GB 23238-2021 种猪常温精液.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 43 中华人民共和国国家标准2021-04-30发布种猪常温精液Boar Iiquid semen 国家市场监督管理总局Lg.-/;-国家标准化管理委员会以叩GB 23238-2021 代替GB23238-2009 2022-05-01实施GB 23238-2021 目。吕本文件按照GB/T1. 1-2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替GB23238-2009种猪常温精液)，与GB23238-2009相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下:删除了原精液精子畸形率的定义(见2009年版的3.1、3.5); 一一增加了种猪精子密度畸形精子混合精液批次和保质期的定义(见3.1、3.3、3.6、3.7、3.8、3.9); 更改了常温精液精子活力和前向运动精子数的定义(见3.2、3.4、3.5，2009年版的3.2、3.3、3.4); 一一删除了原精液的要求(见2009年版的4.1); 删除了外观(见2009年版的4.2.1)有效期的技术要求(见2009年版的4.2.6); 增加了深部输精的内容(见第4章); 一一更改了剂量和前向运动精子数的技术要求(见第4章，2009年版的4.2); 更改了抽样方法(见5.1，2009年版的5.1、5.2); 更改了检验类别(见7.1，2009年版的6.2)判定规则(见7.2，2009年版的第7章); 一一增加了型式检验情况的描述(见7.1.2); 一一更改了标签(见8.1，2009年版的8.1); 增加了随行文件的条款(见8.2); 一一更改了包装贮存和运输的条款(见9.1、9.2、9.3，2009年版的8.2、8.3、8 .4); 一一增加了保质期的内容(见9.4); 增加了不合格产品处置的要求(见第10章); 删除了抽样的内容(见2009年版的A.1); 一一更改了剂量(见A.1，2009年版的A.2)精子活力(见A.2，2009年版的A.3)和前向运动精子数的检测方法(见A.3，2009年版的A.4); 更改了精子畸形率姬姆萨染色法的染色时间见A.4.1.3b)，2009年版的A.5.3C)J; 一一增加了伊红苯胶黑快速染色法的内容(见A.4.2); 一一删除了种猪常温精液监督检验程序的内容(见2009年版的附录B); 增加了精子质量分析仪检测精子密度的校正方法的内容(见附录B)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出并归口。本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为:2009年首次发布为GB23238- 2009; 一一本次为第一次修订。I GB 23238-2021 种猪常温精液1 范围本文件规定了种猪常温精液的质量技术要求、抽样、试验方法、检验规则、标签和随行文件、包装、贮存、运输和保质期、不合格产品处置。本文件适用于商品化的种猪常温精液产品。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/ T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/ T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定3 术语和定义3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 下列术语和定义适用于本文件。种猪boar 体型外貌和性能质量符合本品种标准要求且具有种用价值的公猪。注:来、源于具有种畜禽生产经营许可证和动物防疫合格证的种猪场或公猪站，或有资质的种猪性能测定站。常温精液liquid semen 采集的种公猪原精液经稀释，但未经低温冷冻处理，在常温06oc 18 OC)下保存的精液。精子密度semen concentration 每毫升精液中所含的精子个数。精子活力sperm motility 精液中前向运动精子活动的程度。注:当精液温度在370C左右时，以精液中前向运动精子数占总精子数的百分比表示。前向运动精子数number of progressively motile sperm 每剂量精液中呈前向运动精子的总数。畸形精子abnormal sperm 形态异常的精子。注:包括但不限于大头、小头、原生质滴、卷尾、断尾等。GB 23238-2021 3.7 混合精液pooled semen 同一品种两头及以上种猪的精液混合物。3.8 批次batch 同一生产线、同一时间，使用同一份或混合精液稀释分装生产的一批常温精液产品。3.9 保质期shelf life 自产品生产之时起，在满足种猪常温精液产品规定的保存和运输条件下，其产品符合质量要求的最长期限。4 技术要求种猪常温精液质量应符合表1的规定。表1种猪常温精液质量要求受体为引人品种、培育品种项目受体为地方品种常规输精深部输精剂量/mL二三80.0二三60.0二三4 0.0精子活力/%二三 60.0二三60.0二三60.0前向运动精子数/(108个/剂)二三18.0二三12.0二三10.0精子畸形率/%三二20.0三二20.0三二20.05 抽样5.1 抽样方法5. 1. 1 出厂检验以每批次生产份数为基数，随机抽取样品，抽取份数取整数且不少于基数的10%。5.1.2 型式检验以每批次生产份数为基数，随机抽取样品，抽取份数取整数且不少于基数的15%。5.2 抽样时间产品分装后2h至保质期截止前24h。6 试验方法6.1 剂量按附录A中A.1的规定执行。2 GB 23238-2021 6.2 精子活力按A.2的规定执行。6.3 前向运动精子数按A.3的规定执行。6.4 精子畸形率按A.4的规定执行。7 检验规则7.1 检验类别7.1.1 出厂检验出厂检验项目为第4章规定的产品剂量、精子活力和前向运动精子数。7.1.2 型式检验型式检验项目为第4章规定的全部项目。产品正常生产时，至少每半年进行一次型式检验，若有下列情况之一时，应进行型式检验:a) 生产工艺及设备有重大变更时;b ) 所用生产原料有重大变化时;c) 种猪发生疾病或统一注射疫苗时;d) 停产3个月以上恢复生产时;e) 出厂检测结果与上次型式检测结果有较大差异时;f) 监督管理部门提出要求时。7.2 判定规则7.2.1 样晶判定规则7.2.1.1 所检项目全部符合本文件规定时，则判定该样品合格。7.2.1.2 检测结果中有任何项目不符合本文件规定时，则判定该样品不合格。若该样品在其保质期内可进行复检，复检结果全部符合本文件规定时，则判定该样品合格，复检结果有任何项目不符合本文件规定时，则判定该样品不合格;若该样品已不在其保质期内，则不得复检。7.2.1.3 各项目检测结果的极限数值判定按GB/T8170中修约值比较法执行。7.2.2 每批次产品的判定规则每个批次的产品中所有抽检样品合格，则判定该批次的产品合格;其中有任一抽检样品不合格，则判定该批次的产品不合格。8 标签和随行文件8.1 标签标签要求如下:3 GB 23238-2021 a) 应易于识别，不易脱落或损坏。b) 应使用规范的汉字对产品信息进行说明。c) 应标识但不限于如下信息:1) 产品通用名称、种猪品种及个体编号、生产企业名称及联系方式、生产时间、适用受体、授精方式、保存条件、保质期，以及第4章规定的项目指标。2) 非生产企业经营常温精液产品时，其标签信息还宜包括经营企业的名称和联系方式等。若是混合精液，则应加以注明(可不注明种猪个体编号)。3) 使用电子标签(如二维码标签)的标签信息至少应包括本条款规定的信息，还可包括生产企业商标或徽标，以及可追溯的其他信息。8.2 随行文件随行文件至少应包括种畜禽生产经营许可证和动物防疫合格证的复印件，以及种猪系谱档案(混合精液除外)等复印件。9 包装、贮存、运输和保质期9.1 包装产品包装应为对精子无毒副作用的一次性塑料制品，可选用袋装、瓶装或管装，容量应大于第4章中规定的对应产品最低剂量的110%。封口严密。9.2 贮存种猪常温精液应置于恒温箱中避光保存，恒温箱内温度应控制在16o c 18 oc。保质期内每间隔8 h12 h应摇匀1次。9.3 运输种猪常温精液应置于16o c 18 oc避光密封的容器中运输，运输过程避免强烈震动和碰撞。9.4 保质期生产企业应给出常温精液产品的保质期，保质期应不少于72h。10 不合格产品处置不应出售和使用检验不合格的产品。不合格产品应按有关规定进行无害化处理。4 A.1 剂量A.1.1 仪器设备A. 1. 1. 1 电子台秤:感量0.1go A. 1. 1.2 恒温箱:17 o C:l: 1 oC。A.1.2 试验步骤附录A(规范性)种猪常温精液产品质量检测方法GB 23238-2021 接通电子台秤电源，开机，检查电子台秤的运行情况。在18o C 25 oC室温条件下，将电子台秤清零后，从恒温箱中取出待检产品，置于台秤称量盘上，记录显示值为W1。使用与受检产品同一批次、未使用的空包装，或全部项目检测完毕，倒出内容物清洗并干燥的空包装，置于电子台秤称量盘上，记录显示值为W20A.1.3 试验数据处理剂量按式(A.1)计算:W = W1-W2 ( A.1 ) 式中:W 样品剂量值，单位为毫升(mL)，计算时按1mL相当于1g进行换算;W1一一样品与包装的称量值，单位为克(g); W2 空包装的称量值，单位为克(g)。计算结果保留至小数点后1位，按GB/T8170的规定进行修约。A.2 精子活力A.2.1 仪器设备与耗材A.2.1. 1 精子质量分析仪:由相差显微镜、显示器和专用分析软件等组成。相差显微镜至少应配有10倍、20倍的物镜镜头。专用分析软件的主要技术参数应为VCL不小于5m/s、VSL不小于5m/s、STR = VSL/ V AP不小于25%。精子质量分析仪可读取并显示多个视野的平均值。注1:VCL为精子曲线运动速度。注2:VSL为精子直线运动速度。注3:VAP为精子平均运动速度。注4:STR为精子直线运动速度与平均运动速度的比值。A.2.1.2 恒温载物台:37 o C:l: 1 oC。A.2.1.3 恒温箱:17 o C:l: 1 oC。A.2.1.4 移液器:量程20L。A.2.1.5 专用定容玻片:腔室高度20m:l:2m。5 GB 23238-2021 A.2.2 试验步骤按如下步骤进行检测:a) 开启精子质量分析仪预热至少5min，安装恒温载物台(带有恒温载物台的一体化仪器不需要此步骤)，开启恒温载物台电源开关，设置温度为37oC:l: 1 oC。b) 检查物镜是否转换到相差显微镜头，必要时应按照说明书进行物镜校准并转换光圈模式，以达到最佳备用状态;调节显微镜光源至适宜的亮度，将低倍物镜正对载物台的通光孔，调节物镜与恒温载物台之间的最佳距离，观察视野明亮程度，通过调节聚光器，直至视野光线最佳。c) 将专用定容玻片置于恒温载物台上预热，预热时间应大于1mi口。d) 从恒温箱中取出待检样品，在18oC 25 oC室温条件下轻摇2min3 min。若样品包装为袋装，则将空精液瓶置于恒温箱30min以上，再将袋装精液转移至精液瓶中，置于恒温箱中，待检。e) 保持精液瓶与视线水平，使其倾斜约450，将移液器的吸头伸入液面下15mm20 mm处，避开凝结絮状物，吸取3L5L样品，滴于专用定容玻片进样口处，让其自行流人腔室，待检(样点1);用同样方法吸取3L5L样品，滴于专用定容玻片另一腔室的进样口处，待检(样点2)。f) 点样后预热1min3 min，在200倍条件下，按照操作要求在3min内完成样点1和样点2的检测。g) 每个样点至少读取3个视野的数据，记录每个样点的平均值。A.2.3 试验数据处理精子活力按式CA.2)计算:式中:M一一精子活力，%;M=Ml十M2-2 M1一一仪器给出的样品平行样样点1检测活力的平均值，%;Mz 仪器给出的样品平行样样点2检测活力的平均值，%。C A.2 ) 计算结果保留至小数点后1位，按GB/T8170的规定进行修约。若两个样点计算结果相对偏差大于5%，则应重检。A.3 前向运动精子数A.3.1 仪器设备与耗材A.3.1. 1 精子质量分析仪:由相差显微镜、显示器和专用分析软件等组成。相差显微镜至少应配有10倍、20倍的物镜镜头，具有精子密度的检测功能，精子密度的校正方法见附录B。A.3.1.2 移液器:量程20L。A.3.1.3 专用定容玻片:腔室高度20m:l:2m。A.3.2 试验步骤A.3.2.1 参照附录B的规定对精子质量分析仪进行校正，每年至少校正一次。6 GB 23238-2021 A.3.2.2 精子密度检测按如下步骤:a) 按照A.2.2a)e)规定的步骤操作，直至完成样品的点样;b) 点样后预热1min3 mi口，在200倍条件下，读取并记录精子密度值，记为Di。A.3.3 试验数据处理每剂量中精子总数按式(A.3)计算:S =DiX W 式中:S 每剂量中精子总数，单位为亿个008个); Di 仪器显示的精子密度值，单位为亿个/毫升008个/mL); W一一样品剂量的实测值，单位为毫升(mL)。精子密度值(Di)和每剂量中精子总数(S)应保留至小数点后3位。前向运动精子数按式(A.4)计算:C = S X M 式中:C一一前向运动精子数，单位为亿个008个); M 精子活力检测值，%。( A .3 ) ( A.4 ) 用两个平行样的平均值表述样品检测结果，计算结果保留至小数点后1位，按GB/T8170的规定进行修约。若两个平行样之间的相对偏差大于5%，则应重检。A.4 精子畸形率A.4.1 姬姆萨染色法(仲裁法)A.4. 1. 1 仪器设备与耗材A.4. 1. 1. 1 显微镜:物镜倍数为10倍、40倍。A.4. 1. 1.2 电子台秤:感量0.01g。A.4. 1. 1.3 载玻片。A.4. 1. 1.4 计数器。A.4. 1. 1.5 容量瓶:100 mL。A.4. 1. 1.6 研钵。A.4. 1. 1. 7 移液器:量程20L。A.4.1.2 试剂或材料下面检测方法除非另有说明，仅使用分析纯试剂。A.4. 1.2. 1 水:GB/T6682，兰级水。A.4.1.2.2 磷酸盐缓冲液:称取0.55g磷酸二氢铀(NaHzP04 2HzO) ,2.25 g磷酸氢二纳(NazHP04 2HzO) ，置于容量瓶中，用水溶解并定容至100mL。A.4.1.2.3 姬姆萨原液:称取1.0g姬姆萨染料，量筒量取66.0mL甘油，66.0mL甲醇。将姬姆萨染料放入研钵中，加少量甘油充分研磨至无颗粒，将甘油全部倒人，放入恒温箱中保温溶解4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮存于棕色瓶中，贮存时间越久染色效果越好。商品化试剂按说明书配制使用。A.4.1.2.4 姬姆萨染液:量取2.0mL姬姆萨原液，3.0mL磷酸盐缓冲液，5.0mL水，混合摇匀，现配现GB 23238-2021 用。商品化试剂按说明书配制使用。A.4.1.3 试验步骤按如下步骤进行检测:a) 按照A.2.2d)e)规定的方法吸取10L样品滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈约35。夹角，先浸润与样品接触的边缘向另一侧缓慢推动，将样品均匀地涂抹在载玻片上，自然风干(约5min)，每样品制作2个抹片;b) 将风干后的抹片浸没于放有姬姆萨染液的染缸中，染色15min30 min后用水缓缓清洗染液，直至玻片上无明显染液后，晾干制成染片，待检;c) 将染片置于400倍下观察，观察顺序为从左到右，从上到下。根据观察到的精子形态，按表A.1要求判定正常精子和畸形精子，且一边观察，一边用计数器计数，累计观察约200个精子，分别记录精子总数和畸形精子总数，拍照保存该样品的图片。表A.1精子形态判定精子形态判定精子形态正常精子头部呈椭圆形，中部和尾部自然延伸头部:大 头、小头、梨形头、圆头、双头等;畸形精子尾部:原生质滴、断尾、卷尾、双尾、异常弯曲等A.4.1.4 试验数据处理畸形率按式CA.5)进行计算:A;=去X100 C A.5 ) 式中:A;一一畸形率，%;A。观察精子总数，单位为个;A一一观察畸形精子总数，单位为个。用两个平行样的平均值表述样品检测结果，计算结果保留至小数点后1位，按GB/T8170的规定进行修约。若两个平行样计算结果之间的绝对差值大于5%，则应重检。A.4.2 伊红苯肢黑快速染色法A.4.2.1 仪器设备与耗材A.4.2. 1. 1 显微镜:物镜倍数为10倍、40倍。A.4.2.1.2 电子台秤:感量0.01g 。A.4.2.1.3 移液器:量程200LoA.4.2.1.4 容量瓶:100 mL。A.4.2.1.5 计数器。A.4.2.1.6 载玻片。A.4.2.1. 7 离心管:1.5 mL或2mL。GB 23238-2021 A.4.2.2 试剂或材料下面检测方法除非另有说明，仅使用分析纯试剂。A.4.2.2.1 水:GB/T6682，兰级水。A.4.2.2.2 伊红Y染色液:将0.67g伊红Y和0.9g氯化纳溶入100mL纯水中。A.4.2.2.3 伊红苯胶黑染色液:将10 g苯胶黑加人100mL伊红Y染色液中，加热至沸腾，然后冷却至室温，用滤纸过滤，储存于黑色密封玻璃瓶中。商品化试剂伊红苯胶黑染色液按说明书配制或使用。A.4.2.3 试验步骤按如下步骤进行检测:a) 按照A.2.2d)e)规定的方法吸取30L样品和10L伊红苯胶黑染色液，放人离心管中，轻摇混匀，制成精液、伊红苯胶黑染色液的混合液，放置30s60 S; b) 用移液器吸取10L精液、伊红苯胶黑染色液的混合液，滴于载玻片一端，按A.4.1.3a)规定的方法制作2个抹片;c) 按A.4.1.3c)的规定对2个抹片分别进行镜检。A.4.2.4 试验数据处理按A.4.1.4的规定执行。9 GB 23238-2021 附录B(资料性)精子质量分析仪检测精子密度的校正方法B.1 方法提要分别采用血球计数法和仪器法对同一份精液样品进行精子密度检测，对比两个检测结果，结果之间的相对偏差小于5%时，完成仪器校正。B.2 血球计数法检测B.2.1 仪器设备与耗材B.2. 1. 1 显微镜:物镜为10倍、40倍。B.2.1.2 电子天平:感量为0.01g。B.2.1.3 计数器。B.2.1.4 移液器:量程1000L和200L。B.2.1.5 容量瓶:100 mL。B.2.1.6 血球计数板。B.2. 1. 7 盖玻片。B.2.1.8 离心管:1.5 mL或2mL。B.2.2 :式剂下面检测方法除非另有说明，仅使用分析纯试剂。B.2.2.1 水:GB/T6682，兰级水。B.2.2.2 3.0 %氯化纳溶液:称取3.0g氯化纳，用水溶解并定容至100mL。B.2.3 试验步骤按如下步骤进行检测:10 a) 吸取950L3.0%氯化纳溶液放入离心管中，按照A.2.2d)e)规定的方法取50L样品与950L 3.0%氯化铀溶液充分混合均匀，制成试样。b) 用盖玻片将血球计数板计数室盖好。吸取30L50L试样置于血球计数板一端计数室的边缘，让试样自行流人，使其充满计数室，计数室内不应有气泡。用同样方法在血球计数板另一端计数室点样后，静置约5min。c) 将点好样品的血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找计数室，再切换至400倍的条件下观察。d) 采用边观察、边计数的方法，用计数器清点计数室的精子个数。每个计数室观察5个中方格，5个中方格分别为计数室的左上角、右上角、正中间、左下角和右下角。精子计数均以精子头部所处的位置为准，每个中方格内的精子均为计数范围，方格压线的精子计数遵循数上不数下，数左不数右的原则。分别记录两个计数室5个中方格的总精子数，并取其平均值，记为Ti。B.2.4 试验数据处理精子密度按式CB.1)计算:S = T ; X 5 X 20 X 104 X 10-8 式中:S 一一精子密度，单位为亿个/毫升(108个/mL); T; 一一两个计数室中5个中方格总精子数的平均值，单位为个;5 -5个中方格精子数转换成25个中方格的倍数;20 精液稀释倍数;104一一体积单位换算;10-8一一密度单位换算。GB 23238-2021 .C B.1 ) 计算结果保留至小数点后3位，按GB/T8170的规定进行修约。两个计数室中5个中方格总精子数CTJ之间的绝对差值应不大于5个，否则应重检。每份样品检测2次，2次检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则应重检，用2次检测结果的平均值表示该样品的检测结果。同一份样品至少应由两人进行精子密度的检测，两人检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则应重检。当检测结果满足本条要求时，取其平均值作为血球计数法的最终检测结果。B.3 仪器法检测对血球计数法中的同一样品，按A.3.2.2的步骤检测精子密度，至少2次。仪器检测结果之间的相对偏差应小于5%，否则应重检。当检测结果满足本条要求时，取其平均值作为仪器法的最终检测结果。B.4 比对校正将血球计数法和仪器法的最终检测结果进行比对，若两者之间的相对偏差小于5%，则精子质量分析仪完成校正。否则应按照精子质量分析仪的参数设置程序，调整精子密度检测的相关参数，并重复B.3的步骤，直至血球计数法和仪器法检测结果之间的相对偏差小于5%。