DB33∕T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法(浙江省).pdf

lCS 65. 020. 30 B 43 DB33 川、d江省山巳ETE, 万标准DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法Method ofRT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 -03 -03发布2020 - 04 -03实施浙江省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照GB!T1. 1-2009给出的规则编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。DB33/T 2247-2020 本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人:云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴贯立在、张传亮、吴雪军、黄晓兵、j马肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。DB33/T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录一聚合酶链式反应CRT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。2 术语和定义2. 1 鸭坦布苏病毒(DuckTembusu Virus, DTMUV) 属于黄病毒手斗、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病死亡。3 实验条件3. 1 主要仪器设备3. 1. 1 PCR 1义。3. 1.2 荧光定量PCR仪。3. 1.3 微量移液器。3.1.4 组织匀浆器。3.1.5 电泳仪。3.1.6 电泳槽。3.1.7 水浴锅。3. 1.8 紫外凝胶成像系统。3. 1.9 高速台式低温离心机。3. 1. 10 生物安全拒。3. 2 试剂3. 2. 1 O. 01M磷酸盐缓冲液CO.01 mol/L, pH7. 4 PBS):称职8.0g NaCl、U.2g KCl、2.9g NaPO川2H20、O. 2 g KH2P04，将上述试剂溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然后加去离子水定容至1L，高温灭菌30mi丑，室温保存。3.2.2 氯仿。3.2.3 异丙醇。3.2.4 焦炭酸二乙醋(DEPC)处理的灭菌去离子水:用DEPC50队，加超纯水至100mL，室温过夜，1210C高压灭菌15mi口，分装到1.5 mL DEPC处理过的离心营，冻存备用O3.2.5 75%乙醇:取新开启的无水乙醇75mL，加DEPC水至100mL，昆匀，-20oC预冷。DB33/T 2247-2020 3.2.6 澳化乙链(E曰:取1.0 g 臭化乙链，加去离子水，定容至100mL。充分溶解后的澳乙皖溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为o.5g /mL 3. 2. 7 1xTAE缓冲液:取242g挂基甲基氨基甲皖(Tris)、37.2g二水乙二按四乙酸二纳、57.1mL 冰乙酸，加去离子水定容至1L，配置成50 xTAE电泳缓冲液:量取20mL的50 xTAE电泳缓冲液，加入去离子水定容至1L，室温保存。3. 2. 8 1%琼脂糖凝胶:称取1.0g琼脂糖，加入1xTAE电泳缓冲液100mL，轻轻泪匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至500C600C时，加EB溶液(终浓度O.5g/mU或5L核酸染料，摇匀后倒入制胶板中，厚度为3mm5 mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。3.2.9 DNA相对分子质量标准物Marker:DL 2000。3.2.10 10 x加样缓冲液:称取25g聚庶糖、0.1g 臭酣蓝、O.1 g二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至100 mL 3. 2. 11 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStep Prime ScriptlM盯PCRKi t CPerfect Real Time, TAKARA)，含有盯-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP泪合物，无RNA酶的水等。3.2.12 M-MLV反转录酶。3.2.13 RNA酶抑制剂。3.2. 14 TaqDNA聚合酶03.2.15 dNTPso 3.2.16 引物RT-PCR扩增引物，见表1;实时荧光定量盯PCR引物和探针，见表20引物名称DTMUV寻|物PlDTMUV寻|物P2引物名称DTMUV引物问DTMUV寻|物P4DTMUV探毛|4 操作步骤与结果判定4.1 样品采集与处理4. 1. 1 组织器官表1RT-PCR扩增引物号|物序列5-GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3 5 -AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA -3 表2实时荧光定量RT-PCR引物和探针引物序列(5了)AAGTCAGGCCAGGGAATCC CATGCACCCAGATTTGTTAACC FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 5. 1. 1. 1 用无菌摄子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官(肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等), 装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号。5. 1. 1.2 取待检组织样品适量(O.lg)，按1:5倍(W/W)加入无菌O.1M PH 7.4 PBS，于灭菌井烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融2次后，4 C, 3000 r/min离心5mi丑，取上清1mL转至无菌的1.5 mL离心管中液，编号备用。2 DB33/T 2247-2020 4.1.2 抗凝血、血清4. 1.2. 1 抗;疑血用无菌注射器直接吸取全血，加入含抗凝剂(除肝素外)的抗凝管中，充分混匀，编号备用。4.1.2.2 血清用无菌注射器直接吸取全血，自然凝固，3000 r/min离心5min，取上清液。4.1.3 咽挝子、ijI挝子用无菌棉签刮取家禽的日因音1日豆豆泄殖腔粘膜，放入含0.1M PH 7.4 PBS的离心管内。3000r/min离心5min，取上洁液，编号备用。4.1.4 样品保存制备样品在冷藏条件不宜超过4h，长期保存应放入一700C保存。4. 2 RNA 提取4.2.1 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为灭洁的鸭坦布苏病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染禽的组织，阴性对照为正常SPF鸡胚尿囊液或者正常禽组织。4. 2. 2按下列步骤完成RNA提取，也可采用商品化RNA试剂盒提取:a) 样品处理好后，在样品处理区，取n+2个1.5 mL DEPC处理过的灭菌离心营，其中n为待检样品数、1个阳性对照管和1个阴性对照管，对每个管进行编号标记:b) 取250L匀浆液，加入750LRNA提取试剂Trizol置入一个1.5 mL离心管，震荡数次，静置5min; c) 加入200L预冷的氯仿，震荡混匀，室温静置5min, 40C 12 000 r/min离心15min; d) 吸取上层水相至一新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置15mi丑，40C 12 000 r/min 离心15mi口，高，心后在离心管边不口底音可见有胶样RNA沉淀，弃上洁;e) 吸弃上洁，加入500L75%乙醇，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，清洗2次，rc 12 000 r/mi丑离心5min; f) 吸弃上洁，沉淀置室温条件下干燥后，加入20LDEPC处理水溶解:g) 提取的RNA应在2h内进行RI-PCR扩增;若需长期保存，需置于一700C冰箱保存。4.3 RT-PCR反应4.3.1 一步法RT-PCR4.3.1.1 RT-PCR反应体系设立阴性对照和阳性对照，按)11页序加入表3中的成分。表3一步法RT-PCR反应体系试剂体积2X一步法RT-PCR缓冲液12. 5口LDTMUV引物P1C20j.J mo1/U O. 5口LDTMUV号|物归。Oj.Jmo1/U O. 5口L3 DB33/T 2247-2020 表3(续试剂体积RNA提取液2.0 1-1 L 酶泪合液1. 0 1-1 L DEPC7l 8.5 1-1 L 4.3.1.2 反应条件反转录50C 30 min;预变性94C 2 min;扩增94C 30 s, 56 C 30 s, 72 C 30 s, 共30个循环。72C延伸10mino 4. 3. 2 两步法RT-PCR4.3.2.1 反转录取5LRNA提取液，加1LDTMUV引物P2，70C水浴5min;冰浴2min，继续加入表4中的成分，37C水浴1h，合成cDNA，取出直接进行PCR置20C保存。表4反转录反应体系试剂体积5X反转录反应缓冲液4 1-1 L O. 1 mo1/L DTT 2 1-1 L 2. 5 mmo1/L dNTPs 2 1-1 L M-MLV反转录酶O. 5 1-1 L RNA酶抑制剂O. .5口LDEPC水5口L4.3.2.2 PCR反应体系先加入去离子灭菌水，然后再护照顺序逐一加入表5中成分，每一次都应加入到液面以下。全部加完后，混匀，瞬时离心，吏液体沉降到PCR管底。表5PCR反应体系试剂体积反转录产物1. 25 1-1 L DTMUV引物P1(20口mo1/UO. 5 1-1 L DTMUV引物P2(20口mo1/Uo 5 1-1 L 10 X PCR Buffer 2.5 1-1 L 2.5 mmo1/L dNTPs 2L TaqDNA聚合酶O. 25口L灭菌去离子水18 1-1 L 4.3.2.3 反应条件4 DB33/T 2247-2020 预变性94C3 min;扩I曰94C30 s, 56C 30 s, 72C 30 s，循环30次72C延伸10min。4. 3. 3 电泳反应结束后，分别取5L各检测样品及阳性和阴性对照样品RT-PCR产物并与O.5L加样缓冲液(10X Loading buffer)混合，然后加入到1.0%琼脂糖凝胶板的加样孔中，随后加DNA分子量标准:以5V/cm 的电压进行电泳，30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果、拍照、记录。4.3.4结果要IJ走5.3.4.1 阳性对照扩增出567bp目的条带，且阴性对照无相应目的条带，判定试验成立，否则试验无效。5.3.4.2 被检测样品扩增出567bp目的条带，判定为阳性;未扩增出567bp目的条带，判定为阴性。4.4 实时荧光定量RT-PCR4.4.1 反应体系设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表6中的成分。全部加完后，轻轻吹打泪匀，500 r/min离心30s，使液体沉降到PCR管底。表6荧光定量RT-PCR体系试剂体积浓度2XOne St巳pRT-PCR BufferIII 10L 1X TlIA川剧ExTacfHS (5U/1) o. 4L 2U Prime Script RT EnzymeMix n o. 4L / 10l1M DTMUV引物P3O. 4L O. 2 11M 10J.llll DTMUV引物P4O. 4L O. 2 11M 50X ROX Ref巳renceDve O. 4L lX lOJ.lll, DTMUV探针O. 8L 0.4 J.llIl RNA提取;夜2L / 灭商去i驾云水5.2 J.lL / 4.4.2 反应条件反转录42C5min;预变性95C10 S;扩增9 5C变性5S; 58C延伸31s，共40个循环，58C 延伸时采集荧光信号。4.4.3 荧光素的设定Report Dye设定为FAM，Quencher Dye 设定为MGB或noneo4.4.4 结果判定4.4.4.1 阔值设定直接读取检测结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以间值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。5 DB33/T 2247-2020 4.4.4.2 质控标准阳性对照的Ct值30.0，且出现典型的扩增由线:阴性对照无Ct值，且无典型扩增由线。两者同时成立时判定试验有效，否则试验视为无效。4.4.4.3 结果描述及判定4.4.4.3. 1 阴性判定无Ct直并且无典型的扩增曲线，判为阴性。4.4.4.3.2 阳性判定:Ct直30，且出现典型的扩增曲线，判为阳性。4.4.4.3.3 可疑判定如果30Ct38，判为可疑。此时需重复扩增检测，如果重复检测出现典型的扩增由线且Ct豆38，判样本为阳性，否则判样本为阴性。6