恶化原因：原因：分解代谢大于合成代谢，从而导致大分解代谢大于合成代谢，从而导致大量菌体进入死亡期量菌体进入死亡期连续培养连续培养分分批批培培养养（batch batch cultureculture）：又又称称封封闭闭培培养养（closed closed cultureculture），将将微微生生物物置置于于一一定定容容积积的的定定量量的的培培养养基基中中培培养养，培培养养基基一一次次性性加加入入，不不再再补补充充和和更更换换，最最后后一一次次性性收获。收获。连连 续续 培培 养养（continuous continuous cultureculture）：又又 称称开开放放培培养养（open open cultureculture），在在微微生生物物培培养养的的过过程程中中，不不断断地地供供给给新新鲜鲜的的营营养养物物质质，同同时时排排除除含含菌菌体体及及代代谢谢产产物物的的发发酵酵液液，让让培培养养的的微微生生物物长长时时间间地地处处于于对对数数生生长长期期，以以利利于于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养的实现连续培养的实现通过认识稳定期到来的原因，并采取有效措施实现。通过认识稳定期到来的原因，并采取有效措施实现。当当微微生生物物以以单单批批培培养养的的方方式式培培养养到到指指数数期期的的后后期期时时，一一方方面面以以一一定定的的速速度度连连续续流流入入新新鲜鲜培培养养液液（并并通通入入无无菌菌空空气气，立立即即进进行行搅搅拌拌）；另另一一方方面面以以同同样样流流速速流流出出发酵液至动态平衡。发酵液至动态平衡。特特点点：可可使使发发酵酵长长期期保保持持在在指指数数期期的的平平衡衡生生长长状状态态和和衡定的生长速率上。衡定的生长速率上。连续连续培养培养器器按控制方式分按控制方式分按培养器的级数分按培养器的级数分按细胞状态分按细胞状态分按用途分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器内控制（控制菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器生长速率）：恒化器单级连续培养器单级连续培养器多级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐发酵生产用：连续发酵罐连续培养器连续培养器两种连续培养器的比较两种连续培养器的比较微生物的连续培养微生物的连续培养连续培养的优缺点连续培养的优缺点优点优点：高效；自控；稳定；节约高效；自控；稳定；节约缺缺点点：菌菌种种易易退退化化；易易污污染染杂杂菌菌；营营养养物物的的利利用用率低率低应应用用：酵酵母母菌菌单单细细胞胞蛋蛋白白（SCPSCP）、乙乙醇醇、乳乳酸酸等等发酵、污水处理发酵、污水处理微生物的高密度培养（微生物的高密度培养（HCDC）也也称称高高密密度度发发酵酵，一一般般指指微微生生物物在在液液体体培培养养基基中中细细胞胞群群体体密密度度超超过过常常规规培培养养1010倍倍以以上上时时的的生生长状态或培养技术长状态或培养技术选取最佳培养基成分和各成分含量选取最佳培养基成分和各成分含量补料补料提高溶解氧的浓度提高溶解氧的浓度防止有害代谢产物的生成防止有害代谢产物的生成高密度培养实例高密度培养实例E.coliE.coli的的高高密密度度培培养养理理论论值值：可可达达到到200g(200g(湿湿)/L)/L 400g/L400g/L，即即使使为为200g/L200g/L，则则发发酵酵液液中中菌菌体约占体约占1/41/4，其流动性丧失，其流动性丧失E.coliE.coli的的高高密密度度培培养养报报道道值值：PHBPHB的的工工程程菌菌为为175.4g/L175.4g/L，W3110W3110菌株菌值菌株菌值174g/L 174g/L 获获取取HCDCHCDC必必须须综综合合考考虑虑与与充充分分运运用用各各菌菌株株的生长繁殖的规律，以获取最佳效果的生长繁殖的规律，以获取最佳效果小结名词解释生长曲线连续培养高密度培养