DB51∕T 1284-2011 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范(四川省).pdf

TCS 11.220 B 41 备案号30887-2011DB51 四. , 省Eh巳tTJ 方标准DB51/T 1284一-2011空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范2011-06 -27发布2011 - 07 -01实施四川省质量技术监督局发布D851月1284-2011目;欠目.Fr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1 范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 规范性引用文件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义. 1 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 附录A(资料性附录)培养墓和试剂制备. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 本标准附录A为资料性附录本标准由四川省畜牧食品局提出井归口本标准由四川省质量技术监督局批准目IJ1=1 本标准由四川省动物疫病预防控制中心负责起草D851月1284-2011本标准起草人:张焕容、余勇、张东、毛光琼、汤承、岳华、陈代平、郭莉、吴宜、李金海、岁毅II 0851月1284-2011空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范1 范围本标准规定了空肠子3曲杆菌(Campylobacterjejuni)的分离鉴定方法。本标准适用于鸡、鸭、鹅、野禽、猪、牛等多种畜禽空肠可由杆菌的分离与鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的号|用文件，其最新版本(包括所育的修改单)适用于本文件。GB!T 4789.28 食品引生微生物学检验染色法、培养基和试剂。GB!T 6682分析实验室用水规格和试验力法。3 术语和定义下列术语和定义适用J本标准。3. 1 于肠弯曲杆菌Campy/obacterjejun 叫主主多种动物和人腹泻，在环坊及健康动物体内广泛存在。曲体大小为O.3m0.4mX1.5m 3. o 11m ，弯曲轩状或海鸥展翅状，暴露于常气中后很快形成球状体，革兰氏染色阴性。3. 2 聚合酌链式反应Polymerasechain reaction, PCR 是种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的ONA片段3. 3 号|物Primer是人工合成的两段寡核背酸序列，用于聚合同每链式反应，其巾条引物与目标片段-端的-条ONA模板链开补，另一条引物与目标片段另一端的另一条ONA模板链可补、。4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定4. 1 设备和材料4. 1. 1 二氧化碳培养箱4.1.2 微量移液器(0.1LlO.l L、2.lL20L、20.lL200L、200LlOOO.lL)及相向型弓的无菌|肢头D851月1284-20114.1.3 微型离心机(适合了对PCR反应管进行离心操作)4.1.4 无菌工作什4.1.5 接种环、接种针、酒精灯及酒精棉球4.1.6 PCR扩增仪及电泳仪4. 2 培养基和试剂(见附录的4.2.1 改良Skirrow氏琼脂基础培养基CSkirrowAgar Base, Modified) 4. 2. 2 常肠弯曲杆菌琼脂某础培养基CCampylobacterAgar Base) 4. 2. 3 Cary-Blair民运送培养基CCary-BlairTransport Medium) 4. 2. 4 革乓氏染色液4.2.5 TAE缓冲液4. 2. 6 琼脂糖及显色液4. 2. 7 相关牛化试剂3%过氧化氢溶液、1%盐酸二甲基对苯二眩溶液、1%一茶酌乙醇溶液、甘氨酸、醋酸铅培养基、马尿酸铀培养基、二氧化铁、主专院酸、耐酸盐培养基、对氨基苯陆酸、醋酸、奈胶、TTC琼脂基础培养基。4. 2. 8 PCR鉴定相关试剂Taq DNA聚合酶C5U/L)、MgC12C25mmol/L)、dNTPC每种浓度为2.5mmol/L)、10 XPCR Buffer(无Mg2)。4. 2. 9 分离拮养4.2.10 用灭菌棉签无菌采集动物的泄殖腔(月111)、空肠、盲肠内容吻。4.2.11 将采样棉签放入运送措养基带回实验室划线或直接划线于Skirrow氏培养基平板。4.2.12 将该半板置于420C、10%气氧化碳的培养箱中培养48ho4.2.13 挑取疑似空版弯曲杆菌的单个菌落(直径1mm2mm、透明、表面光滑)，革兰氏染色镜检。4.2.14 将革兰氏染色镜检疑似空肠弯曲打菌的菌洛接种于空肠弯曲打菌琼脂基础培养基平板上，置于420C、10%二氧化碳的培养箱中纯化培养24h48ho4.2.15 在空肠弯由杆菌琼脂基础培养基平板上再挑取单个菌落革兰氏染色镜检，若含有其他杂菌，需重复4.3. 5继续纯化直到革兰氏染色镜检为弯曲杆菌为止。4. 3 细菌鉴定4.3.1 细菌染色鉴定革兰氏染色镜检为G0 4. 3. 2 生化鉴定+为阳性反应为阴性反应)触酶试验C+)、氧化酶试验C+)、廿氨酸试验(十)、吭化氢试验C-)、马五民酸铀试验(十)、荼盹酸抑制试验C+)、硝酸盐记原试验(-)和TTC试验C+)。4.3.3 PCR鉴定2 4. 3. 3. 1 PCR号|物七站于Jl匆5-AGCTAGCTTCGCATAATAACTTG-3 下游引物5-GAAGAGGGTTTGGGTGGTG-3 4. 3. 3. 2 模板制备DB51月1284-2011细菌液体培养物12000r/min离心20min，介.:r.洁，收集沉淀用于模板DNA提取。IpJr.述沉淀中加入500LSTE缓冲液，使其主忌。加入10%SDS溶液20L，20mg/mL蛋白酶K10L，泪匀，在56C水浴60min。加入等休积的酌/氯仿/异戊醇(25:24:1), 1昆匀，12000r/min离心5mino转移上请到另一离心管中，加入等休积的氯仿/异戊醇(24:1 )，颠倒混匀，12000r/min离心5mino取上洁，加入2.5 估休积的预冷无水乙醇，-20C1J1淀30min，12000r/min离心5min，弃去上清液。用1mL 70%乙醇漂洗，重复2-3次，12000r 1m i n离心5min。室温干燥，DNA i兀淀用25L无菌二茶水溶解作为极板，-20C保存备用。4. 3. 3. 3 PCR扩增每次对检测样品进行PCR扩增时，均需要设置阳性和空白对照。PCR反应总反应体系25L，包括以F成份:10XPCR Buffer 2. 5L、MgC12 (25mM) 2L、dNTP(2. 5mM) 2L、TaqDNA聚合酶(5UIL)O. 2L、上游引物(20mo1 IU 1L、F游引物(20mo1 IU 1L、水14.3L、模板DNA(空白对照用水代替)2L。PCR反应条件为95C预变性5min，然后进行95C1min, 58C 1min, 72C1min, 30个循环，最后72C延伸10min, 4C保存。4.3.3.4 PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶(见附录A)0取5LPCR产物与1L6倍上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔巾加入DNA分子量标准，以5V/cm恒压电泳，采用iht胶成像系统进行拍照。在阳性和空门对照成立的前提下，待检样品如果为阳性，川出现一条与阳性对照同步迁移的目的条带。4.3.3.5 结果判定凡符合空肠弯曲杆菌的革兰氏染色特征、生化特性以及PCR鉴定呈阳性的菌株，均1rJ为空肠弯曲杆菌。3 D851月1284-2011附录A(资料性附录)培养基和试剂制备A. 1 试剂及制备A. 1. 1 二氧化铁FeCh6H20 12g容于2%盐酸洛液100mL即成。A. 1.2 氧化酶试剂1%盐酸四甲基苯二胶水溶液，或1%盐酸二甲基对苯二肢水济液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可保存2间，若冰冻保存可用4周6周OA. 1.3 3%过氧化氢(H二0，)30%过氧化氢10mL 茶馆水90mL 装于棕色玻璃瓶中，有效期为一周OA. 1.4 1%甘氨酸培养基布氏肉汤1000 mL 琼脂l. 6 g 甘氨酸10. 0 g 将以上成分混合，加热溶解，校正PH7.0:1:0.2，分装13mmX100mm试管，每支约4mL左右，1210C高压灭菌15min，备用。片细指滤牛和形此也铀圆却粉粉铁酸的沙陈浸浸铀亚硫酸归自陈肉母化酸代走JU蛋一本牛酵氯硫硫盯、一圣dh化硫拍速含快Fhu户nuAHHAn 15. Og 5. Og 3.0g 3. 0g 5. Og 0.2g O. 3g 刮脂4.Og 茶馆水1000m1 pH 7.4 115C高原蒸汽灭菌15min，待冷却至50C60C，J去5%的比例加入灭活血洁，分装于小试管中，待凝固后，用于接种细菌。A. 1.7 STE缓冲液O.1 mol/L NaC1、10mmo1/L Tris. HC1 (pH8. 0)和1mmo1/L EDTA (pH8.0)。4 D851月1284-2011A.1.8 TAE绥冲液50XTAE电泳缓冲液贮存液Tris碱242g、EDTA37.2g和冰乙酸.57.1mL混什，加双蒸水至1000mL，应用前用双亲水将.50XTAE电泳缓冲液进行.50古稀释。A. 1.9 PCR鉴定相关试剂(10X PCR Buff er 、6X loading buffer、MgC12、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物等均由生物公司购得)A. 1. 10 其它试剂以及药品.5%氧化纳、硝酸盐溶液、O.02%盐酸半肮氨酸、乙|酸、FeCL、硫酸亚铁(FeS。如7H20)、甲荼肢、对氨基苯磺酸、偏亚吭酸纳、无;j(磷酸氢二4:1内、兀水磷酸二氢押、丙嗣酸纳。A. 1. 11 2%琼脂糖凝胶板的制备称取2g琼脂糖，加入碎有100mLTAE缓冲液锥形并且中，然后将三角瓶放在微波炉中加热罕琼脂糖充分溶解再加入O.8L思色液，轻轻晃动泪和均匀。5