冷冻电镜在生物医学中的应用.ppt

冷冻电镜在生物医学中的应用冷冻电镜在生物医学中的应用尹长城尹长城北京大学基础医学院生物物理学系北京大学基础医学院生物物理学系北京大学蛋白质科学中心北京大学蛋白质科学中心生物电子显微术的发展生物电子显微术的发展n1950s Hall,Huxley&Brener(Oxford)发明了发明了负负染技术染技术；研究了生物材料。；研究了生物材料。-分辨率分辨率2 nm.n1960s Klug(MRC-Cambridge)提出电子显微图提出电子显微图像的像的三维重构理论三维重构理论；解析了；解析了T4噬菌体的结构。噬菌体的结构。-1982 诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。n1970s Henderson&Uniwin(MRC-Cambridge)建立了建立了电子晶体学电子晶体学；解析了；解析了第一个膜蛋第一个膜蛋白白bacteriorhodopsin的结构。的结构。-分辨率分辨率0.7 nm.n1980s Adrian&Dubochet(EMBL)发明了快速冷发明了快速冷冻技术冻技术-冷冻电子显微术冷冻电子显微术诞生。诞生。-分辨率分辨率0.2 nm.Why high resolution?18 Proj./10 deg.18 Proj./10 deg.36 Proj./5 deg.36 Proj./5 deg.72 Proj./2.5 deg.72 Proj./2.5 deg.Why high resolution?传统样品包埋处理传统样品包埋处理-负染法负染法n用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构用重金属染料堆积在分子周围，反衬出分子结构n优点：衬度大，易于观察优点：衬度大，易于观察n缺点：缺点：n染料颗粒较大，不能渗入分子内部染料颗粒较大，不能渗入分子内部外部形貌，缺乏细节外部形貌，缺乏细节n样品脱水样品脱水分子变形，结构失真分子变形，结构失真n分辨率低，分辨率低，2 nm结构是低分辨的、失真的结构！结构是低分辨的、失真的结构！现代样品包埋处理现代样品包埋处理-冰冻法冰冻法n将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中将样品快速的冷冻在玻璃态的冰中n优点：优点：n样品含水样品含水天然状态天然状态n结构与在溶液中相同结构与在溶液中相同 真实结构真实结构n分辨率高，分辨率高，0.2 nm结构是高分辨的、保真的结构！结构是高分辨的、保真的结构！冰的物理状态冰的物理状态n冰可以多种物理状态存在冰可以多种物理状态存在n六角形冰六角形冰n立方体冰立方体冰n玻璃态冰玻璃态冰n玻璃态冰是一种无定形状态玻璃态冰是一种无定形状态保持生物分子的天然结构保持生物分子的天然结构提供生物分子所需的水分提供生物分子所需的水分n冰的物理状态与水的冷冻速率有关冰的物理状态与水的冷冻速率有关n在极高的冷冻速率（在极高的冷冻速率（104 C/s)，水形成玻璃态的，水形成玻璃态的冰冰冷冻电子显微术冷冻电子显微术（cryo-electron microscopy)n主要步骤主要步骤n样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态样品冷冻，将样品快速包埋在玻璃态冰中冰中n样品转移，将样品转移到液氮或液氦样品转移，将样品转移到液氮或液氦冷却的低温冷台中冷却的低温冷台中n样品观测及图像采集，在液氮或液氦样品观测及图像采集，在液氮或液氦温度进行温度进行n应用计算机进行图像处理和三维重构应用计算机进行图像处理和三维重构如何冷冻包埋样品？如何冷冻包埋样品？150 Why cryo-electron microscopy?classical negative stainingcryo-electron microscopyAdrian M,Dubochet J,et al.Nature(1984),308:32-36.冷冻包埋的质量控制ABCDA:分布不均分布不均B:样品污染样品污染C:理想样品理想样品1.分布均匀分布均匀2.没有重叠没有重叠3.厚度均一厚度均一D:厚度不均厚度不均电子剂量对图像质量的影响10e/220e/230e/240e/210e/220e/230e/240e/2电镜观测和记录电镜观测和记录n由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采由于样品在辐射下产生损伤，观测时须采用低剂量技术（用低剂量技术（low dose technique)n一般控制一般控制电子剂量电子剂量 20 e/2n低剂量技术低剂量技术n寻找寻找在低倍下进行在低倍下进行（1-3k）n聚焦聚焦在照像区域的相邻区域进行在照像区域的相邻区域进行（100-300k)n记录记录区域仅在照相时受到辐射区域仅在照相时受到辐射（30-60k)Low-dose techniqueFocus area 1Focus area 1Focus Focus angleangleTilt axisTilt axisFocus area 2Focus area 2Focus distanceFocus distanceSearch modeexposure mode电镜与图像三维重构电镜与图像三维重构Electron MicroscopyWhy do we need 3D information?3D objectprojection2D photoDrawing by John OBrien,The New Yorker Magazine(1991)三维图像重构三维图像重构n在电镜下观察样品时，所看到的是样品在电镜下观察样品时，所看到的是样品在垂直于电子束方向的投影（二维信息）在垂直于电子束方向的投影（二维信息）n要得到样品的三维结构，须将投影信息要得到样品的三维结构，须将投影信息（二维信息）转变为三维信息（二维信息）转变为三维信息n将二维信息组合得到三维信息并得到三将二维信息组合得到三维信息并得到三维结构的过程称为三维图像重构维结构的过程称为三维图像重构三维重构基本原理三维重构基本原理-中央截面定理中央截面定理n三维函数投影的傅立叶变换三维函数投影的傅立叶变换(Fourier transform)等于该三维函数傅立叶变换等于该三维函数傅立叶变换在垂直于投影方向的中央截面在垂直于投影方向的中央截面在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅在电镜下，物体沿电子束方向投影的傅立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂立叶变换是该物体三维傅立叶变换在垂直于电子束方向的中央截面直于电子束方向的中央截面The principle of 3D reconstruction三维物体三维物体二维投影二维投影二维投影的二维投影的傅立叶变换傅立叶变换三维傅立叶变换三维傅立叶变换三维结构三维结构逆傅立叶变换逆傅立叶变换 Klug A,De Rosier DJ.Nature(1966),212:29-32.The effect of sampling18 Proj./10 deg.18 Proj./10 deg.36 Proj./5 deg.36 Proj./5 deg.72 Proj./2.5 deg.72 Proj./2.5 deg.2-D 晶体晶体分子溶液分子溶液单一结构单一结构电镜三维重构的方法电镜三维重构的方法生物电镜三维重构方法生物电镜三维重构方法方法方法研究对象研究对象 对象特点对象特点 分辨率分辨率电子晶体学电子晶体学 1.二维晶体二维晶体 周期排列周期排列 0.19 nm 2.管状晶体管状晶体 0.40 nm单颗粒技术单颗粒技术 1.病毒病毒 全同粒子全同粒子 0.33 nm 2.大分子复合体大分子复合体 0.40 nm断层成像术断层成像术 1.细胞器细胞器/细胞细胞 单一结构单一结构 4.0 nm 2.组织切片组织切片冷冻电镜在生物医学中的应用冷冻电镜在生物医学中的应用乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体(AchR)通道通道n已知：已知：n配体门控通道（乙酰胆碱）配体门控通道（乙酰胆碱）n由由5个亚基组成个亚基组成（）n5个亚基围成一个孔（通道）个亚基围成一个孔（通道）n每个亚基含每个亚基含4个个-螺旋螺旋（M1-M4)nM2与形成通道有关与形成通道有关n配基（乙酰胆碱）结合部位位于配基（乙酰胆碱）结合部位位于 亚基上亚基上n未知：未知：n为什么为什么AchR是一个阳离子通道？是一个阳离子通道？n为什么为什么M2与形成通道有关？与形成通道有关？n通道的门控机制是什么？通道的门控机制是什么？乙酰胆碱的突触间隙释放乙酰胆碱的突触间隙释放与实验模拟与实验模拟AchR的三维结构的三维结构(Unwin,Nature 423,949,2003)Side viewTop viewTransmembrane AchR通道门的结构通道门的结构(Unwin,MRC-Cambridge)negativehydrophobicM2AchR通道门的结构通道门的结构(Unwin,MRC-Cambridge)n孔道的门由疏水性氨基孔道的门由疏水性氨基酸形成，直径酸形成，直径8水化离子可以通过水化离子可以通过n门由亚基之间疏水相互门由亚基之间疏水相互作用锁住作用锁住门开放时需打断门开放时需打断n通道入口含带负电的氨通道入口含带负电的氨基酸，形成阳离子选择基酸，形成阳离子选择性滤器性滤器AchR是一个阳离子是一个阳离子通道通道 +AchShut open -AchAchR的门控机制的门控机制(Unwin,Nature 373:37,1995)Side viewTop viewBlue:-AchWhite:+AchBrcena M.et.al.PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of SciencesStructural model of the coronavirion based on tomogramsBrcena M.et.al.PNAS 2009;106:582-5872009 by National Academy of SciencesHIV对宿主的感染机制对宿主的感染机制J Liu et al.Nature 000,1-5(2008)doi:10.1038/nature07159=spikesJ Liu et al.Nature 000,1-5(2008)doi:10.1038/nature07159Conformational change in the gp120 trimerinduced by CD4 bindingHarris A.et.al.PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesDistributions of HA and NA spikes on H3N2 influenza virusHarris A.et.al.PNAS 2006;103:19123-191272006 by National Academy of SciencesHA=neuraminidaseNA=ribonucleaprotein戊型肝炎病毒的结构戊型肝炎病毒的结构(PNAS，106:12992-12997，2009)戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结构戊型肝炎病毒衣壳蛋白的结构(PNAS，106:12992-12997，2009)ConclusionnStructure can tell us how a molecular machine assembles(HEV&Flu)nStructure can tell us how a molecular machine works(nAchR)nStructure can tell us the mechanism of a biological process(HIV)The Nobel Prize in Chemistry 2009Venkatraman Ramakrishnan 1/3 of the prize MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United KingdomThomas A.Steitz 1/3 of the prize Yale University New Haven,CT,USAAda E.Yonath1/3 of the prize Weizmann Institute of Science Rehovot,Israelfor studies of the structure and function of the ribosome北京大学冷冻电镜北京大学冷冻电镜v国际先进水平国际先进水平300kV场发射电子源场发射电子源穿透力强（穿透力强（m)分辨率高（分辨率高（nm）v配备齐全配备齐全计算机控制计算机控制自动化、高效率自动化、高效率冷冻制样装置冷冻制样装置样品制备样品制备4k 4k CCD图像采集图像采集能量过滤器能量过滤器降低噪音降低噪音三维重构软件三维重构软件图像处理图像处理三维重构三维重构欢迎合作！