GB∕T 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌 PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法PCR detection method of chicken salmonella enteritis 2021-04-30发布国家市场监督管理总局俗世国家标准化管理委员会供W2021-11-01实施目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SC/TC181)归 口。GB/T 40049-2021 本标准起草单位:山东农业大学、青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东省农业科学院家禽研究所、秦皇岛海关、山东派克检测技术有限公司。本标准主要起草人:常维山、孙淑红、王述柏、瞿海华、崔言顺、柴同杰、鞠孜敬、赵效南、王涛、黄兵、宋敏训、马秀丽、高月花、郑德云、郭树源、马洪超、孙杰、张富友。GB/T 40049-2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法1 范围本标准规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的PCR检测方法。本标准适用于各种日龄的鸡及其产品中携带的肠炎沙门氏菌的PCR方法检测。2 规 范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.4- 2016 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/ T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB/ T 28642- 2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应CPCR)法NY / T 541- 2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 持家基因house-keeping gene 生物体在生理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的一类基因。这类基因高度保守，基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleicacid) PCR:聚合酶链式反应Cpolymerase chain reaction) 5 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯o实验用水均符合GB/T6682-2008二级水规定。5.1 LB液体培养基(配制方法见附录A中A.l)。5.2 缓冲蛋白陈水CBPW)前增菌液(配制方法见A.2)。5.3 亚晒酸盐眈氨酸CSC)增菌液(配制方法见A.3)。5.4 四硫磺酸盐煌绿CTTB)增菌液(配制方法见A.4)。5.5 木糖赖氨酸脱氧胆盐CXLD)琼脂D.3C配制方法见A.5)。5.6 TAE电泳缓冲液(配制方法见A.6)。5.7 阳性、阴性对照:阳性对照为肠炎沙门氏菌标准株CCVCC3377)培养液、鸡向荆沙门氏菌标准株GB/T 40049-2021 (CVCC535)培养液;阴性对照为灭菌超纯水。5.8 细菌基因组DNA提取试剂盒:商品化试剂盒。5.9 元水乙醇:一20oc预冷。5.10 75%乙醇:无水乙醇和双蒸水配制，-20oc预冷。5.11 DNA分子量标记:DN A Marker 2 000。5.12 琼脂糖。5.13 七个持家基因 片段的PCR引物序列:参见附录B的B.1。5.14 2XPCR孔1ix。6 仪器6.1 恒温培养箱(温度范围:5 oc 50 oc，温度均匀度:1:1 OC)。6.2 高压灭菌锅(灭菌温度:105o c 135 oc，工作压力:0.35 MPa)。6.3 电子天平(感量0.001g)。6.4 高速离心机(可控温至4oc、离 心速度可达12000 r/min以上L6.5 二级生物安全柜。6.6 4 oc冰箱(温控范围2oc 8 OC);一200C冰箱。6.7 PCR仪o6.8 电泳仪(电压90V 120 V)。6.9 微量移液器(2L、20L、200L、1000L)及配套吸头。6.10 电泳仪(电压90V 120 V)。6. 11 控温摇床(温度范围:5 oC 50 oC，振荡频率:30 r/ min 300 r/min)。6.12 凝胶成像仪。6.13 PCR反应管。6.14 1.5 mL带盖离心管。7 沙门氏菌分离鉴定7.1 样品采集、储存和运输7.1.1 组织样品选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其肝脏、脾脏等组织样品，放置于无菌容器内，标记好组织名称和采样日期，冷藏运送到实验室进行检测o按照NY/ T 541-2016中6.2执行。7.1.2 肠内容物样品按照NY/T541-2016中6.7.2执行。7.1.3 粪便样品按照NY/ T 541-2016中6.8.1执行。7.1.4 泄殖腔拭子样品按照NY/T541-2016中6.8.2执行。2 GB/T 40049-2021 7.2 沙门氏菌分离鉴定按照GB4789.4-2016执行，进行分离、培养，至生化试验部分，完成疑似沙门氏菌菌株的初步鉴定。8 鸡肠炎沙门氏菌的PCR检测方法8.1 细菌基因组DNA提取将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按试剂盒说明书要求进行。8.2 持家基因引物设计合成七个持家基因的引物。引物DNA序列参见B.1。8.3 持家基因PCR扩增用B.1中所列七对引物对样品基因组DNA的七个持家基因分别进行PCR扩增。具体实验操作符合GB/T28642-2012检测技术要求。50L PCR反应体系参见B.2。PCR反应程序:94 oC 5 m i n ; 94 oC 45 s, 55 oC 45 s, 72 oC 1 m i n ，共35个循环;72 oC 7 min; 4 oC 保存。8.4 PCR产物电泳取5L10L PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(电泳方法参见GB/T28642-2012)，电泳结束后，用凝胶成像仪观察结果。8.5 PCR阳性产物测序将七个持家基因均扩增tH特异性条带的PCR产物进行测序。8.6 结果判定8.6.1 试验成立条件利用B.1规定的七对引物，阳性对照菌株PCR产 物电泳后分别出现七条特异性的扩增条带，阴性对照PCR产物无扩增条带，试验结果成立。否则试验不成立。七个持家基因的PCR产物电泳图参见附录C。8.6.2 肠炎沙门氏菌分子分型判定使用DNA序列分析软件，将七个持家基因PCR产物DNA序列与附录D所列参考序列分别进行一对一比对(部分基因提供了2个3个参考序列)。8.6.3 测序结果判定七个基因的测序结果与附录D中所对应的参考序列(或之一)均完全一致(即:所测oC基因序列与D.1.1或D.1.2中序列之一完全一致、所测dnaN基因序列与D.2.1或D.2.2中序列之一完全一致、所测hemD基因序列与D.3中序列完全一致、所测hisD基因序列与D.4.1或D.4.2中序列之一完全GB/T 40049-2021 一致、所测户urE基因序列与D.5.1或D.5.2中序列之一完全一致、所测sucA基因序列与D.6.1或D.6.2中序列之一完全一致、所测thA基因序列 与D.7.1或D.7.2或D.7.3中序列之一完全一致)，则可判定样品为肠炎沙门氏菌阳性。4 A.1 LB液体培养基A.1.1 成分膜蛋向陈酵母提取粉氯化纳水A.1.2 制备附录A(规范性附录)培养基配制5 g 10 g 10 g 1 000 mL 将各成分加入水中，搅混均匀，121oC :l: 2 oC高压灭菌15min，冷却后备用。A.2 BPW前增菌液A.2.1 成分蛋向月东氯化专内磷酸氢二铀(含12个结晶水)磷酸二氢梆水A.2.2 制备10.0 g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL GB/T 40049-2021 将各成分加热熔解于1000 mL水中，121oC :l: 2 oC高压灭菌15min，冷却后备用。A.3 sc t曾菌液A.3.1 成分蛋白陈5.0 g 乳糖4.0 g 亚晒酸氢饷4.0 g 磷酸氢二铀10.0 g L脱氨酸0.01 g 水1 000 mL A.3.2 制备将各成分加热溶解于1000 mL蒸馆水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶或试管中备用。当天制备当天使用，无需高压灭菌。5 GB/T 40049-2021 A.4 TTB增菌液A.4.1 成分蛋白陈9.0 g 牛肉粉4.5 g 氯化铀2.7 g 碳酸钙40.5 g 胆盐5.0 g 硫代硫酸纳50.0 g 水1 050 mL A.4.2 制备将各成分溶解于1050 mL蒸馆水中，加热煮沸，11备用前加人20%破液20mL，O.l%煌绿10mL, 现配现用。A.5 XLD鉴别培养基A.5.1 成分酵母浸粉3.0 g L赖氨酸5.0 g 木糖3.75 g 乳糖7.5 g 煎糖7.5 g 拧朦酸铁饭0.8 g 硫代硫酸纳6.8 g 氧化铀5.0 g 苯盼红0.08 g 琼脂13.0 g 水1 000 mL pH 7.4:1:0.2 25 oc A.5.2 制备将上述成分加热溶解于1000 mL蒸馆水中，冷至50oc左右时倾入无菌平皿，备用。A.6 TAE电泳缓冲液A.6.1 50 X TAE电泳缓冲液成分nu n 酸问乙iNYT riELTE 40 mmol/L 1 mmol/L 6 GB/T 40049-2021 A.6.2 1 X TAE电泳缓冲液制备先按A.6.1所示成分配制50XTAE电泳缓冲液，将其用蒸馆水50倍稀释即为工作浓度。7 GB/T 40049-2021 附录B(资料性附录)测序引物与反应体系B.1 七个持家基因测序引物见表B.l。表B.1七个持家基因片段PCR引物序列基因名称引物序列片段大小F 5-GTCACGGTGATCGATCCGGT-3 thrA R 5-CACGATATTGATATTAGCCCG-3 852 bp F 5 -CCTGGCACCTCGCGCT A T AC-3 aroC R 5-CCACACACGGATCGTGGCG-3 826 bp F 5-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3 dnaN R 5-AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC-3 833 bp F 5-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3 sucA R 5-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3 643 bp F 5-TCGCGTCTGTCGGTCTGTAT-3 hisD R 5-GGCGCAGTATAGCCATAGGT-3 755 bp F 5-ATGAGTATTCTGATCACCCG-3 hemD R 5-ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA-3 666 bp F 5-GACACCTCAAAAGCAGCG-3 户urER 5-CGAGAACGCAAACTTGCTTC-3 510 bp B.2 PCR反应体系见表B.2。表B.2PCR扩增反应体系组分f本丰只/-LLddH20 19.0 2X PCR Mix 25.0 F上游引物2.0 R下游引物2.0 DNA模板2.0 总体积50.0 8 附录C(资料性附录)七个持家基因PCR电泳图肠炎沙门氏菌阳性菌株七个持家基因PCR电泳图见图C.l。说明:1一一-thrA;2一一一-sucA;3urE; 4一一-hemD;5一一一-hisD;2 4 5 6 7 K OQ S 且a T r e -k a M N二民J川Fnnn da斗 图C.1阳性对照菌的七个持家基因PCR扩增结果电泳图2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M G/T 40049-2021 9 GB/T 40049-2021 附录D(资料性附录)七个持家基因DNA序列D.1 aroC基因D.1.1roC 5/ aroC 454 GTTTTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGG CGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCCAAGAAA TACCTGGCGGAAAAGTTCGGCA TCGAAA TCCGCGG(C/T)TGCCTGACCCAGA TGGGCGA TA TTCC GCTGGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGTCCCGATGCGGACAAAC TTGACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGGCGACTCCATCGGCGCGAAAGT GACGGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTTGGCGAACCGGTTTTTGACCGACTGGATGCG GACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATCAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGAAGGATTTA ACGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCGCGATGAAATCACGGCGCAGGGT D.1.2 aroC 41 GTTTTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGG CGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCCAAGAAA TACCTGGCGGAAAAGTTCGGCATCGAAATCCGCGGCTGCCTGACCCAGATGGGCGACATTCCGCT GGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGCCCCGATGCGGACAAACTTG ACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGGTGACTCCATCGGCGCGAAAGTGAC GGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTTGGCGAACCGGTATTTGACCGACTGGATGCGGAC ATCGCCCATGCGCTGATGAGCATTAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGAAGGATTTAACG TGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCGCGATGAAATCACGGCGCAGGGT D.2 dnaN基因D.2.1 dnN 2/dnaN 494 ATGGAGATGGTCGCGCGCGTTACGCTTTCTCAGCCGCATGAGCCGGGCGCCACTACCGTGCCGGC GCGGAAATTCTTTGATATCTGCCGCGGCCTGCCGGAGGGCGCGGAGATTGCCGTTCAGTTGGAAG GCGATCGGATGCTGGTGCGTTCTGGCCGTAGCCGCTTCTCGCTGTCTACGCTGCCTGCCGCCGATT 10 GB/T 40049-2021 TCCCGAATCTTGACGACTGGCAAAGCGAAGTTGAATTTACGCTGCCGCAGGCCACGATGAAGCG CCTGATTGAAGCGACCCAGTTTTCGATGGCTCATCAGGATGTGCGCTACTACTTAAACGGTATGC TGTTTGAAACGGAAGGTAGCGAACTGCGCACTGTCGCGACCGACGGCCACCGC(C/T)TGGCGGTG TGCTCAATGCCGCTGGAAGCGTCTTTACCCAGCCACTCGGTGATTGTGCCGCGTAAAGGCGTGAT TGAACTGATGCGTATGCTCGACGGCGGTGAAAACCCGCTGCGCGTGCAG D.2.2 dnaN 67 ATGGAGATGGTCGCGCGCGTTACGCTTTCTCAGCCGCATGAGCCAGGCGCCACTACTGTGCCGGC GCGGAAATTCTTTGATATCTGCCGCGGCCTGCCGGAGGGCGCGGAGATTGCCGTTCAGTTGGAAG GCGATCGGATGCTGGTGCGTTCTGGCCGTAGCCGCTTCTCGCTGTCTACACTGCCTGCCGCCGATT TTCCGAATCTTGACGACTGGCAAAGCGAAGTTGAATTTACGCTGCCGCAGGCCACGATGAAGCG CCTGATTGAAGCGACCCAGTTTTCGATGGCCCATCAGGATGTGCGCTACTACTTAAACGGTATGC TGTTTGAAACGGAAGGTAGCGAACTGCGCACTGTCGCGACCGACGGCCACCGCCTGGCGGTGTG CTCAATGCCGCTGGAAGCGTCTTTACCCAGCCACTCGGTGATTGTGCCGCGTAAAGGCGTGATTG AACTGATGCGTATGCTCGACGGCGGCGAAAACCCGCTGCGCGTGCAG D.3 hemD基因GCGACACTGACGGAAAACGATCTGGTTTTTGCCCTTTCACAGCACGCCGTCGCCTTTGCTCACGC CCAGCTCCAGCGGGATGGCCGAAACTGGCCTGCGTCGCCGCGCTATTTCGCGATTGGCCGCACCA CGGCGCTCGCCCTTCATACCGTTAGCGGGTTCGATATTCGTTATCCATTGGATCGGGAAATCAGC GAAGCCTTGCTACAATTACCTGAATTACAAAATATTGCGGGCAAACGCGCGCTGATTTTGCGTGG CAATGGCGGCCGCGAACTGCTGGGCGAAACCCTGACAGCTCGCGGAGCCGAAGTCAGTTTTTGT GAATGTTATCAACGATGTGCGAAACATTACGATGGCGCGGAAGAAGCGATGCGCTGGCATACTC GCGGCGTAACAACGCTTGTTGTTACCAGCGGCGAGATGTTGCAA D.4 hisD基因D.4.1 hisD 7/966 ATTGCGGGATGTCAGAACGTGGTTCTGTGCTCGCCGCCGCCCATCGCTGATGAAATCCTCTATGC GGCGCAACTGTGTGGCGTGCAGGAAATCTTTAACGTCGGCGGCGCGCAGGCGATTGCCGCTCTG GCCTTCGGCAGCGAGTCCGTACCGAAAGTGGATAAAATTTTTGGCCCCGGCAACGCCTTTGTAAC CGAAGCCAAACGTCAGGTCAGCCAACGCCTCGACGGCGCGGCTATCGATATGCCAGCCGGGCCG 11 GB/T 40049-2021 TCTGAAGTACTGGTGATCGCCGACAGCGGCGCAACACCGGATTTCGTCGCTTCTGACCTGCTCTC CCAGGCTGAGCACGGTCCGGATTCGCAGGTGATTCTGCTGACGCCTGATGCTGACATTGCCTGCA AGGTGGCGGAGGCGGTAGAACGTCAACTGGCAGAACTGCCGCGCGCGGACAC(Cn)GCCAGGCA GGCCCTGAGCGCCAGTCGTCTGATTGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGTC D.4.2 hisD 14 ATTGCGGGATGTCAGAACGTGGTTCTGTGCTCGCCGCCGCCCATCGCTGATGAAATCCTCTATGC GGCACAACTGTGTGGCGTGCAGGAAATCTTTAACGTCGGCGGCGCGCAGGCGATTGCCGCTCTG GCCTTCGGCAGCGAGTCCGTACCGAAAGTGGATAAAATTTTTGGCCCCGGCAACGCCTTTGTAAC CGAAGCCAAACGTCAGGTCAGCCAGCGTCTCGACGGCGCGGCTATCGATATGCCAGCCGGGCCG TCTGAAGTACTGGTGATCGCAGACAGCGGCGCAACACCGGATTTCGTCGCTTCTGACCTGCTCTC CCAGGCTGAGCACGGCCCGGATTCCCAGGTGATCCTGCTGACGCCTGATGCTGACATTGCCCGCA AGGTGGCGGAGGCGGTAGAACGTCAACTGGCGGAACTGCCGCGCGCGGACACCGCCCGGCAGG CCCTGAGCGCCAGTCGTCTGATTGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGTC D.5 purE基因D.5.1 purE 5 AGCGACTGGGCTACCATGCAATTCGCCGCCGAAATTTTTGAAATTCTGGATGTCCCGCACCATGT AGAAGTGGTTTCCGCTCATCGCACCCCCGATAAACTGTTCAGCTTCGCCGAAACGGCGGAAGAG AACGGATATCAAGTGATTATTGCCGGCGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGGGAATGATTGCGG CAAAAACGCTGGTCCCGGTACTCGGCGTGCCGGTACAAAGCGCTGCGCTAAGCGGCGTGGATAG CCTCTACTCCATCGTGCAGATGCCGCGCGGCATTCCGGTGGGTACGCTGGCGATCGGTAAAGCCG GTGCCGCTAACGCCGCCCTGCTCGCCGCGCAGATTCTGGCGCAACACGACGCGGAACTGCATCA GCGCATTGCCGAC D.5.2 purE 6 AGCGACTGGGCTACCATGCAATTCGCCGCCGAAATTTTTGAAATTCTGGATGTCCCGCACCATGT AGAAGTGGTTTCCGCCCATCGCACCCCCGATAAACTGTTCAGCTTCGCCGAAACGGCGGAAGAG AACGGATATCAAGTGATTATTGCCGGCGCGGGCGGCGCGGCGCACCTGCCGGGAATGATTGCGG CAAAAACGCTGGTCCCGGTACTCGGCGTGCCGGTACAAAGCGCTGCGCTAAGCGGCGTGGATAG CCTCTAC丁CCATTGTGCAGATGCCGCGCGGCATTCCGGTGGGTACGCTGGCGATCGGTAAAGCCGGTGCCGCTAACGCCGCCCTGCTCGCCGCGCAGATTCTGGCGCAACACGACGCGGAACTGCATCA GCGCATTGCCGAC 12 GB/T 40049-2021 D.6 sucA基因D.6.1 sucA 6 AAACGCTTCCTGAACGAACTGACCGCCGCTGAAGGGCTGGAACGTTATCTGGGTGCCAAATTCCC GGGTGCGAAACGTTTCTCGCTCGAGGGGGGAGATGCGCTGATACCCATGCTGAAAGAGATGGTT CGCCATGCGGGTAACAGCGGCACTCGCGAAGTGGTGCTGGGGATGGCGCACCGCGGTCGCCTGA ACGTGCTGATCAACGTACTGGGTAAAAAACCGCAGGATCTGTTCGACGAATTTGCCGGTAAGCAT AAAGAACATCTGGGTACCGGCGACGTGAAGTATCACATGGGCTTCTCGTCAGATATCGAAACCG AAGGCGGTCTGGTTCACCTGGCGCTGGCGTTTAACCCATCGCATCTGGAAATTGTGAGCCCGGTG GTGATGGGCTCCGTGCGCGCCCGTCTGGACAGACTGGACGAACCGAGCAGCAACAAAGTGTTGC CGATCACTATTCACGGCGACGCCGCGGTGACCGGCCAGGGCGTGGTTCAG D.6.2 sucA 192 AAACGCTTCCTGAACGAACTGACCGCCGCTGAAGGGCTGGAACGTTATCTGGGTGCCAAATTCCC GGGTGCGAAACGTTTCTCGCTCGAGGGGGGAGATGCGCTGATACCCATGCTGAAAGAGATGGTT CGCCATGCGGGTAACAGCGGCACTCGCGAAGTGGTGCTGGGGATGGCGCACCGCGGTCGCCTGA ACGTGCTGATCAACGTACTGGGTAAAAAACCGCAGGATCTGTTCGACGAATTTGCCGGTAAGCAT AAAGAACATCTGGGTACCGGCGACGTGAAGTATCACATGGGCTTCTCGTCAGATATCGAAACCG AAGGCGGTCTGGTTCACCTGGCGCTGGCGTTTAACCCATCGCACCTGGAAATTGTGAGCCCGGTG GTGATGGGCTCCGTGCGTGCCCGTCTGGACCGACTGGACGAACCGAGCAGCAACAAAGTGTTGC CGATCACTATTCACGGCGACGCCGCGGTGACCGGCCAGGGCGTGGTTCAG D.7 thrA基因D.7.1 thrA 1 GTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTGCTGGCCGCCTGTTTACGCGCTGACTG CTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCCGCGCCAGGTGCCGGACGCCA GACTGCTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAACTCTCTTACTTCGGCGCCAAAGTCCTT CACCCTCGCACCATAACGCCTATCGCCCAGTTCCAGATCCCCTGTCTGATTAAAAATACCGGTAA TCCGCAGGCGCCAGGAACGCTGATCGGCGCGTCCAGCGACGATGATAATCTGCCGGTTAAAGGG ATCTCTAACCTTAACAACATGGCGATGTTTAGCGTCTCCGGCCCGGGAATGAAAGGGATGATTGG GATGGCGGCGCGTGTTTTCGCCGCCATGTCTCGCGCCGGGATCTCGGTGGTGCTCATTACCCAGT CCTCCTCTGAGTACAGCATCAGCTTCTGTGTGCCGCAGAGTGACTGC 13 GB/T 40049-2021 D.7.2 thrA 70 GTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTGCTGGCCGCCTGTTTACGCGCTGACTG CTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCCGCGCCAGGTGCCGGACGCCA GGCTGCTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAACTCTCTTACTTCGGCGCCAAAGTTCTT CACCCTCGCACCATTACGCCCATCGCCCAGTTCCAGATCCCCTGTCTGATTAAAAATACCGGTAA TCCGCAGGCGCCAGGAACGCTGATCGGCGCGTCCAGCGACGATGATAATCTGCCGGTCAAAGGG ATCTCTAACCTTAACAATATGGCGATGTTTAGCGTCTCCGGCCCGGGAATGAAAGGGATGATTGG GATGGCGGCGCGTGTTTTCGCCGCCATGTCTCGCGCCGGGATCTCGGTGGTGCTCATTACCCAGT CCTCCTCTGAGTACAGCATCAGTTTCTGTGTGCCGCAGAGTGACTGC D.7.3 thrA 77 GTGCTGGGCCGTAATGGTTCCGACTATTCCGCCGCCGTGCTGGCCGCCTGTTTACGCGCTGACTG CTGTGAAATCTGGACTGACGTCGATGGCGTGTATACCTGTGACCCGCGCCAGGTGCCGGACGCCA GGCTGCTGAAATCGATGTCCTACCAGGAAGCGATGGAACTCTCTTACTTCGGCGCCAAAGTTCTT CACCCTCGCACCATTACGCCCATCGCCCAGTTCCAGATCCCCTGTCTGATTAAAAATACCGGTAA TCCGCAGGCGCCAGGAACGCTGATCGGCGCGTCCAGCGACGATGATAACCTGCCGGTTAAAGGG ATCTCTAACCTTAACAACATGGCGATGTTTAGCGTCTCCGGCCCGGGAATGAAAGGGATGATTGG GATGGCGGCGCGTGTTTTCGCCGCCATGTCTCGCGCCGGGATCTCGGTGGTGCTCATTACCCAGT CCTCCTCTGAGTACAGCATCAGCTTCTGTGTGCCGCAGAGTGACTGC 14