DB36∕T 1658-2022 “赣葛 1 号”粉葛组培微插繁殖技术规程(江西省).pdf

ICS 65.020.20 CCS B 05 DB36 江西省地方标准 DB36/T 16582022 “赣葛 1 号”粉葛组培微插繁殖技术规程 Technical regulation of micro-cutting propagation in tissue culture of pachyrhizua angulatus Gange No.1 2022 - 09 - 26 发布 2023 - 04 - 01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 16582022 I 目 次 前 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 组培准备 . 1 5 培养基制作 . 2 6 材料选取 . 2 7 茎节微扦插 . 2 8 继代增殖 . 3 9 生根培养 . 3 10 试管苗移栽 . 3 11 档案管理 . 4 附录 A （规范性附录） MS 培养基母液配方及配制 . 5 附录 B （规范性附录） 植物生长调节物质母液配制方法 . 6 附录 C （规范性附录） MS 培养基的配制流程及方法 . 7 DB36/T 16582022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分： 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西农业大学农学院、江西中医药大学、江西绿色生态葛研究所、萍乡市农业科学研究中心。 本文件主要起草人：范淑英、吴才君、周庆红、马喜玲、黄琦、肖旭峰、罗莎、朱强龙、肖遥、孙静宇、单楠、朱卫丰、葛菲、朱德彬、吴波。 DB36/T 16582022 1 “赣葛 1 号”粉葛组培微插繁殖技术规程 1 范围 本文件规定了赣葛1号组织培养微型扦插繁殖技术的范围、规范性引用文件、术语和定义、组培准备、培养基制作、材料选取、茎节微扦插、继代增殖、生根和试管苗移栽、档案管理等。 本文件适用于“赣葛 1 号”粉葛组培苗快繁生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1000 容器育苗技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 赣葛 1 号 Gange No.1 块根呈纺锤状， 无 （少） 分叉， 根长 35 cm45 cm， 粗 9 cm12 cm， 单根重 2 kg 5 kg，鲜块根淀粉含量 18%25%，早熟，生长势强，生育周期 270 d 280 d 的粉葛新品种。 3.2 微型扦插 micro-cutting 使用外源激素，促进具有顶芽或没有顶芽的休眠侧芽启动生长，进行芽苗的增殖培养，快速获得大量的芽苗后再进行生根培养，得到完整植株的这种繁殖方式称为微型扦插。 3.3 继代增殖 subculture reproduction 将增殖的不定芽组织从其基部切取分离， 转接到不定芽增殖培养基上进行一段时间培养后， 再将增殖的芽继续切成单芽转接到不定芽增殖培养基中继续培养，这样连续多代转接培养的方法。 4 组培准备 4.1 仪器设备 DB36/T 16582022 2 4.1.1 培养基制作及灭菌设备 天平、纯水机、pH计、高温高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。 4.1.2 无菌操作设备 超净工作台、灭菌器等。 4.1.3 培养室设备 空调、定时器、培养架、摇床、光照培养箱、人工气候室等。 4.1.4 药品储存与配制设备 冰箱、万分之一天平等。（建议可加相应的序号） 4.2 器皿及器材 4.2.1 培养器皿 试管、锥形瓶、培养皿及各类专用培养瓶。 4.2.2 盛装器皿 烧杯、试剂瓶。 4.2.3 计量器皿 量筒、容量瓶。 4.2.4 操作器材 培养基分注器、细菌过滤器、镊子、剪刀、解剖刀。 4.3 化学试剂 包括组培苗基本培养基所需的无机盐类、有机物类及植物生长调节物质类等。MS基本培养基成分及母液配制应符合附录A的规定；其它常用试剂及植物生长调节物质的配制应符合附录B的规定。 5 培养基制作 5.1 MS 基本培养基配置 采用附录C的方法配制固体MS培养基，组培瓶分装后放入高温高压蒸汽灭菌锅，在0.1 Mpa，121 条件下灭菌20 min，取出冷却凝固后备用。 5.2 培养基配制 按照附录C方法分别配制茎节微扦插的不定芽诱导、增殖和芽苗生根培养基。 茎节微扦插不定芽诱导培养基：MS + 1.5 mg/L 6-BA + 1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂粉，pH 5.8，固体培养基； 不定芽增殖培养基：MS+1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂粉，pH 5.8，固体培养基； 芽苗生根培养基：MS+0.5 mg/L NAA + 30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂粉，pH 5.8，固DB36/T 16582022 3 体培养基。 6 材料选取 选取无病虫害、长势健壮的葛藤幼嫩茎节作为诱导材料。 7 茎节微扦插 7.1 前处理 7.1.1 剪取新鲜带茎节、长约3 cm左右的葛茎段，将其置于流水下冲洗30 min后，再置于干净烧杯中，在超净工作台上进一步消毒（75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%氯化汞浸泡20 min，无菌水冲洗3次）。 7.1.2 将消毒完成后的茎段置于灭好菌的滤纸上，用镊子和解剖刀片对茎段进行切割，一手用镊子固定茎段， 一手用解剖刀片进行切割，切除腋芽，将茎段切至1 cm左右（带茎节）。用镊子夹起将其插入不定芽诱导培养基中，形态学上端（分生迅速，向上或者向下延伸的称为上端）朝上摆放固定，接种后做好标记，写明材料名称、接种日期。 7.2 不定芽诱导 将接种茎段的培养瓶放置无菌培养室中培养（室温25 ，光照强度54 molm-2s-1，光周期14 h/d），待茎段生长30 d后，再将诱导出的不定芽移至不定芽增殖培养基中进行培养。 8 继代增殖 8.1 切取 将增殖的不定芽从其基部切取分离。 8.2 增殖 将切取的不定芽基部组织转接到组培苗增殖培养基上培养，培养30 d后，将增殖的芽再继续切成单芽在不定芽增殖培养基上继代培养。 8.3 扩繁 每继代1次单芽可增殖4 6个，每个单芽可继代扩繁5次，可获得1000株 7000株种苗。 9 生根培养 9.1 转接 选取株高4 cm 5 cm健壮的组培苗，将茎基部愈伤组织和自发根系切除，转接到生根培养基上诱导生根。 9.2 培养 在室温为25，光照强度为54 molm-2s-1，环境相对湿度为60 %和光周期为昼夜14h/10h条件下培养18 d 21 d，同时苗长有主、侧根时即可移栽。 DB36/T 16582022 4 10 试管苗移栽 10.1 炼苗 选择叶色浓绿，生根数多，高 5 cm 6 cm 健壮的组培苗，打开瓶盖，在自然光、室温下炼苗 2 d 3 d。 10.2 驯化移栽 10.2.1 基质制备 采用泥炭、蛭石和珍珠岩的混合物，按泥炭：蛭石：珍珠岩=3：2：1 的比例混合，再放置在 121 高温灭菌锅中灭菌 30 min， 冷却后装入营养钵中， 放置在塑料大棚苗床内备用，移栽前先用自来水浇透基质。 10.2.2 移栽 从培养瓶中取出经过锻炼的组培苗， 用自来水洗去附着的培养基，然后移栽到营养钵或穴盘中。 10.2.3 秧苗管理 待全部苗移栽完毕，在苗床上方覆盖塑料薄膜小拱棚，每天上午用喷雾器喷雾，保持基质和空气湿润，相对湿度保持在 85左右。第 10 d 后逐渐揭开塑料膜，20 d 后将秧苗移栽到种植地，移栽后的 3 d 内应进行遮阳，再进入正常的田间管理。 11 档案管理 在“赣葛1号”粉葛组培微插过程中，详细记载初代培养、继代培养、生根培养和炼苗等资料档案，妥善保存。 DB36/T 16582022 5 A A 附 录 A （规范性附录） MS 培养基母液配方及配制 表A.1 MS 培养基母液配方及配制 母液 成分 用量 定容 每升用量 母液 成分 用量 定容 每升用量 母液 1（50 倍） NH4NO3 82.5 g 1000 mL 20 mL KNO3 95.0 g MgSO47H2O 18.5 g 母液 2（100 倍） CaCl2H2O 44.0 g 1000 mL 10 mL 母液 3（100 倍） KH2PO4 17.0 g 1000 mL 10 mL 母液 4（100 倍） Na2-EDTA 3.730 g 1000 mL 10 mL FeSO47H2O 2.780 g 母液 5（50 倍） H3BO3 0.31 g 1000 mL 20 mL MnSO44H2O 1.115 g ZnSO47H2O 0.43 g KI 0.0415 g NaMoO42H2O 0.0125 g CuSO45H2O 0.00125 g CoCl26H2O 0.00125 g 母液 6（200 倍） 肌醇（Inositol） 20.0 g 1000 mL 5 mL 甘氨酸（Gly） 0.4 g 烟酸（VB3） 0.100 g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.100 g 烟酸硫胺素（VB1） 0.020 g DB36/T 16582022 6 B B 附 录 B （规范性附录） 植物生长调节物质母液配制方法 B.1 植物生长调节物质母液配制方法 按照下列步骤进行配制： a) 称量：用分析天平或电子天平准确称取生长素（或细胞分裂素）50 mg100 mg； b) 溶解：生长素（如 IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用适量 0.1 mol/L 的 NaOH 或 95%的酒精溶解，细胞分裂素（如 KT、ZT、6-BA）可用 0.1 mol/L 的 HCl 加热溶解； c) 定容：加蒸馏水定容至 100 mL，配制成浓度为 0.51 mg/mL 的溶液。 DB36/T 16582022 7 C 附 录 C （规范性附录） MS 培养基的配制流程及方法 C.1 MS培养基的配制流程 图B.1 培养基配制流程图 C.2 MS培养基配制方法 按照下列步骤进行配制： a) 1L MS 基本培养基配制：根据培养基成分准备好蒸馏水、琼脂、蔗糖和各类母液等； b) 加蒸馏水 800 mL（按所需容量的 80%左右），再加入琼脂 6.5g，加热并不断搅拌使琼脂完全融化； c) 加入蔗糖 30 g，待完全溶解后，按附录 A 加入母液，再根据要求加入适量植物生长调节物质并充分搅拌，最后定容至 1 L； d) 用 0.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的 NaOH 调节 pH 值至 5.8。 _